韓　元，劉　偉，孫龍杰，彭建偉，蔡葵蒸，徐春蘭，陳明月（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

捕食線蟲性真菌彎孢節(jié)叢孢的分離與鑒定

韓元，劉偉，孫龍杰，彭建偉，蔡葵蒸*，徐春蘭，陳明月
（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

目的：通過對捕食線蟲性真菌的分離與鑒定為家畜寄生線蟲病防治的工作者提供更多候選菌種。方法：采用玻片法、瓊脂塊法，觀察分生孢子和分生孢子梗形狀并測其大小，從而進行形態(tài)學鑒定。結果：分生孢子無色，長橢圓形，1個分隔。分生孢子梗無色，直立，不分枝，8～11個分隔，頂端形成燭臺狀分枝，在短而小的齒梗上產(chǎn)生3～12個分生孢子，稀疏，呈頭狀排列，厚垣孢子黃色，球形或橢圓形，單生或串生，直徑14～22 μm，一般在培養(yǎng)20 d后形成。捕食器為粘性網(wǎng)。最終鑒定為彎孢節(jié)從孢。

捕食線蟲性真菌；分離；鑒定；彎孢節(jié)從孢

多年來，家畜胃腸道線蟲幾乎依賴驅(qū)蟲藥來控制。由于驅(qū)蟲藥的大量使用，寄生蟲的抗藥性增加、畜體內(nèi)藥物殘留和生態(tài)環(huán)境遭到破壞等諸多問題受到科學家的關注［1］。目前人們在尋找其它的生物防治方法來減少化學驅(qū)蟲劑的使用。一些畜牧業(yè)發(fā)達的國家如新西蘭、澳大利亞等利用捕食線蟲真菌防治動物寄生線蟲已經(jīng)取得了一定的進展［2，3］。有研究表明：為家畜投服少量捕食線蟲真菌后，能有效地降低寄生蟲的感染強度，減少蟲卵數(shù)量和減輕臟器病變，達到了生物防治線蟲的目的［4］。捕食線蟲性真菌可以通過菌絲分化形成具有特殊結構的捕食器官如粘性菌絲、粘性菌網(wǎng)、非收縮性環(huán)、收縮性環(huán)、粘性分枝、粘性球及冠囊體，同時這些捕食器官有它自身所特有的捕捉行為和捕食機制是研發(fā)寄生線蟲生物防治制劑的重要資源［5，6］。捕食線蟲真菌以糞便為營養(yǎng)基質(zhì)并在牧場中生存繁衍，很多種類隨著動物的采食而又進入腸道，又隨糞便排出。因此，從家畜自然糞便中分離的捕食線蟲真菌常常具有很強的抗消化特性［7］。本研究主要目的從綿羊糞便中分離彎孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys musiformis）菌進行形態(tài)學的觀察與鑒定，為家畜寄生線蟲病防治的工作者提供更多的候選菌種。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1樣品采集從云南省普洱市思茅區(qū)刀官寨采集了20份新鮮的綿羊糞便樣品。直腸采集或落地半小時內(nèi)的新鮮糞便，采集15～20 g裝入無菌的塑料封口袋，詳細記錄并編號，樣品帶回實驗室，在接種之前需放在4℃冰箱內(nèi)備用。

1.1.2培養(yǎng)基及主要染液2%水瓊脂（Water Agar，WA）培養(yǎng)基：制作水瓊脂培養(yǎng)基先備好涼開水，稱取瓊脂粉8 g，置于500 ml錐形瓶，加涼開水400 ml，煮沸溶解后，放于121℃高壓滅菌20 min，倒于滅菌的玻璃培養(yǎng)皿備用。

NGM（Nematode Growth Medium）培養(yǎng)基：分別稱取3 g NaCl、2.5 g蛋白胨、17 g瓊脂，加入 1 mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液 （pH=6.0）25 ml和975 ml蒸餾水，121℃高壓滅菌20 min后，分別加入已除菌的1 ml膽固醇溶液（5 mg/ml乙醇）、1 ml 1 mol/L MgSO4和1 ml 1mol/L的CaCl2，混勻后，倒于滅菌的玻璃培養(yǎng)皿備用。

