王　楊，顧　準(zhǔn)，徐　瓊

（蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，江蘇 太倉 215411）

還原降解、腫瘤靶向的智能型超支化聚酰胺藥物載體制備研究

王楊，顧準(zhǔn)，徐瓊

（蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，江蘇 太倉 215411）

從理想藥物載體的設(shè)計角度出發(fā)，通過引入功能性單體，采用邁克爾加成聚合法以及材料表面改性的方法構(gòu)建還原降解、腫瘤靶向的智能型聚合物納米載體。首先，以N，N＇-雙（丙烯酰）胱胺和1-（2-胺乙基）哌嗪為單體聚合得到可還原降解的超支化聚酰胺胺（DHPAA）。在此基礎(chǔ)上，通過接枝聚乙二醇和偶聯(lián)葉酸得到穩(wěn)定的、腫瘤靶向的智能型超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP）。使用紅外光譜、核磁共振、動態(tài)光散射（DLS）、Zeta電位儀、拉曼光譜和凝膠滲透色譜（GPC）對聚合物DHPAA結(jié)構(gòu)和性能進行表征；使用核磁共振、動態(tài)光散射（DLS）、Zeta電位儀和透射電鏡（TEM）對聚合物FA-DHPAP的結(jié)構(gòu)和性能進行表征。通過細胞毒性實驗對聚合物DHPAA和FA-DHPAP的生物相容性進行表征。結(jié)果表明：該智能型超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP）能夠響應(yīng)環(huán)境、具有良好的生物相容性，因此作為藥物載體在腫瘤治療中具有較好的應(yīng)用前景。

超支化聚酰胺胺；還原降解；腫瘤靶向；藥物載體

0　引　言

腫瘤是威脅人類健康與生命的疾病之一，化療仍是目前治療腫瘤疾病的主要手段之一。隨著材料科學(xué)與醫(yī)學(xué)的發(fā)展，聚合物材料被廣泛用于藥物載體［1］。超支化聚酰胺胺由于制備簡單、易分離提純，內(nèi)部具有空腔、表面具有大面末端氨基等特點，可用于包裹或者連接藥物等活性分子，因此在藥物傳遞和基因轉(zhuǎn)染等生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛研究［2-3］。然而，聚酰胺胺表面帶有的大量正電荷易與帶負電的細胞表面相互作用，因此具有一定的細胞毒性、溶血效應(yīng)和肝臟毒性，限制了其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用［4］。聚乙二醇（PEG）具有良好的生物相容性和親水性，可對聚酰胺胺表面改性，一方面通過減少或者部分屏蔽聚合物表面的正電荷可降低聚酰胺胺細胞毒性［5］；另一方面，可延長藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時間，提高藥物的生物利用度。復(fù)旦大學(xué)楊武利課題組將合成的超支化聚酰胺胺（h-PAMAM）和部分PEG化的超支化聚酰胺胺（h-PAMAM-g-PEG）按照一定的比例進行混合，并進行了基因轉(zhuǎn)染的生物應(yīng)用。結(jié)果表明，混合體系既提高了基因轉(zhuǎn)染的效率又提高了材料的生物相容性［6］。對腫瘤細胞膜表面葉酸受體的深入研究表明，在多種腫瘤如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和腎細胞癌等細胞膜表面，葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于一般正常細胞；因此，葉酸分子偶聯(lián)可賦予藥物載體材料主動靶向性［7］。Qiao等［8］通過在聚（2-乙烯基）-4，4-二甲基吖內(nèi)酯（PVDMA）上連接腫瘤靶向基團葉酸和熒光基團氨基-羅丹明B構(gòu)建熒光納米偶合物。熒光成像研究結(jié)果表明，制備的納米偶合物能夠識別靶向腫瘤細胞并能夠監(jiān)控腫瘤細胞表面的膜糖蛋白的過表達。

