趙艷艷，王晨霏，滕洋

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

山茱萸環(huán)烯醚萜總苷提取工藝

趙艷艷，王晨霏，滕洋

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

為了研究山茱萸中環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物的最佳提取工藝，以陜西省商洛市丹鳳縣產(chǎn)的山茱萸為原料，以環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物的提取率（按藥材計(jì)算）為指標(biāo)，考察提取溶劑、溶劑濃度、料液比、提取時(shí)間四個(gè)因素對(duì)環(huán)烯醚萜提取率的影響，進(jìn)行工藝優(yōu)化。確定的提取溶劑為甲醇，提取劑濃度為80%，料液比為1∶15，提取時(shí)間為100 min，提取率約為18.7%。此提取工藝和提取方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可為山茱萸藥材的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

山茱萸；環(huán)烯醚萜總苷；提取

環(huán)烯醚萜苷（iridoids）是一類(lèi)廣泛存在于植物界的化合物，大量分布于龍膽科、唇形科、玄參科、馬鞭草科等雙子葉植物中［1］。環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物苷元結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可修飾性強(qiáng)，生物活性廣泛［2-3］。研究表明環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物分子量較小，因具有極性官能團(tuán)導(dǎo)致其易溶于水、甲醇；可溶于乙醇、丙酮、正丁醇；難溶于乙醚、苯等親脂性溶劑［4-5］。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷的提取方法主要有水浸提、甲醇回流提取、大孔樹(shù)脂純化、乙醚脫脂-甲醇回流法等［6-8］。環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物在中藥中分布較廣，目前已發(fā)現(xiàn)一千余種。從山茱萸中提取、分離和鑒定的環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物已有16個(gè)，分別屬于3種類(lèi)型：環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜、裂環(huán)環(huán)烯醚萜類(lèi)以及雙環(huán)烯醚萜類(lèi)［9］。近年來(lái)大量山茱萸藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究結(jié)果表明，山茱萸的藥理作用和保健活性物質(zhì)基礎(chǔ)主要是環(huán)烯醚萜苷類(lèi)中的莫諾苷和馬錢(qián)苷，能夠抗炎、抗腫瘤等，并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用［10-11］。山茱萸環(huán)烯醚萜作為山茱萸中的主要有效成分，已越來(lái)越受到重視，尤其在保護(hù)神經(jīng)以及治療糖尿病及其并發(fā)癥方面表現(xiàn)出顯著作用，有極高的研究和應(yīng)用潛能。本研究對(duì)山茱萸環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期得到一條提取率高、能耗低、污染小、經(jīng)濟(jì)方便的提取工藝路線。

1　材料與方法

1.1儀器與藥品

儀器：電子天平、超純水制備儀、HH-6型電熱恒溫水浴鍋（上海康華生化儀器制造廠）、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（北京科偉永興儀器有限公司）。

藥品：山茱萸（陜西省商洛市丹鳳縣）；無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)）；甲醇（國(guó)藥集團(tuán)）；三氯甲烷（國(guó)藥集團(tuán)）；冰醋酸（國(guó)藥集團(tuán)）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1藥材前處理

取山茱萸原料適量，8倍水浸泡過(guò)夜，過(guò)濾，95%乙醇浸泡，過(guò)濾，干燥后粉碎過(guò)200目篩待用。

1.2.2環(huán)烯醚萜苷的提取

1）不同種類(lèi)溶劑提取山茱萸中環(huán)烯醚萜總苷

精密稱(chēng)定3份，每份10 g的山茱萸粉末，分別用水，100%甲醇，100%乙醇提取，料液比為1：15，80℃提取，冷凝回流提取3次，每次2 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到粗浸膏，計(jì)算粗浸膏得率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定提取溶劑。

2）不同濃度溶劑提取山茱萸環(huán)烯醚萜總苷

精密稱(chēng)定6份山茱萸粉末，每份10 g，用所確定的溶劑提取，料液比為1：15，溶劑濃度分別為50%，60%，70%，80%，90%，100%，80℃提取，冷凝回流提取3次，每次2 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到粗浸膏，計(jì)算粗浸膏得率，確定溶劑濃度。

3）不同料液比提取山茱萸中環(huán)烯醚萜總苷

精密稱(chēng)定5份山茱萸粉末，每份10 g，用所確定的溶劑和濃度，將按照料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，80℃提取，冷凝回流提取3次，每次2 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到粗浸膏，計(jì)算粗浸膏得率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定料液比。

4）不同提取時(shí)間提取山茱萸中環(huán)烯醚萜總苷

精密稱(chēng)定5份山茱萸粉末，每份10 g，分別按照所確定的溶劑、濃度、料液比提取，提取時(shí)間分別為30、60、80、100、120 min，在80℃下冷凝回流提取3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到粗浸膏，計(jì)算粗浸膏得率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定提取時(shí)間。