乳酚棉蘭染液：苯酚20 g，甘油40 ml，乳酸20 ml，棉蘭0.05 g，蒸餾水20 ml，將棉蘭溶于蒸餾水中，再加入其他成分，微加熱，使其溶解，冷卻備用。

1.2試驗方法

1.2.1分離中所用的誘餌線蟲從胃腸道線蟲自然感染的綿羊中分離的蛇形毛圓線蟲（Trichostrongylus colubriformis）3期幼蟲（L3）保存在4℃冰箱內(nèi)。為了恢復T.colubriformis L3的活力，對兩只三個月齡的綿羊在室內(nèi)進行人工感染。首先對這兩只綿羊進行驅(qū)蟲，聯(lián)合使用阿苯達唑15 mg/kg和左旋咪唑7.5 mg/kg。驅(qū)蟲一周以后，將存儲于4℃冰箱內(nèi)的T.colubriformis L3進行計數(shù)，將含有約10 000條L3的懸液灌服兩只綿羊。一般在3周后寄生蟲感染取得成功，用棉布制作的收集袋收集感染羊的糞便，與適量滅菌的鋸末混勻置于醫(yī)用搪瓷盒，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，為了保持濕度其間需噴灑適量滅菌水并攪拌混勻。經(jīng)過一段時間后L3會自動爬上搪瓷蓋，這時用滅菌蒸餾水沖洗L3到250 ml燒杯中。過濾去除液體中的雜質(zhì)，用貝爾曼分離裝置分離6 h將活躍的幼蟲濃縮進小試管中，同時含有幼蟲的沉積物用滅菌蒸餾水以5 min 1 000 rpm的速度離心清洗4次，每次離心后棄去上清液。在清洗后的幼蟲液中取20μl的等份試樣5份分別進行計數(shù)以對懸浮總的L3數(shù)量進行估算。

1.2.2真菌純化中所使用的秀麗隱桿線蟲將秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）放置在含有NGM培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，通過將培養(yǎng)基與無菌蒸餾水浸泡1 min來吸取線蟲。浸泡液使用貝爾曼分離漏斗將這些線蟲分離進小試管中。之后，將線蟲用無菌蒸餾水以10 min 500 rpm離心，清洗4次，每次離心后棄去上清液。為了估計C.elegans的數(shù)量，采用20 μl等份試樣5份分別進行計數(shù)然后對懸浮液中的C.elegans總數(shù)進行估算。

1.2.3本研究中對食線蟲真菌的分離對食線蟲真菌的分離是根據(jù)Saumell等人［8］描述的方法進行的。用滅菌鑷子取2～3 g樣品放在WA培養(yǎng)基上，呈三角形。每份樣品接種3個平行，樣品應盡量放在平皿中央，這樣便于生長情況的觀察。置于25℃恒溫箱，培養(yǎng)1周后加入誘餌線蟲3 000～4 000條/皿，繼續(xù)培養(yǎng)。加入線蟲后的第2天，在倒置顯微鏡（Leica，DMIL型）下對每個平皿全面鏡檢，共鏡檢5～6次，當發(fā)現(xiàn)蟲子被菌絲纏住或已經(jīng)出現(xiàn)特殊的捕食器官時進行詳細標記。

1.2.4本研究中捕食線蟲性真菌的純化從已標記的培養(yǎng)皿中，挑取菌絲或已被捕捉到的線蟲將其轉移到新的WA培養(yǎng)基中。繼續(xù)培養(yǎng)，從接種的第2天開始，每天觀察1次，等到菌絲長至培養(yǎng)皿的2/3時，加入3 000～4 000條/皿C.elegans，培養(yǎng)至出現(xiàn)捕食結構或產(chǎn)生孢子時，再挑取含有菌絲、捕食結構或孢子的培養(yǎng)物轉接于WA培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當在鏡下看到該菌絲的分枝、捕食器官相一致時，說明該株已經(jīng)純化好。

1.2.5分離株的鑒定采用玻片法［9］來觀察分生孢子形態(tài)、著生方式及孢子梗等形態(tài)：把純化分離菌株接種到WA培養(yǎng)基上，置25℃恒溫箱里培養(yǎng)，24 h后在倒置顯微鏡下觀察菌絲生長情況，當肉眼能看到菌絲時，以45°角傾斜插入4個滅菌的蓋玻片，繼續(xù)培養(yǎng)。等一周后菌絲覆蓋蓋玻片時，取出蓋玻片用乳酚棉蘭染色制片，在光學顯微鏡（Leica，DME型）下觀察并拍照記錄。

采用瓊脂塊法觀察捕食結構：同上所述，待菌落生長至平皿的2/3時，加入誘餌線蟲3000～4000條，12 h后在倒置顯微鏡下觀察，當發(fā)現(xiàn)捕食器官或線蟲已被捕食時做好標記。在超凈工作臺里用直徑1 cm的打孔器進行打孔，將打好的瓊脂塊放置在載玻片上滴一滴棉蘭染液，立即放置在光學顯微鏡下觀察拍照。

2　結果

2.1 Arthrobotrysmusiformis的分離

從云南省普洱市思茅區(qū)刀官寨采集了20份新鮮的綿羊糞便樣品中分離到1株真菌。

2.2分離株的鑒定

在WA培養(yǎng)基上菌落無色至白色，放射性生長；營養(yǎng)菌絲無色至白色，有分枝且分隔，寬為1.25～10 μm；分生孢子梗沒有分枝，直立，8～11個分隔，長162～387.5 μm，孢子?；繉?～8.25 μm，向上漸細，頂端寬3～5.75 μm，頂端形成燭臺狀分枝（圖A和圖B）；在短而小的齒梗上產(chǎn)生3～12個分生孢子，稀疏，呈頭狀排列（圖C和圖E）；分生孢子無色，長橢圓形，直或稍彎，遠軸端鈍圓，向基部逐漸收縮，1個分隔（圖D）；大小為21.25～35（27.86）×6.25～12.5 （8.92）μm，培養(yǎng)第3 d開始可產(chǎn)生分生孢子。厚垣孢子黃色，球形或橢圓形，單生或串生，直徑14～22 μm，一般在培養(yǎng)20 d后形成。捕食器為粘性網(wǎng)，在WA培養(yǎng)基上即使不加線蟲誘導時，也可自發(fā)形成三維粘性網(wǎng)（圖F）。