圖1　還原降解性、腫瘤靶向的超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP）的合成路線

生物降解性是理想藥物載體的重要特征。研究發(fā)現(xiàn)，人體細胞內(nèi)還原性谷胱甘肽（GSH）的濃度為2～10mmol/L，遠大于細胞外GSH的濃度（2～10μmol/L）［9］；對于腫瘤細胞，其細胞內(nèi)GSH的濃度要比正常細胞內(nèi)GSH濃度高4倍，這使得腫瘤細胞內(nèi)外的還原電勢存在較大差異［10］。Martello等［11］通過引入二硫鍵合成了8種不同類型的還原響應(yīng)型超支化和線型聚酰胺胺，研究發(fā)現(xiàn)所有合成的超支化和線性聚酰胺胺幾乎沒有毒性；但含有二硫鍵的超支化聚酰胺胺在COS-7細胞中表現(xiàn)出比線性聚酰胺胺（PEI）更高的基因轉(zhuǎn)染效率，且比線性PEI轉(zhuǎn)染效率高兩倍。針對聚合物納米藥物載體往往存在不可降解、靶向性不夠以及生理條件下穩(wěn)定性較差等問題，本文從理想藥物載體設(shè)計角度出發(fā)，采用邁克爾加成“一鍋法”聚合方法，通過引入功能性單體制備還原降解、腫瘤靶向的智能型超支化聚酰胺胺（FA-DHPAP，見圖1）。這種基于超支化聚酰胺胺的智能藥物載體不僅具有傳統(tǒng)超支化聚酰胺胺的優(yōu)點，而且由于引入了二硫鍵和表面接枝PEG和偶聯(lián)葉酸，具有生物降解性、穩(wěn)定性和腫瘤靶向性。本文以骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）為對象，研究了基于超支化聚酰胺胺的智能藥物載體的生物相容性。

1　實驗部分

1.1原料與儀器

N，N＇-雙（丙烯酰）胱胺（BAC），AR，質(zhì)量分數(shù)98%；1-（2-胺乙基）哌嗪（AEPZ），AR，質(zhì)量分數(shù)98%；二硫蘇糖醇（DTT），AR，質(zhì)量分數(shù)99%；溴化噻唑藍四氮唑（MTT），AR，質(zhì)量分數(shù)98%；聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯（PEGMA，Mw2000g/mol）、葉酸（FA），AR，質(zhì)量分數(shù)96%；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl），AR，質(zhì)量分數(shù)99%；N-羥基丁二酰亞胺（NHS），AR，質(zhì)量分數(shù)98%；以上試劑均購于百靈威科技有限公司。N，N＇-二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、乙醚、三乙胺、丙酮等實驗用有機溶劑為分析純，均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為二次蒸餾水。

動態(tài)光散射（DLS）和Zeta電位儀（Zetasizer Nano，Malven），英國馬爾文儀器有限公司；核磁共振波譜儀（Bruker-500MHz），瑞士Bruker公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet Nexus-440），美國Nicolet公司；拉曼光譜儀（LabRam-1B），法國Dior公司；凝膠滲透色譜儀（GPC，Waters Breeze 1525），美國沃特斯公司；透射電鏡（TEM，Hitachi H-600），日本日立公司；酶標(biāo)免疫檢測儀（EL311型），美國BioTek公司；水套式CO2孵箱（3164型），美國Forma Scientific公司。

1.2實驗步驟

1.2.1還原降解性超支化聚酰胺胺（DHPAA）的合成與降解

以N，N＇-雙（丙烯酰）胱胺（BAC）與1-（2-胺乙基）哌嗪（AEPZ）為反應(yīng)單體，采用“一鍋法”邁克爾加成聚合反應(yīng)制備得到還原降解性超支化聚酰胺胺（DHPAA）。具體步驟如下：室溫下，將溶有1.5mmol AEPZ的2mL甲醇溶液滴加至含有1.5mmol BAC的10 mL甲醇溶液中。混合物在50℃下攪拌反應(yīng)6 d后，在劇烈攪拌下將反應(yīng)混合物加入過量乙醚中進行沉淀。將沉淀通過離心分離后溶解至甲醇，在含有5%（V/V）濃鹽酸的100mL丙酮溶液中沉淀、真空干燥得白色粉末狀固體（即DHPAA）。

