謝　旖，周　煜，黃衛(wèi)梅，田亞南，文利新，鄔　靜

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128)

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豬孕烷X受體基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

謝旖，周煜，黃衛(wèi)梅，田亞南*，文利新，鄔靜

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128)

摘要：為構(gòu)建豬的孕烷X受體(PXR)基因真核表達(dá)質(zhì)粒，用RT-PCR技術(shù)從新鮮豬肝中擴(kuò)增到豬孕烷X受體(pgPXR)基因，將其連接到真核表達(dá)載體pCI-neo 中，得到重組質(zhì)粒pCI-pgPXR。對該重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、測序及酶切鑒定后，采用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞，用RT-PCR和雙熒光素酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，豬孕烷X受體基因真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-pgPXR構(gòu)建成功，可在HepG2細(xì)胞中表達(dá)，為豬孕烷X受體的藥理學(xué)和毒理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：孕烷X受體；質(zhì)粒構(gòu)建；真核表達(dá)

孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)為核受體超家族NRl Ⅰ亞家族成員，由Kliewer S A等[1]于1998年首次發(fā)現(xiàn)。PXR是一類配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子，通過與位于某些基因上游的特異性PXR反應(yīng)元件結(jié)合而調(diào)控基因表達(dá)[2-3]。

PXR的配體結(jié)合域(ligand binding domain,LBD)具有明顯的種屬差異，人和小鼠的LBD氨基酸序列僅80%相同，LBD序列的差異導(dǎo)致不同種屬之間PXR配體激活的差異性。豬PXR(pgPXR)與人類PXR(hPXR)在蛋白序列上具有85%的同源性和95%的相似性，在配體結(jié)合上也具有較高的相似性，有研究發(fā)現(xiàn)pgPXR能被hPXR激動(dòng)劑利福平(Rif)和貫葉金絲桃素激活，這表明豬可能是研究人類藥物學(xué)和毒理學(xué)的最適當(dāng)模型[4-5]。PXR與配體結(jié)合后能高效地參與調(diào)控異生代謝，在生理和病理過程中也起著重要作用，如炎癥反應(yīng)[6-7]。本試驗(yàn)旨在構(gòu)建pgPXR的真核表達(dá)質(zhì)粒并通過熒光素酶檢測系統(tǒng)鑒定基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況，為pgPXR的研究及其激活劑的高通量篩選奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株pGL-3A4-Luc報(bào)告質(zhì)粒(圖1)和pCI-neo真核表達(dá)質(zhì)粒由美國德克薩斯農(nóng)工大學(xué)贈(zèng)予；DH5α菌株和HepG2細(xì)胞系均由動(dòng)物毒物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1　pGL-3A4-Luc質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

1.1.2主要試劑EcoRⅠ、SalⅠ 、TaqDNA 聚合酶 、T4 DNA 連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒及凝膠回收試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品；Lipofectine 2000和Trizol，美國Invitrogen 公司產(chǎn)品；RevertAidTM第1鏈cDNA合成試劑盒，Thermo scientific公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基，Hycolone公司產(chǎn)品；DNA 凝膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒，Qiagen公司產(chǎn)品 ；雙熒光素酶檢測試劑盒，Promega公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上的pgPXR序列(NM-001038005)，應(yīng)用Premier6.0軟件設(shè)計(jì)并合成引物，引物5′端分別添加了EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用于pgPXR基因的擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增大小1 266 bp。引物序列如下：

