楊小帆，宋麗菊，齊盼盼，吳道艷，閔　霞，李彩云，彭靜珊，趙　建

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源微生物及微生物生物技術(shù)重點實驗室，四川 成都 610064）

Pyrrosia petiolosa內(nèi)生細菌篩選及其抑菌活性物質(zhì)分析

楊小帆，宋麗菊，齊盼盼，吳道艷，閔霞，李彩云，彭靜珊，趙建

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源微生物及微生物生物技術(shù)重點實驗室，四川 成都 610064）

為探究Pyrrosia petiolosa內(nèi)生細菌的抑菌活性，采用植物組織分離和微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)法從其根、莖、葉共分離檢測到內(nèi)生細菌14株。通過濾紙片抑菌法篩選兩株有顯著抑菌活性的內(nèi)生細菌G7、Y12，并借助GC-MS技術(shù)對這兩株內(nèi)生細菌進行抑菌活性成分檢測與分析。研究表明：兩株內(nèi)生細菌經(jīng)16S rDNA測序比對分別鑒定為Lysinibacillus sphaericus C3-41和Bacillus amyloliquefaciens FZB42。生長曲線測定結(jié)果顯示菌株G7、Y12分別在16h和12h后進入穩(wěn)定期。GC-MS檢測鑒定到兩株內(nèi)生細菌發(fā)酵上清抑菌活性物質(zhì)主要是有機酸類和2，5-二酮哌嗪衍生物。該研究可為挖掘P.petiolosa內(nèi)生細菌藥物活性、篩選抗菌藥物新來源提供參考。

有柄石韋；內(nèi)生細菌；抑菌活性；GC-MS檢測；代謝產(chǎn)物

0　引　言

有柄石韋（Pyrrosia petiolosa（Christ）Ching）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為水龍骨科石韋屬植物，其味苦、甘，性微寒，含里白烯、β-谷甾醇、蔗糖、綠原酸、黃酮、芒果甙、木犀草素等多種活性成分［1］。P.petiolosa主治哮喘、肺膿瘍、腎炎水腫、膀胱炎、泌尿系結(jié)石、咯血、吐血和尿血等臨床病癥［2］，有鎮(zhèn)咳祛痰、降低血糖活性、抗病毒、抑菌消炎、增強免疫力等作用［3］，是復(fù)方石韋膠囊的一味重要中藥材。P.petiolosa在中國東北、華北、西北、西南和長江中下游地區(qū)均有分布，朝鮮和俄羅斯也有少量分布，是石韋中藥材的主要基源植物。P.petiolosa多系野生，該屬植物大多數(shù)附生于樹上或巖石上，少數(shù)生于土中，而且其人工培育對于土壤、排水、光照等條件要求苛刻［4］。目前，在國內(nèi)外尚無關(guān)于P.petiolosa快速繁殖的報道，無節(jié)制的開采利用最終將導(dǎo)致P.petiolosa資源的枯竭。

植物內(nèi)生細菌生活在健康植物的根、莖、葉、果實等組織中，與植物形成互利共生，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然組成成分，具有作為植物次生代謝物基因工程生產(chǎn)菌的潛力，也是一個巨大的抗菌活性物質(zhì)庫，應(yīng)當(dāng)予以充分開發(fā)［5］。Abdallah等［6］從光煙草（Nicotiana glauca）中分離到的內(nèi)生細菌對鐮刀菌萎蔫病有生防作用并能促進西紅柿生長。Kukla等［7］研究發(fā)現(xiàn)多年生黑麥草（Lolium perenne）中內(nèi)生細菌的多樣性具有降解石油烴類和促進植物生長的潛能。Ma等［8］研究證明伴礦景天（Sedum plumbizincicola）內(nèi)生細菌能夠吸附重金屬離子，修復(fù)污染的土壤。因此，開展P.petiolosa內(nèi)生細菌的研究，尋找其藥用功能替代菌，為合理開發(fā)P.petiolosay藥用和內(nèi)生細菌資源具有重要的意義。

醫(yī)院調(diào)查報告顯示：手術(shù)和創(chuàng)傷傷口感染的細菌中，大腸桿菌（Escherichia coli）所占的比例為50%，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）所占的比例為16.67%［9］。另外，藤黃微球菌（Micrococcus luteus）可引起傷口等局部組織感染，腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）也是目前世界上最常見的食源性病原菌之一［10］。本實驗探究了P.petiolosa內(nèi)生細菌對這4株病源微生物的抑菌作用并檢測分析其抑菌活性物質(zhì)，對于挖掘有抑菌活性的內(nèi)生細菌并提取其有效物質(zhì)具有參考價值。

1　材料和方法

1.1材料

新鮮P.petiolosa根、莖、葉，采自四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣綿虒鎮(zhèn)，由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鑒定，于采集后24h內(nèi)進行內(nèi)生細菌的分離。