3　討論

捕食線蟲性真菌捕食結構的類型取決于種以及環(huán)境條件，甚至同一種中的不同株結構也有差異［10］。在本研究中分離出來的該菌株在營養(yǎng)菌絲側面長出分枝，分枝彎曲、融合到原來的枝上，形成單個菌環(huán)，在原有的菌環(huán)上或原來的枝上長出新的菌環(huán)，從而形成三維粘性網(wǎng)。

注：比例尺=30 μm

根據(jù)張克勤［11］等人的研究，在WA培養(yǎng)基上，菌落呈無色至白色；菌絲稀疏、無色；分生孢子梗無色，直立，分隔，沒有分枝，梗具有短的小齒梗，頂端形成燭臺狀分枝；分生孢子無色，長的橢圓形，直或稍彎，遠軸端鈍圓，向基部逐漸收縮，1個分隔。這與節(jié)叢孢屬的特性相一致。許多節(jié)叢孢屬（Arthrobotrys）不能自發(fā)形成捕食結構，而捕食結構的形成依賴于環(huán)境條件。一種捕食線蟲性真菌一般僅產(chǎn)生一種類型的捕食器官，但在能夠產(chǎn)生非收縮環(huán)的真菌中，一些種可產(chǎn)生幾種不同的捕食結構。

該菌的分生孢子梗與圓錐節(jié)叢孢（A.conoides）相似，都為無色，直立，不分枝，但該種頂端形成燭臺狀分枝，在短而小的齒梗上產(chǎn)生3～12個分生孢子，稀疏，呈頭狀排列。而A.conoides頂端漸細，孢子梗通常只有1～2個瘤節(jié)，瘤節(jié)上可著生多個孢子，分生孢子在梗上呈頭狀緊密排列。該菌的分生孢子與指狀節(jié)叢孢（A.dactyloides）相似，A.dactyloides分生孢子粗棍棒形，略彎曲，有一分隔，位于中部，分生孢子大小為35～51.5（42.1）×6.5～8（7.5）μm，但二者的區(qū)別是前者的捕食結構為三維粘性網(wǎng)，后者為收縮環(huán)。該菌能產(chǎn)生黃色的厚垣孢子，呈球形或橢圓形，單生或串生，直徑14～22 μm，一般在培養(yǎng)20 d后形成，而A. conoides和A.dactyloides不產(chǎn)生厚垣孢子。該菌從分生孢子形狀大小及其分隔數(shù)，分生孢子梗的長度、著生分生孢子數(shù)及頂端形成獨特的燭臺狀分枝，有厚垣孢子，捕食結構為三維粘性網(wǎng)，這與李天飛［12］等所描述的彎孢節(jié)從孢相一致。

在自然環(huán)境中，為了抵抗外界惡劣環(huán)境或者在不適合自身生存條件下，該菌自發(fā)產(chǎn)生分生孢子或厚垣孢子。當遇到適宜環(huán)境時，且存在大量的蟲卵形成幼蟲時會誘導環(huán)境中的捕食性真菌形成特定的捕食結構，從而可以部分減少環(huán)境中自由生活階段線蟲的數(shù)量。因此，相應的減少了家畜在這個時期的線蟲感染率。本研究中彎孢節(jié)叢孢是從綿羊的新鮮糞便中分離的，從理論上來說，應具有抗消化的能力，所以該菌作為候選菌種是很有希望的。

［1］徐春蘭，劉偉，王逢會，等.溫度和pH對捕食性線蟲分離株—長孢隔指孢菌生長的影響及生物學特性的觀察［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2015，24（6）：110-115.

［2］Larsen，M.，P.Nansen，J.Gronvold，et al.Biological control of trichostrongyles in calves by the fungus Duddingtonia flagrans fed to animals under natural grazing conditions［J］.Veterinary Parasitology，1995，（55）：266-288.

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［11］李天飛，張克勤，劉杏忠.食線蟲菌物分類學［M］.中國科學技術出版社，2000.

［12］張克勤，莫明和.中國真菌志（第三十三卷節(jié)叢孢及相關屬）［M］.北京：科學出版社，2006.

（編輯：高真貞）

S432.4+4

B

1006-799X（2016）11-0062-03

項目來源：西北民族大學研究生科研創(chuàng)新項目（項目編號：Yxm2015203）

韓元（1994-），女，青海門源人，在讀碩士，研究方向為動物寄生蟲病防治。

蔡葵蒸（1959-），男，甘肅天水人，教授，研究方向為動物寄生蟲病診斷及防治研究。