王　剛，孫　磊，李祥林，孫　勇（.龍口市畜牧獸醫(yī)工作站，山東 龍口 6570；.龍口市畜牧管理辦公室，山東 龍口 6570；.龍口市下丁家鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，山東 龍口 6579）

豬鏈球菌的分離鑒定和藥敏試驗

王剛1，孫磊2，李祥林3，孫勇1
（1.龍口市畜牧獸醫(yī)工作站，山東 龍口 265701；2.龍口市畜牧管理辦公室，山東 龍口 265701；3.龍口市下丁家鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，山東 龍口 265719）

本文對來自龍口市不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的疑似豬鏈球菌病的病料進行采集，對細菌進行分離培養(yǎng)，運用生化試驗和血清學(xué)兩種方法對分離出的細菌進行鑒定，并對鑒定出來的鏈球菌進行藥敏試驗。試驗結(jié)果表明其形態(tài)、染色、培養(yǎng)及生化特性均符合鏈球菌的特征。該分離菌株對氨芐西林、頭孢他啶、萬古霉素、頭孢氨芐、克林霉素、恩諾沙星高度敏感，對多黏菌素、環(huán)丙沙星、卡那霉素中度敏感，對紅霉素、青霉素低度敏感，而對土霉素、四環(huán)素、強力霉素、復(fù)方新諾明有明顯耐藥性。由此可見，分離出的鏈球菌對不同藥物的敏感性存在顯著差異。本文通過對疑似豬鏈球菌病的病料進行分離和研究鑒定，旨在了解生豬中豬鏈球菌的分布情況和現(xiàn)狀，為防控該病提供理論依據(jù)。

豬鏈球菌；分離鑒定；藥敏試驗

豬鏈球菌病是一種人畜共患的急性、熱性傳染病，是由C、D、E及L群鏈球菌引起的豬的多種疾病的總稱［1］，特征主要表現(xiàn)：急性病例常為敗血癥和腦膜炎；慢性病例則為關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎及組織化膿性炎等。本病呈世界性分布，國外多以R群的豬鏈球菌2型和S群的豬鏈球菌I型為主［2］，而國內(nèi)則以C群獸疫鏈球菌為主［3］。近幾年隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的不斷提高，豬鏈球菌病發(fā)生呈明顯上升趨勢，且常與豬繁殖障礙及呼吸道綜合癥、豬附紅細胞體病、非典型豬瘟、豬圓環(huán)病毒病混合感染［4］，一旦發(fā)生發(fā)病率和死亡率均較高，給養(yǎng)豬業(yè)與人類的健康造成很大的威脅。由于鏈球菌血清型眾多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且鏈球菌易產(chǎn)生耐藥性，給防治帶來困難，所以該病一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病。雖然理論上有很多藥物能治療豬鏈球菌病，但隨著抗菌藥物的廣泛使用以及臨床中不合理用藥，使得病原菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴重。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1病料采自龍口地區(qū)疑似豬鏈球菌發(fā)病的仔豬淋巴結(jié)、肺、脾、扁桃體等病變組織。

1.1.2試驗試劑綿羊血瓊脂平板、綿羊血瓊脂斜面、普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯等均按獸醫(yī)微生物實驗指導(dǎo)方法制備，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；細菌微量發(fā)酵管為杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；豬鏈球菌A-G乳膠診斷試劑盒由OXDD公司生產(chǎn)；C55938購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2試驗方法

1.2.1細菌分離采用無菌法將采集的疑似鏈球菌病發(fā)病的仔豬淋巴結(jié)、肺、脾、扁桃體等病變組織，劃線接種于含有5%綿羊血的瓊脂平板、巧克力培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長特性。挑取平板上的單個菌落作純培養(yǎng)。用24 h鮮血平板和肉湯的培養(yǎng)物，分別作革蘭氏染色，觀察其形態(tài)和染色特性。

1.2.2生化試驗將分離菌株分別接種于乳糖、麥芽糖、蔗糖、菊糖、葡萄糖、棉實糖、甘露醇、楊苷等微量生化反應(yīng)管中，同時做M-R試驗和V-P試驗，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察其生化反應(yīng)特性。

