周佳 孫嘉茵 李宇茜 唐維英 徐小平

摘 要：采用同位素內(nèi)標(biāo)定量，建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定各種肉制品N-二甲基亞硝胺的GC-MS/MS法。樣品中加入D6-N-二甲基亞硝胺內(nèi)標(biāo)，經(jīng)水蒸氣蒸餾、二氯甲烷提取、分離、濃縮，用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)樣分析。色譜柱為HP-Innowax毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），氦氣為載氣，氮?dú)鉃榕鲎矚?，流量?.4 mL/min。結(jié)果表明：該方法檢測(cè)范圍在10～300 ng/mL內(nèi)，線性關(guān)系良好y=77.16x-500.16（r2=0.999 6），精密度RSD為2.36%；回收率為82.9%～99.5%，檢出限0.2 μg/kg。對(duì)4種不同來(lái)源的肉制品共40批次進(jìn)行檢測(cè)，檢出13批次，但均未超過(guò)限量（3 μg/kg）。該方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測(cè)的好方法。

關(guān)鍵詞：N-二甲基亞硝胺；同位素內(nèi)標(biāo)；GC-MS/MS；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；優(yōu)化

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2016）09-0046-04

0 引 言

N-二甲基亞硝胺是一種很強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)，有40多種動(dòng)物包括靈長(zhǎng)類易于感染N-亞硝胺引起癌變[1-2]，肉制品中大多會(huì)添加護(hù)色劑亞硝酸鈉，現(xiàn)未找到合適的替代物，而亞硝酸鹽在制作肉過(guò)程中很容易和次級(jí)胺類物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生致癌物質(zhì)N-亞硝胺類物質(zhì)，一次攝入過(guò)多會(huì)損傷肝臟和破壞血小板，出現(xiàn)嚴(yán)重的急性中毒癥狀，長(zhǎng)期食用會(huì)導(dǎo)致肝硬化，新鮮的肉一般不含N-亞硝胺，而腌制、鹵制的肉常常含有N-亞硝胺[3-5]，又以N-二甲基亞硝胺檢出率最高[6]，一般會(huì)對(duì)肝、腎、肺產(chǎn)生致癌性作用，在培根、腌肉、香腸等肉制品中經(jīng)常被檢出，國(guó)家對(duì)肉制品中N-二甲基亞硝胺的限量是3.0 μg/kg[7]，所以建立高靈敏度，高準(zhǔn)確性，低檢出限的方法很有必要。前處理方面，筆者發(fā)現(xiàn)由于N-二甲基亞硝胺具有半揮發(fā)性，濃縮時(shí)很容易損失，嘗試加入同位素內(nèi)標(biāo)D6-N-二甲基亞硝胺，使定量更加準(zhǔn)確；檢測(cè)方式方面，目前有關(guān)N-亞硝胺的檢測(cè)方法主要有GC-MS選擇離子掃描模式（SIM）測(cè)定[8-11]，現(xiàn)在國(guó)標(biāo)方法[12]第一法所提及的氣相-熱能分析儀不普及，很多實(shí)驗(yàn)室不適用，筆者曾用SIM進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)干擾太大，常出現(xiàn)樣品中加入標(biāo)液卻無(wú)法定性的情況，準(zhǔn)確度極差，本實(shí)驗(yàn)在這個(gè)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，采用GC-MS/MS同位素內(nèi)標(biāo)法多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)肉制品中N-二甲基亞硝胺，基質(zhì)干擾小，能有效地對(duì)目標(biāo)物定性定量，靈敏度高。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

Aglilent 7890A-7000B氣相色譜-質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫儀器公司）；色譜柱：HP-Innowax毛細(xì)管柱30 m×0.32 mm，0.25 μm[12]（美國(guó)安捷倫儀器公司）；電子天平（Sartorius，CPA 225D），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi，R-215）；漩渦振蕩器（IKA，MS3digital）；超聲清洗機(jī)（Auto science，AS5150B）；高速離心機(jī)（Eppendorf，Centrifuge 5810R）。