FP:5′-GCGGAATTCGCCACCATGCAATGCAATGAAACAGACTCCA-3′；

RP:5′-GCGGTCGACTCAGCTTTCTGTGA- TGCTGAATAAC-3′。

1.2.2pgPXR基因的克隆從新鮮豬肝中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增目的序列，反應(yīng)體系20 μL；PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min;94 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min;共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.3重組質(zhì)粒pCI-pgPXR的構(gòu)建及鑒定EcoRⅠ和SalⅠ 酶切pCI-neo與PCR擴(kuò)增純化的目的片段pgPXR(約為1 266 bp處的條帶)，酶切產(chǎn)物純化后37 ℃過夜連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，Amp抗性篩選后提取質(zhì)粒，PCR、酶切和測序鑒定正確后命名為pCI-pgPXR，大量制備與純化，測定質(zhì)粒濃度，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.4 脂質(zhì)體LipofectineTM 2000 介導(dǎo)的DNA 轉(zhuǎn)染和RT-PCR檢測將構(gòu)建的pCI-pgPXR重組質(zhì)粒同pGL-3A4-Luc報(bào)告質(zhì)粒一起用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染5 h后用PXR誘導(dǎo)劑Rif(終濃度為5 μmol/L)處理細(xì)胞，培養(yǎng)48 h～72 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR檢測。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測HepG2細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%匯合時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。設(shè)pCI-neo空載體，pGL-3A4-Luc報(bào)告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染和pGL-3A4-Luc報(bào)告質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染為陰性對照(表1)，轉(zhuǎn)染5 h后加入Rif(終濃度為5 μmol/L)，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測。

表1　轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分組

2　結(jié)果

2.1pgPXR基因的克隆與鑒定

按照1.2.1的方法將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 266 bp處可見明顯擴(kuò)增條帶(圖2)，結(jié)果與預(yù)期相符，表明成功獲得目的序列。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；A～C.pgPXR PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;D.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；A-C.PCR products of pgPXR; D.Negative control

圖2 pgPXR的PCR擴(kuò)增

Fig.2PCR amplication of pgPXR gene

2.2重組質(zhì)粒pCI-pgPXR的鑒定

菌液送至公司測序，測序結(jié)果顯示，成功獲得pgPXR編碼序列(圖3)；按照1.2.2的方法對初步篩選為陽性的重組質(zhì)粒用SalⅠ 和EcoRⅠ雙酶切得到約5 454 bp和1 266 bp的2個(gè)片段(圖4)，酶切結(jié)果與預(yù)期相符，表明目的基因正確插入到真核表達(dá)載體pCI-neo上，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3RT-PCR檢測

轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，表達(dá)質(zhì)粒pCI-pgPXR轉(zhuǎn)染細(xì)胞組可見大小約為1 300 bp的條帶，大小與目的基因相符，而pCI-neo空載體，pGL-3A4-Luc報(bào)告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞和pGL-3A4-Luc報(bào)告質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組均無反應(yīng)條帶，表明所轉(zhuǎn)染的目的基因在HepG2細(xì)胞中得到有效轉(zhuǎn)錄(圖5)。

圖3　pCI-pgPXR質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；A.pCI-pgPXR/SalⅠ、EcoRⅠ雙酶切；B.pCI-pgPXR

M.DNA Marker DL 5 000；A.pCI-pgPXR/SalⅠ andEcoRⅠ enzyme digestion；B.pCI-pgPXR

圖4重組質(zhì)粒pCI-pgPXR的酶切鑒定

Fig.4Identification of recombinant plasmid pCI-pgPXR by enzyme digestion

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； A.pCI-pgPXR重組質(zhì)粒與pGL-3A4-Luc報(bào)告質(zhì)粒組RT-PCR產(chǎn)物；B.pCI-neo與pGL-3A4-Luc報(bào)告質(zhì)粒對照組RT-PCR 產(chǎn)物；C.pGL-3A4-Luc報(bào)告質(zhì)粒對照組RT-PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；A.RT-PCR products of pCI-pgPXR and pGL-3A4-Luc；B.RT-PCR products of pCI-neo and pGL-3A4-Luc；C.RT-PCR products of pGL-3A4-Luc

圖5重組質(zhì)粒pCI-pgPXR在HepG2的RT-PCR檢測

Fig.5RT-PCR of recombinant plasmid pCI-pgPXR in HepG2

2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞雙熒光素酶活性檢測

3個(gè)組的細(xì)胞在加入Rif 48 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測，pCI-pgPXR與pGL-3A4-Luc共轉(zhuǎn)細(xì)胞的熒光比值明顯高于其他2個(gè)組，證明pCI-pgPXR成功轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞，并在HepG2細(xì)胞內(nèi)獲得短暫表達(dá)，Rif激活pgPXR對CYP3A4的誘導(dǎo)作用，使熒光素酶活性增強(qiáng)(圖6)。