供試細菌：腸炎沙門氏菌（S.enteritidis）、藤黃微球菌（M.luteus）、大腸桿菌 （E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus），均由四川省資源微生物與微生物生物技術(shù)重點實驗室保藏。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生細菌分離

將采集的新鮮P.petiolosa的根、莖、葉表面以無菌水沖洗干凈，依次用75%（ν∶ν）的酒精溶液浸泡2 min，有效氯5.2%的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水沖洗6～8次，然后用無菌剪刀切成2～3cm的小段，切口向下分別置于LB培養(yǎng)基平板上，以最后一次的洗滌水和表面滅菌的完整植株材料為對照，37℃培養(yǎng)3～7 d，根據(jù)菌株的形態(tài)、生長速度依次分離并于4℃保存［11］。

1.2.2內(nèi)生細菌發(fā)酵液預(yù)處理

將分離得到的細菌菌株接種至300 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h。之后將細菌發(fā)酵液5 000 r/min，離心2 min，收集發(fā)酵液上清（菌體沉淀備用），加入等體積的乙酸乙酯室溫震蕩過夜。菌體沉淀用PBS洗滌、重懸，并進行超聲破壁（功率120W，超聲4 s，停4 s，400個循環(huán)），破壁后的菌懸液加入等體積的乙酸乙酯室溫震蕩過夜。使用分液漏斗萃取分離發(fā)酵液上清和菌體沉淀的乙酸乙酯過夜浸泡液，得到乙酸乙酯上層萃取液，利用R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）分別真空濃縮至10mL制備成待測樣品溶液。將發(fā)酵液上清、菌體沉淀、LB培養(yǎng)基的乙酸乙酯提取液（酯提液）分別用0.22μm濾頭過濾備用。

1.2.3內(nèi)生細菌產(chǎn)物抑菌活性測定

采用濾紙片抑菌法檢測內(nèi)生細菌的抑菌活性。將過夜活化的4株供試菌株用無菌水稀釋至濁度為0.5個麥氏單位（108CFU/mL），取100μL菌懸液涂布至LB平板。濾紙片置于涂布供試菌的平板表面后，將待測樣品分別加樣50μL于濾紙片上，37℃恒溫培養(yǎng)16h后測量抑菌圈直徑，其中乙酸乙酯和LB培養(yǎng)基酯提液作為對照組。

1.2.4內(nèi)生細菌16S rDNA序列測定與分子鑒定

使用細菌基因組提取試劑盒（Tian Gen）提取內(nèi)生細菌的基因組DNA，PCR儀 （Analytik Jena，Easy Cycler 96）進行16S rDNA擴增。以27F（5＇-AGAGTT TGATCCTGGCTC-3＇）、1492R（5＇-CTACGGCTACCTT GTTACGA-3＇）為16S rDNA引物。50μL反應(yīng)體系：Premix TaqRVersion 2.0（TaKaRa，Japan）25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR擴增條件：94℃ 5min；94℃變性30s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。對16S rDNA PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行測序，結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對鑒定細菌種屬。

1.2.5內(nèi)生細菌生長曲線測定

將過夜活化的內(nèi)生細菌接種于6mL LB液體試管內(nèi)37℃、160 r/min培養(yǎng)0～24 h，每兩小時取樣使用紫外分光光度計（UV-Probe，日本島津公司）測定發(fā)酵液OD600nm的吸光度。

1.2.6內(nèi)生細菌發(fā)酵液GC-MS檢測與抑菌活性物質(zhì)分析

過濾除菌的待測樣品使用QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，日本島津公司）進行活性成分檢測。儀器設(shè)置：柱箱溫度40℃；進樣溫度290℃；壓力49.5kPa；程序性升溫，40℃保持5min，以10℃/min升至100℃，保持5min，以5℃/min升至225℃，保持5min，以5℃/min升至250℃，保持2min，以10℃/min升至300℃，保持10min；總流量19.0mL/min；柱流量1.00mL/min；線速度36.1cm/s；吹掃流量3.0mL/min；分流比15∶1。

1.2.7統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以均值±標準誤差表示，采用SPSS Statistics V17.0軟件的One-way ANOVA進行方差分析，P≤0.05視為具有顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生細菌分離

從P.petiolosa的根（G）、莖（J）、葉（Y）中分離到內(nèi)生細菌 G1，G3，G4，G5，G6，G7，G8，G9，G21，J2，J4，J11，Y11，Y12共14株，其中根部9株，莖部3株，葉部2株。根部分離到的內(nèi)生菌株數(shù)最多，占總菌株數(shù)的64.3%。