1.2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)條件下，選擇最佳提取溶劑、最佳濃度、最佳料液比和最佳提取時(shí)間，分別進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，計(jì)算提取率，并對(duì)優(yōu)化后的條件進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4山茱萸中環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物的鑒別

將提取得到的環(huán)烯醚萜浸膏，放入燒杯中，加80%的乙醇溶解，利用多糖不溶于高濃度醇的特點(diǎn)，使糖析出，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再加80%乙醇除糖，反復(fù)多次，得到除糖后的山茱萸環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物。以V（氯仿）：V（甲醇）：V（冰乙酸）=3：1：0.01為展開(kāi)劑，取莫諾苷和馬錢(qián)苷為對(duì)照品，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，鑒別山茱萸環(huán)烯醚萜總苷。

2　結(jié)果與分析

2.1不同提取溶劑對(duì)山茱萸中環(huán)烯醚萜總苷出膏率的影響

采用冷凝回流提取山茱萸中環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物，根據(jù)相似相溶原理，提取溶劑從水、甲醇、乙醇這三個(gè)極性大的溶劑中優(yōu)選，優(yōu)選結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，在料液比為1：15，提取溫度80℃，冷凝回流提取3次，每次2 h的提取條件下，以水為提取溶劑時(shí)，得到的環(huán)烯醚萜總苷浸膏為1.64 g，出膏率為16.4%；以甲醇為提取溶劑時(shí)，得到的環(huán)烯醚萜總苷浸膏為1.83 g，出膏率為18.3%；以水為提取溶劑時(shí)，得到的環(huán)烯醚萜總苷浸膏為1.76 g，出膏率為17.6%。這是因?yàn)槿軇┑男再|(zhì)不同，對(duì)各種化學(xué)成分的溶解性不同，導(dǎo)致提取出的化學(xué)成分和出膏量也不同。在本研究中，以甲醇作提取溶劑時(shí)的出膏量最高，乙醇次之，水最少，所以選擇甲醇作為提取溶劑。

圖1　不同溶劑對(duì)環(huán)烯醚萜總苷提取率的影響

2.2甲醇濃度對(duì)環(huán)烯醚萜出膏率的影響

在料液比為1：15，提取溫度80℃，冷凝回流提取3次，每次2 h的提取條件下，提取環(huán)烯醚萜總苷，提取結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)甲醇濃度分別為50%，60%，70%，80%，90%，100%時(shí)，浸膏提取率分別為15.4%、16.5%、17.5%、18.6%、18.5%和18.3%，可見(jiàn)隨著甲醇濃度的增大，環(huán)烯醚萜總苷提取率增大，當(dāng)甲醇濃度為80%時(shí)環(huán)烯醚萜提取率最高，此后隨著甲醇濃度的升高，環(huán)烯醚萜提取率基本保持不變，根據(jù)經(jīng)濟(jì)性和對(duì)環(huán)境的影響考慮，選擇80%的甲醇提取山茱萸中環(huán)烯醚萜總苷。

圖2　甲醇濃度對(duì)環(huán)烯醚萜總苷提取率的影響

2.3料液比對(duì)環(huán)烯醚萜出膏量的影響

由圖3可見(jiàn)，在以80%的甲醇為提取溶劑，提取溫度80℃，冷凝回流提取3次，每次2 h的條件下，料液比為分別為1：5、1：10、1：15、1：20、1：25時(shí)，浸膏提取率分別為14.9%、15.6%、18.6%、18.0%和18.1%，可見(jiàn)隨著料液比的增加，環(huán)烯醚萜出膏率顯著增大，當(dāng)料液比達(dá)到1：15以上時(shí)，環(huán)烯醚萜總苷提取率變化不大。這一結(jié)果與環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物在80%甲醇中的溶解度有關(guān)，當(dāng)料液比較小時(shí)，山茱萸中的環(huán)烯醚萜只有少部分溶于甲醇中，其余仍停留在細(xì)胞內(nèi)，造成環(huán)烯醚萜苷提取率較低，隨著甲醇用量的增加，環(huán)烯醚萜苷提取率增大。當(dāng)料液比達(dá)到1：15以后，山茱萸粉末中所含的環(huán)烯醚萜被完全溶解，之后再增大甲醇用量，環(huán)烯醚萜苷提取率基本不變。因此，選擇最佳料液比為1：15。