稱取合成的聚合物DHPAA 2.0mg分散至二硫蘇糖醇（DTT）為10mmol/L的2mL 0.01mol/L、pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中，密閉反應(yīng)24 h，GPC跟蹤表征。

1.2.2PEG接枝、葉酸偶聯(lián)的超支化聚酰胺胺（FADHPAP）的合成

PEG化的還原降解性超支化聚酰胺胺（DHPAP）的合成與DHPAA類似，不同的是反應(yīng)5d后，加入與AEPZ等物質(zhì)量的PEGMA（1.5 mmol）甲醇溶液，在60℃繼續(xù)反應(yīng)3d后按照與DHPAA相同的提純方法進行純化后得到DHPAP。

將摩爾比為1∶2.2∶2.2的葉酸（FA）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 （EDC·HCl）、以及N-羥基丁二酰亞胺 （NHS）溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，并加入少量的三乙胺，N2保護下、室溫磁力攪拌過夜形成葉酸活性酯。將上述反應(yīng)液緩慢加入DHPAP的DMSO溶液中（DHPAP與葉酸摩爾比為1∶6），室溫避光反應(yīng)1～2 d，粗產(chǎn)物在蒸餾水中透析純化后凍干得到FA-DHPAP。

1.2.3細胞毒性實驗

細胞毒性實驗的測量方法是常規(guī)的MTT法。選用間充質(zhì)干細胞評價聚合物DHPAA和FA-DHPAP的生物相容性。MSCs細胞用DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)介質(zhì)在37℃、5%CO2氛圍下培養(yǎng)，每3d更換一次介質(zhì)。細胞株以每孔1× 104個細胞的密度接種到96孔培養(yǎng)板上，在含有5% CO2的濕潤空氣氛圍下培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，并用新鮮磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，再分別加入新鮮的預(yù)定濃度的聚合物DHPAA和FA-DHPAP，平行操作3份。48h后，吸去孔內(nèi)的上清液，用新鮮PBS緩沖溶液洗滌后在每孔中加入20μL MTT液體（5mg/mL），在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)。棄去上清液，每孔加150μL DMSO，避光振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解。使用自動酶標(biāo)儀檢測570nm波長處的吸光度（A）值。細胞存活率按下式計算：

其中Asample，Acontrol和Ablank分別代表樣品孔、對照孔和空白孔在570nm處的吸光度值。樣品孔為加入待測樣品的細胞培養(yǎng)液，對照孔為未加待測樣品的細胞培養(yǎng)液，空白孔為未加細胞的培養(yǎng)液。

2　結(jié)果與討論

2.1聚合物DHPAA的合成與性能表征

2.1.1DHPAA的合成

聚合物DHPAA以BAC與AEPZ為反應(yīng)單體，采用“一鍋法”邁克爾加成聚合反應(yīng)制備得到。在DHPAA的紅外譜圖（見圖2（a））中，在3436cm-1處出現(xiàn)了來自AEPZ的氨基（-NH與-NH2）的伸縮振動峰，在1 654cm-1處出現(xiàn)了酰胺的羰基（C=O）的伸縮振動峰。在DHPAA的拉曼光譜中（見圖2（b）），在507cm-1處出現(xiàn)了二硫鍵的（S-S）的吸收峰［12］。DHPAA在D2O中的13C-NMR譜圖（見圖3）表明，所合成的聚合物符合分子設(shè)計。

圖2　DHPAA的紅外譜圖和拉曼譜圖

圖3　DHPAA在D2O中的13C-NMR譜圖

2.1.2DHPAA的性能表征

還原降解性超支化聚酰胺胺與樹枝狀聚酰胺胺類似，表面帶有大量的氨基（見圖1），因此該材料表面具有大量的正電荷。Zeta電勢結(jié)果（見圖4）表明：DHPAA在不同pH的磷酸鹽緩沖溶液中均帶正電，表現(xiàn)出明顯的pH響應(yīng)性，電勢隨著pH值的升高而降低，從44 mV（pH 3.0）變化到11mV（pH 9.0）。隨著環(huán)境pH的增加，氫離子濃度降低，聚合物材料表面氨基所帶正電荷減少，電勢降低。