1.2 試 劑

二氯甲烷（色譜級(jí)）、氯化鈉、硫酸、超純水；N-二甲基亞硝胺標(biāo)液（Accustandard：Lot：214071210；濃度：100.8 μg/mL）；D6-N-二甲基亞硝胺（CDN ISOTOPE Lot：X323P9，純度：99.5%），硫酸溶液：90 mL超純水，緩慢加入30 mL濃硫酸，混勻，放至室溫，即得。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取N-二甲基亞硝胺標(biāo)液0.1 mL，置于10 mL棕色量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，搖勻，即得（質(zhì)量濃度為1.008 μg/mL）。D6-N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密稱取D6-N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品10.14 mg，置于50 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，得D6-N-二甲基亞硝胺儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度約為0.2 mg/mL，4 ℃以下保存，3個(gè)月內(nèi)使用）；精密量取上述儲(chǔ)備液100 μL，置10 mL量瓶中，二氯甲烷稀釋并定容至刻度，搖勻，得內(nèi)標(biāo)使用液（2 μg/mL，4 ℃以下保存，1周內(nèi)使用）。

1.4 色譜條件

1.4.1 GC條件

進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：2 μL，進(jìn)樣方式：不分流；載氣：高純氦氣，流量：1.4 mL/min；升溫程序：50 ℃保持4 min，以10 ℃/min升至160 ℃，270 ℃后運(yùn)行3 min。

1.4.2 MS/MS條件

電離方式為電子轟擊電離（EI），電離能量為70 eV； 離子源溫度：230 ℃；接口溫度：280 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；碰撞氣：氮?dú)猓蝗軇┭舆t時(shí)間：5 min；掃描模式：MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)），定量離子m/z（質(zhì)荷比）74>44，定性離子m/z 74>42；內(nèi)標(biāo)定量離子m/z 80>50；碰撞能量：m/z 74>44為5 V，m/z 74>42為20 V；m/z 80>50為10 V。

1）用Scan模式確認(rèn)

N-二甲基亞硝胺的保留時(shí)間及質(zhì)譜圖相關(guān)信息（見圖1、圖2），圖中可以確認(rèn)N-二甲基亞硝胺的保留時(shí)間為8 min。

2）離子篩選及MRM模式電壓的選擇

在Product ion模式下固定m/z 74的母離子，分別用5，10，20，30 V電壓進(jìn)行碰撞，由于N-二甲基亞硝胺的分子量較小m/z 74，可以選擇的碎片離子不多，有44、43、42、30，考慮到30分子量太小，容易受干擾，沒有再優(yōu)化，如圖3所示。

在MRM模式下分別選用電壓5，10，20，30 V對(duì)m/z 74>44、m/z 74>42、m/z 74>43進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)m/z 74>43響應(yīng)比較低，并且旁邊易出現(xiàn)干擾峰（如圖4所示），最終選定m/z 74>44和m/z 74>42，同時(shí)也選擇了m/z 74>44為5 V，m/z 74>42為20 V，m/z 74>44響應(yīng)較m/z 74>42高，m/z 74>44為定量離子，響應(yīng)好、干擾小。

1.5 樣品的預(yù)處理

取樣品約50 g，精密稱定，加入內(nèi)標(biāo)使用液100 μL，使與樣品混勻，置于水蒸氣蒸餾裝置中，加入50 mL水，搖勻，在蒸餾瓶中加入60 g氯化鈉，充分搖動(dòng)使氯化鈉溶解，將蒸餾瓶與水蒸氣發(fā)生器及冷凝管連接好，在錐形瓶中加入30 mL二氯甲烷及少量冰塊，收集約200 mL的餾出液，在錐形接收瓶中加入40 g氯化鈉和3 mL硫酸溶液，攪拌，使氯化鈉全部溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，振搖提取，靜置分層，分取二氯甲烷層，40 ℃以下旋轉(zhuǎn)至近干，用二氯甲烷轉(zhuǎn)移并定容至1 mL。

1.6 方法評(píng)價(jià)

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別量取濃度約為1 μg/mL的N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（10，30，50，100，150，200，300 μL）及內(nèi)標(biāo)使用液各100 μL，加二氯甲烷配制成濃度分別為10.08，30.24，50.4，100.8，151.2，201.6，302.4 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

將制備好的N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液分別注入GC-MS/MS，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，以N-二甲基亞硝胺得濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=77.16x-500.16（r2=0.999 6），結(jié)果表明N-二甲基亞硝胺濃度在10～300 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，如圖5所示。

1.6.2 方法精密度試驗(yàn)

用該方法對(duì)同一樣品進(jìn)行反復(fù)測(cè)定（n=6），考察含量的精密度，RSD為2.36%，結(jié)果符合精密度要求，如表1所示。

1.6.3 準(zhǔn)確度考察

稱取空白樣品6份，進(jìn)行3個(gè)濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn)，分別加入N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.008 μg/mL）30，100，150 μL，形成低中高單個(gè)濃度，測(cè)定計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示。