圖3　料液比對(duì)環(huán)烯醚萜總苷提取率的影響

2.4提取時(shí)間對(duì)環(huán)烯醚萜出膏量的影響

提取量與提取時(shí)間成正比，在一定條件下，提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取量越大。但是，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，擴(kuò)散系數(shù)小，導(dǎo)致雜質(zhì)會(huì)被提取出來(lái)，而提取量變化也不大。由圖4可知，在其他條件不變的情況下，隨著提取時(shí)間的增加，環(huán)烯醚萜出膏量逐漸增大，100 min后環(huán)烯醚萜出膏量增加情況趨于穩(wěn)定，說(shuō)明提取100 min可將山茱萸中環(huán)烯醚萜總苷提取出來(lái)，此后再增加提取時(shí)間環(huán)烯醚萜提取率基本不變。因此選擇100 min作為提取時(shí)間。

圖4　提取時(shí)間對(duì)環(huán)烯醚萜總苷提取率的影響

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

在提取溶劑為甲醇、提取濃度80%、料液比為1：15、提取時(shí)間100 min的條件下，進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，由表1可見(jiàn)，環(huán)烯醚萜總苷提取率的平均提取率為18.66%，說(shuō)明優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件可信。

表1　重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證山茱萸環(huán)烯醚萜總苷提取率

2.6薄層色譜鑒別甲醇提取產(chǎn)物

由圖5可知，當(dāng)以V（氯仿）：V（甲醇）：V（冰乙酸）=3：1：0.01為展開(kāi)劑時(shí)，莫諾苷的Rf值為0.79，馬錢(qián)苷的Rf值為0.32。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷的薄層色譜結(jié)果為五個(gè)斑點(diǎn)，其中有兩個(gè)斑點(diǎn)的Rf值分別與莫諾苷和馬錢(qián)苷一致，說(shuō)明提取的產(chǎn)物中有莫諾苷和馬錢(qián)苷。

圖5　TLC法鑒別山茱萸中環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物

3　結(jié)論與討論

山茱萸環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物的提取方法較多。由于環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物極性較大，根據(jù)相似相溶原理，本研究考察了水、甲醇和乙醇作為提取溶劑對(duì)環(huán)烯醚萜總苷提取率的影響，結(jié)果顯示甲醇提取效果最好，因此采用甲醇冷凝回流提取法。該方法具有條件溫和、不引入雜質(zhì)、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，而且不易破壞環(huán)烯醚萜的立體結(jié)構(gòu)和生物活性，能比較溫和地將植物組織分解，加速有效成分的釋放，從而提高提取率。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考查甲醇濃度、料液比、提取時(shí)間對(duì)山茱萸環(huán)烯醚萜總苷提取率的影響，并通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果當(dāng)甲醇濃度為80%，料液比為1：15，提取時(shí)間為100 min時(shí)，環(huán)烯醚萜總苷的平均提取率為18.66%。參考中國(guó)藥典2015版的鑒別方法，采用薄層色譜法鑒別提取產(chǎn)物，所用硅膠板為高效G板，展開(kāi)劑為V（氯仿）：V（甲醇）：V（冰乙酸）=3：1：0.01，結(jié)果提取產(chǎn)物在硅膠板上表現(xiàn)為5個(gè)斑點(diǎn)，其中有兩個(gè)斑點(diǎn)的Rf值分別與莫諾苷和馬錢(qián)苷一致，表明提取的產(chǎn)物中確實(shí)為環(huán)烯醚萜苷。

［1］董天嬌，崔元璐，田俊生，等.天然環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物研究進(jìn)展［J］.中草藥，2011，42（1）：185-194.

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（責(zé)任編輯：李堆淑）

A Study on Total Iridoid Glycoside Extraction of Dogwood

ZHAO Yan-yan，WANG Chen-fei，TENG Yang
（College of Biopharmaceutcal and Food Engineering，Shangluo University，Shangluo 726000，Shannxi）

To investigate the optimal extraction process of total iridoid glycosides from Dogwood，the raw materials were taken from Danfeng County，Shangluo City，Shaanxi Province.In this research，the calculated yield of total iridoid glycodides（based on medicinal materials）was taken as evaluation index，then investigated the effect of extraction solvent，solvent concentration，solid-liquid ratio，extraction time on iridoid extraction rate to determine the optimum extraction process.The best solvent is methanol whose concentration is 80%，the best solid-liquid ratio 1：15，and the best extraction time is 100 min，under this conditions，the extraction rate is about 18.7%.The eligible methods and conditions can effectively elevate the efficacy and stability of extraction of dogwood.

dogwood；the total iridoid glycoside；extraction

R285

A

1674-0033（2016）04-0040-04

10.13440/j.slxy.1674-0033.2016.04.011

2016-05-16

商洛學(xué)院科研基金項(xiàng)目（14SKY-FWDF005）

趙艷艷，女，陜西洛南人，碩士，講師