圖4　DHPAA在不同pH磷酸鹽緩沖溶液中的電勢

通過凝膠滲透色譜（GPC）跟蹤聚合物DHPAA分子量在還原性環(huán)境中的變化來表征DHPAA的還原降解性。如圖5（a）所示，聚合物DHPAA的分子量約為5 000。在DTT還原性環(huán)境中，隨著時間的增長，聚合物DHPAA的分子量減小，24h后由最初的4800降為350（見圖5（b））。GPC結(jié)果表明，在還原性環(huán)境中，聚合物DHPAA內(nèi)部二硫鍵被還原為巰基而發(fā)生斷裂［13］，因而被降解為小分子物質(zhì)、易被排出體外，一定程度上降低了生理毒性，提高了生物相容性。

圖5　DHPAA的GPC譜圖和在10mmol/L DTT、pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中的分子量變化

2.2聚合物FA-DHPAP的合成與性能表征

2.2.1聚合物FA-DHPAP的合成

聚乙二醇（PEG）通過邁克爾加成法共聚至DHPAA得到DHPAP，在此基礎(chǔ)上通過酰胺化反應(yīng)將葉酸連接至DHPAP得到FA-DHPAP。核磁結(jié)果（見圖6）表明，3.5×10-6出現(xiàn)了來自PEG的特征峰［14］，8.66×10-6、6.60×10-6、4.45×10-6出現(xiàn)了來自葉酸的特征峰［15］，說明所合成的FA-DHPAP符合分子設(shè)計。

2.2.2聚合物FA-DHPAP的性能表征

通過DLS，Zeta電位儀以及透射電鏡（TEM）等進一步對聚合物DHPAA和FA-DHPAP進行性能表征以比較兩者的性能差異。從表1看出，接枝PEG和偶聯(lián)葉酸后的聚合物FA-DHPAP的Zeta電勢為（1.9±0.5）mV，遠低于DHPAA在pH 7.4環(huán)境中的Zeta電勢。由于PEG的接枝和葉酸的偶聯(lián)，聚合物DHPAA中氨基的數(shù)目減少引起正電荷減少；另外葉酸的偶聯(lián)使得羧基增多，負電荷增多。這些均致使聚合物FA-DHPAP電勢降低。

圖6　FA-DHPAP在DMSO中的1H-NMR譜圖

表1　聚合物DHPAA和FA-DHPAP的Zeta電勢

同時，從表1可看出，DLS測得的DHPAA粒徑為5.0nm，F(xiàn)A-DHPAP的粒徑約為50nm。對于聚合物DHPAA，其分子量約為5 000且易溶于水，在水中是以單分子存在，因此粒徑較小。對于聚合物FA-DHPAP，PEG的接枝和葉酸的偶聯(lián)使其分子量增大、分子粒徑增大。聚合物FA-DHPAP的電鏡圖（見圖7（a））表明，F(xiàn)A-DHPAP的粒徑分布較寬，電鏡下觀察的粒徑為（48±30）nm，與DLS測得的粒徑分布（見圖7（b））一致。從電鏡圖中可看出：較小的粒子約為20nm，為聚合物FA-DHPAP的單分子粒徑；較大的粒徑約為80nm，這表明少量的聚合物FA-DHPAP分子發(fā)生了聚集。