1.6.4 檢出限

稱取空白樣品50 g，置于水蒸氣蒸餾裝置的蒸餾瓶中，加入N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)使用液（1.008 μg/mL）10 μL及內(nèi)標(biāo)使用液100 μL，使與樣品混勻，加入水50 mL，混合均勻，加入氯化鈉60 g，照1.4樣品處理操作，制備檢出限工作液，注入GC-MS/MS，測(cè)得信噪比，按S/N=3∶1計(jì)算，折算N-二甲基亞硝胺檢出限為0.2 μg/kg。（檢出限（μg/kg）=檢出限工作液濃度（ng/mL）×稀釋體積（mL）/取樣量（g）×3/測(cè)得信噪比×1 000/1 000）。

1.7 專屬性

分別注射空白基質(zhì)溶液和對(duì)照品溶液，N-二甲基亞硝胺保留均較好，空白基質(zhì)未見干擾，對(duì)照品與溶劑空白反復(fù)進(jìn)樣也未見交叉污染，專屬性較好，如圖6所示。

1.8 測(cè) 定

將樣品測(cè)定液注入GC-MS/MS得到峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)得濃度（ng/mL），根據(jù)稀釋倍數(shù)和稱樣量可與算出樣品得含量（μg/kg），結(jié)果如表3所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的選擇

考慮到食品基質(zhì)復(fù)雜，為得到準(zhǔn)確的結(jié)果，選取4種不同來(lái)源肉制品（包括豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉），采取不同的提取方式，考察溶劑提取和蒸餾提取，用二氯甲烷溶劑超聲提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于肉制品（如豬肉）脂肪含量可以達(dá)到90%以上，在濃縮時(shí)，提取液會(huì)出現(xiàn)一塊塊固狀的油脂，實(shí)驗(yàn)無(wú)法繼續(xù)，本實(shí)驗(yàn)采用水蒸汽蒸餾方式，油脂、蛋白質(zhì)無(wú)法隨目標(biāo)物蒸餾出來(lái)，能夠獲得理想的提取效果。

2.2 肉制品中N-二甲基亞硝胺的檢測(cè)常見問(wèn)題與采用GC-MS/MS檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

曾用單氣質(zhì)SIM模式進(jìn)行測(cè)定，由于N-二甲基亞硝胺的分子量（74）太小，容易受多種分子離子干擾，食品基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)特別明顯，常常出現(xiàn)加入標(biāo)準(zhǔn)液卻定性不了，造成定性上的誤差，用GC-MS/MS的MRM模式，排除了基質(zhì)帶來(lái)的干擾，靈敏度更高。

2.3 采用內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)勢(shì)

在進(jìn)行前處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)樣品濃縮及液液萃取過(guò)程很容易使目標(biāo)物流失，采用D6-NDMA標(biāo)準(zhǔn)品為內(nèi)標(biāo)，選取內(nèi)標(biāo)定量離子m/z 80>50，可減少外標(biāo)法對(duì)回收率的影響，使目標(biāo)物定量更加準(zhǔn)確。

2.4 樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)4中不同來(lái)源基質(zhì)樣品（包括豬肉制品20批次、牛肉制品10批次、雞肉制品5批次、鴨肉制品5批次）共40批進(jìn)行分析，檢測(cè)含有NDMA 13批次，含量在0～1 μg/kg之間，均未超過(guò)國(guó)家規(guī)定的限量3.0 μg/kg。

3 結(jié)束語(yǔ)

NDMA食品安全限度值比較低，為了達(dá)到檢測(cè)目的，樣品取樣量大，本方法保留國(guó)標(biāo)中水蒸汽蒸餾法進(jìn)行前處理，表面上效率比較低，但是由于樣品取樣量大，肉制品基質(zhì)復(fù)雜，簡(jiǎn)單的有機(jī)溶劑提取不太現(xiàn)實(shí)，后期凈化壓力極大，而采用水蒸汽蒸餾能有效除去大部分的雜質(zhì)，并且對(duì)環(huán)境影響較小，對(duì)操作人員友好。本法采用水蒸汽蒸餾，同位素標(biāo)記，建立GC-MS/MS檢測(cè)N-二甲基亞硝胺的新方法，結(jié)果表明，N-二甲基亞硝胺可通過(guò)GC-MS/MS的MRM模式，以同位素內(nèi)標(biāo)法被快速、靈敏的良好分離檢測(cè)，是肉制品中N-二甲基亞硝胺高效檢測(cè)的較好方法，可適用于日常食用肉制品的質(zhì)量監(jiān)控，提高人們的食肉安全性。

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（編輯：徐柳）