“*”表示差異顯著(P<0.05)

" * " means significant difference(P<0.05)

圖6熒光素酶活性檢測

Fig.6Detection of luciferase activity

3　討論

飼料中添加抗生素能促進(jìn)動(dòng)物生長、生產(chǎn)、預(yù)防動(dòng)物疾病的能力，但抗生素在給人們帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也將帶來負(fù)面影響，如藥物殘留問題。天然活性物質(zhì)能增強(qiáng)動(dòng)物免疫、促生長、抗氧化、改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，且無(低)殘留，不易產(chǎn)生耐藥性。

細(xì)胞色素酶(CYP)是Ⅰ相代謝酶，參與體內(nèi)外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，也是藥物代謝的關(guān)鍵酶，而利福平作為pgPXR的強(qiáng)效激動(dòng)劑可激活細(xì)胞內(nèi)的pgPXR、pgPXR與RXR結(jié)合形成異源二聚體后隨即與CYP基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控序列中特異性的應(yīng)答元件結(jié)合，使其調(diào)控CYP酶(如CYP1A1、CYP1B1、CYP3A29 等)的表達(dá)，從而參與外源性和內(nèi)源性化合物的代謝[8-9]。先前對藥物代謝的研究主要用人孕烷X受體作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚10-11]，而pgPXR基因與真核表達(dá)載體的構(gòu)建為篩選可在豬體內(nèi)激活pgPXR，并增加相關(guān)藥物代謝酶活性的化合物提供可能。研究表明，pgPXR除參與藥物代謝外，在類固醇激素代謝和血腦屏障功能的調(diào)節(jié)等方面也都發(fā)揮重要作用[12-13]，pgPXR天然活性物質(zhì)作為飼料添加劑可能會(huì)提高動(dòng)物免疫和抗炎能力，改善動(dòng)物的營養(yǎng)與健康。因此，對pgPXR天然活性物質(zhì)的篩選是未來研究的重點(diǎn)。

基于以上目的，我們構(gòu)建pgPXR的重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，被利福平作用后轉(zhuǎn)錄激活呈現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)，試驗(yàn)中pgPXR mRNA的表達(dá)與PGL-3A4-Luc報(bào)告基因的誘導(dǎo)保持一致，表明pgPXR的熒光素酶檢測系統(tǒng)構(gòu)建成功，這為今后pgPXR天然活性物質(zhì)的篩選研究奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2015-11-07

作者簡介：謝旖(1991-)，女，湖南益陽人，碩士，主要從事動(dòng)物非傳染性群發(fā)病與動(dòng)物保健研究。*通訊作者

中圖分類號:S858.28；Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)07-0017-04

Construction and Expression of Eukaryotic Vector of Pig Pregnane X Receptor Gene

XIE Yi,ZHOU Yu,HUANG Wei-mei,TIAN Ya-nan,WEN Li-xin,WU Jing

(CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan,410128,China)

Abstract:To construct the pig pregnane X receptor (pgPXR) in eukaryotic expression plasmid,RNA was extracted from fresh pig liver,the pgPXR genes were amplified by reverse transcription and PCR technology.PgPXR was inserted to pCI-neo plasmid to get the recombinant plasmid pCI-pgPXR.After PCR,by sequencing and enzyme digestion to confirm its right plasmid,the recombinant plasmid pCI-pgPXR was transfected into human hepatoma HepG2 cells by using liposomes.The recombinant plasmid then was identified by RT-PCR and dual luciferase assay system.The results showed that the eukaryotic expression plasmid pCI-pgPXR was constructed successfully,which could be expressed in HepG2 cells.Therefore this study laid the foundation for the pharmacology and toxicology of pgPXR.

Key words:pregnane X receptor；plasmid construction；eukaryotic expression