圖7　聚合物FA-DHPAP的電鏡圖與粒徑分布

2.3聚合物DHPAA和FA-DHPAP的生物相容性

由上述結(jié)果可知，聚合物FA-DHPAP不僅表面具有大量的氨基、可連接其他藥物或者活性分子，還具有還原降解性和腫瘤靶向性，因此非常適合用作藥物載體。由于生物相容性是影響藥物載體應(yīng)用性能的重要因素之一，本文研究了聚合物FA-DHPAP對骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的48h細胞毒性，并與聚合物DHPAA作比較。如圖8所示，對于較低的濃度（0～200μg/mL），聚合物DHPAA和FA-DHPAP對骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的生長均沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用。當(dāng)聚合物濃度較高時（500～1000μg/mL），F(xiàn)A-DHPAP表現(xiàn)出比DHPAA更好的生物相容性：聚合物DHPAA濃度為500 μg/mL和1 000 μg/mL時，MSCs細胞存活率分別為87.5%和82.8%；相比較而言，聚合物FA-DHPAP顯示出較低的細胞毒性，500μg/mL時MSCs細胞存活率為92.8%，1000μg/mL 時MSCs細胞存活率為90.6%。

圖8　聚合物DHPAA和FA-DHPAP對MSCs的48h細胞毒性

細胞毒性結(jié)果表明，聚合物DHPAA因帶有正電容易與帶負電的細胞表面相互作用，因此具有一定的細胞毒性；聚合物FA-DHPAP由于表面接枝PEG和偶聯(lián)FA，減少或者部分屏蔽了聚合物表面的正電荷而降低了細胞毒性，因而是一種理想的抗腫瘤藥物載體。

3　結(jié)束語

本文采用“一鍋法”邁克爾加成聚合法成功合成了含有二硫鍵、可還原降解的超支化聚酰胺胺（DHPAA）。DHPAA表面具有大量的氨基，分子量約為5000，在還原性介質(zhì)DTT中能夠降解為小分子物質(zhì)。通過在DHPAA表面接枝共聚PEG和偶聯(lián)葉酸制備得到基于超支化聚酰胺胺的智能型藥物載體材料FA-DHPAP。DLS、Zeta電勢和TEM結(jié)果表明，PEG的接枝和葉酸的偶聯(lián)使其表面正電荷減少，粒徑增大。MSCs細胞毒性結(jié)果表明，相比于聚合物DHPAA，聚合物FA-DHPAP的細胞毒性較小、生物相容性更好，是一種理想的抗腫瘤藥物載體。

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（編輯：莫婕）

Preparation of redox-degradable and tumor-targeted smart drug vehicle based on hyperbranched polyamidoamine

WANG Yang，GU Zhun，XU Qiong
（Department of Biological and Chemical Engineering，Suzhou Chien-Shiung Institute of Technology，Taicang 215411，China）

Starting from the design of an ideal drug carrier，smart redox-degradable and tumor-targeted polymericnanocarrierwasfabricatedbyintroducingfunctionalmonomersandusingMichael addition polymerization and material surface modification.Firstly，redox-degradable hyperbranched polyamidoamine（DHPAA）was prepared by Michael addition polymerization taking N，N＇-bis （acryloyl）cystamine and 1-（2-aminoethyl）piperazine as functional monomer.On this basis，graft copolymerization of polyethylene glycol and conjugation of folic acid were conducted on DHPAA to obtain stable and tumor-targeted smart hyperbranched polyamidoamine（FA-DHPAP）.The structure andperformanceofpolymerDHPAAwerecharacterizedbyFTIR， NMR， DLS， Zeta potentiometer，Raman spectrometer and GPC.The structure and performance of polymer FADHPAP were characterized by NMR，DLS，Zeta potentiometer and TEM.The biocompatibility of the polymer DHPAA and FA-DHPAP as drug carrier was further confirmed by cytotoxicity test. The results showed that the smart hyperbranched polyamidoamine（FA-DHPAP）is environmentresponsive and has good biocompatibility，thus it has great potential to be used as drug carrier for the tumor therapy.

hyperbranched polyamidoamine；redox-degradable；tumor-targeted；drug vehicle

A

1674-5124（2016）07-0053-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.07.011

2016-02-28；

2016-04-02

2014年度太倉市科技計劃應(yīng)用基礎(chǔ)項目（TC2014YY02）；2016年度江蘇省高校自然科學(xué)基金面上項目（16KJB430037）

王楊（1979-），女，江蘇連云港市人，講師，博士，主要從事高分子功能材料的研究。