1.2.3血清型鑒定取分離的18 h血液平板培養(yǎng)物，分別與蘭氏分群A-G群混合陽性抗原對照和參考株對照。

1.2.4藥敏試驗采用紙片擴散法。37℃培養(yǎng)24 h后，觀察、測定抑菌圈的直徑。判定豬鏈球菌對藥敏紙片的敏感性標(biāo)準：抑菌環(huán)直徑在15 mm以上為高度敏感；10～15 mm為中度敏感；10 mm以下為低度敏感；無抑菌環(huán)為不敏感。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)結(jié)果

分離菌在綿羊血瓊脂平板上菌落直徑為0.5～1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊，呈β溶血。挑取單個菌落，革蘭氏染色鏡檢，為革蘭氏陽性球菌，單個或成對，少數(shù)呈3～5個短鏈排列。

2.2生化試驗結(jié)果

生化反應(yīng)結(jié)果均符合豬鏈球菌的生化特性，結(jié)果見表1?！?”表示大多數(shù)菌株為陽性，“－”表示大多數(shù)菌株為陰性

表1分離菌生化試驗結(jié)果

2.3血清學(xué)試驗

分離菌經(jīng)鏈球菌A-G乳膠分型診斷試劑盒鑒定，結(jié)果為C群鏈球菌2株，D群鏈球菌1株，E群鏈球菌3株。

2.4藥敏試驗結(jié)果

對分離培養(yǎng)獲得的純培養(yǎng)物進行藥敏試驗，該分離菌株對氨芐西林、頭孢他啶、萬古霉素、頭孢氨芐、克林霉素、恩諾沙星高度敏感，對多黏菌素、環(huán)丙沙星、卡那霉素中度敏感，對紅霉素、青霉素低度敏感，而對土霉素、四環(huán)素、強力霉素、復(fù)方新諾明有明顯耐藥性。

3　結(jié)論與討論

從采集的疑似鏈球菌病的豬病料中分離到6株細菌，根據(jù)培養(yǎng)特性、染色特點、形態(tài)觀察、生化試驗鑒定為豬鏈球菌，通過血清學(xué)試驗，表明該地區(qū)鏈球菌病是由C、D和E群鏈球菌引起的，說明感染鏈球菌病原的復(fù)雜性。鏈球菌的分群鑒定方法很多，主要有生化試驗和血清學(xué)試驗。由于鏈球菌的生化指標(biāo)差異較大，以形態(tài)、培養(yǎng)和生化等表型特性難以將分離的菌株準確歸類，應(yīng)該采用血清學(xué)方法進行鑒定［5］。

本次藥敏試驗結(jié)果表明，該分離菌株對氨芐西林、頭孢他啶、萬古霉素、頭孢氨芐、克林霉素、恩諾沙星高度敏感，對多黏菌素、環(huán)丙沙星、卡那霉素中度敏感，對紅霉素、青霉素低度敏感，而對土霉素、四環(huán)素、強力霉素、復(fù)方新諾明有明顯耐藥性。該菌株存在多重耐藥性。

由于各地用藥習(xí)慣以及近年來抗生素的濫用，產(chǎn)生了大量的耐藥菌株，為疾病的后續(xù)治療產(chǎn)生了很大的影響，也使得疾病更加難以控制。因此，建議臨床用藥前，有條件的先進行菌株的藥敏試驗，根據(jù)試驗結(jié)果進行指導(dǎo)用藥，并注意穿梭用藥，避免耐藥菌株的出現(xiàn)。

［1］王金合，郭素琴，陳益，豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報，2006，⑶.

［2］luque i，tarradas c，arenas a，et al.streptococcus suis serotypes associated with different disease conditions in pigs［J］.vet rec，1998，142，（26）：726-727.

［3］趙華梅，潘秀珍，唐家琪.豬鏈球菌毒力因子和鑒定方法的研究進展［J］.微生物學(xué)雜志，2006，26（1）：77-80.

［4］熊毅，劉棋，覃芳蕓，等.豬鏈球菌亞種及1、2、9型四重PCR檢測方法的建立［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，38（6）：681-684.

［5］付薇，陳進喜，覃芳蕓，等.豬鏈球菌9型cps9G基因的克隆與序列分析［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2009，30（1）：1-4.

（編輯：趙鵬飛）

S858.28

A

1006-799X（2016）11-0071-02

王剛（1971-），男，山東龍口人，畜牧師，研究方向畜牧獸醫(yī)。