2.2內(nèi)生細菌產(chǎn)物抑菌活性測定

對P.petiolosa中分離到的14株內(nèi)生細菌進行發(fā)酵液抑菌活性的測定，篩選得到內(nèi)生菌株G7、Y12，利用濾紙片抑菌法對兩株內(nèi)生細菌發(fā)酵液、發(fā)酵液乙醇提取液（醇提液）、發(fā)酵液酯提液進行抑菌活性檢測，結(jié)果表明菌株G7、Y12發(fā)酵液酯提液抑菌效果最顯著。菌株G7、Y12發(fā)酵液酯提液與對照組相比，對4株供試菌株均有顯著的抑菌活性（P≤0.05）（見表1）。其中，G7發(fā)酵上清酯提液對S.aureus抑菌圈直徑達到（11.667±0.675）mm，Y12發(fā)酵上清酯提液對E.coli抑菌圈直徑達到 （14.697±1.874）mm，說明這兩株內(nèi)生細菌發(fā)酵上清酯提液均對手術(shù)和創(chuàng)傷感染的主要病原菌具有顯著的抑菌作用。同時，菌株G7、Y12發(fā)酵上清酯提液相比于菌體沉淀酯提液對4株供試菌株均具有更顯著的抑菌活性（P≤0.05），說明內(nèi)生細菌G7、Y12的抑菌活性物質(zhì)主要為胞外分泌物，并且可溶于乙酸乙酯。

2.3內(nèi)生細菌16S rDNA序列測定與分子鑒定

基于抑菌活性的研究，篩選得到菌株G7、Y12后，對其16S rDNA進行序列測定。內(nèi)生菌株G7、Y12 的16S rDNA堿基大小分別為1 417 bp和1 427 bp，通過序列比對發(fā)現(xiàn)菌株G7、Y12分別與球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus C3-41）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens FZB42）具有99%以上的序列同源性（見表2）。

表1　內(nèi)生細菌G7、Y12產(chǎn)物對供試細菌的抑菌圈直徑1）-2）mm

表2　菌株G7、Y12 16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對結(jié)果

2.4內(nèi)生細菌生長曲線測定

為對兩株內(nèi)生細菌的生長狀態(tài)有更加明確的認識，繪制了內(nèi)生細菌的生長曲線（見圖1）。在0～24h內(nèi)，G7菌株的延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期分別為0～4 h，4～16 h，16～20 h，20～24 h；Y12菌株的延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期分別為0～4 h，4～12 h，12～20h，20～24h。

2.5內(nèi)生細菌發(fā)酵液GC-MS檢測與抑菌活性物質(zhì)

分析

由抑菌結(jié)果可知，兩株內(nèi)生細菌發(fā)酵上清酯提液相比于菌體沉淀酯提液對4株供試菌株具有更顯著的抑菌活性（P≤0.05），因此對這兩株內(nèi)生細菌的發(fā)酵上清酯提液進行GC-MS檢測。菌株G7、Y12發(fā)酵上清酯提液分別檢測到78，75個峰。在去除LB培養(yǎng)基酯提液所得到的物質(zhì)后，菌株G7、Y12發(fā)酵上清酯提液中分別檢測到33，32種物質(zhì)（見表3、表4）。對GC-MS檢測得到的物質(zhì)進行成分分析，發(fā)現(xiàn)物質(zhì)種類主要為酯類、酸類、醇類、酮類、烷烴類、芳香烴類、哌嗪類、酰胺類（如圖2所示）。在G7菌株發(fā)酵上清酯提液中，相對含量較多的物質(zhì)類別為酮類、哌嗪類、烷烴類，分別占總物質(zhì)的15.43%、4.57%、3.69%，其物質(zhì)種類也相對豐富。其中，3-羥基-3-甲基-2-丁酮含量最高，為13.17%，可用于醫(yī)藥中間體的研發(fā)合成和生產(chǎn)。在Y12菌株發(fā)酵上清酯提液中，相對含量最多的物質(zhì)為酸類、烷烴類、醇類，分別占總物質(zhì)的8.20%、3.22%、1.70%；數(shù)量最多的物質(zhì)為酸類、烷烴類、哌嗪類，其中，有機酸3-甲基-異戊酸含量最高，占總物質(zhì)的6.51%，可用于制藥和香料合成。

圖1　內(nèi)生細菌G7、Y12的生長曲線

表3　菌株G7發(fā)酵上清酯提物GC-MS檢測

3　討　論

P.petiolosa作為重要的中藥資源，已有諸多報道稱其具有消炎利尿、清濕熱等功能，且其化學(xué)成分和藥理活性也得到了深入的研究［1，12-13］，但對于P.petiolosa內(nèi)生細菌發(fā)酵液的抑菌活性和有效成分的檢測還未見報道。本研究從P.petiolosa的根、莖、葉共檢測得到14株內(nèi)生細菌，通過對其進行抑菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)菌株 G7、Y12發(fā)酵上清酯提液對于4株供試菌株均具有顯著的抑菌效果，分別鑒定為L.sphaericusC3-41、B.amyloliquefaciens FZB42。已有文獻報道L.sphaericus是目前研究最為深入，在我國應(yīng)用最廣泛的生物殺蟲劑［14］，B.amyloliquefaciens具有較強次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力，可以產(chǎn)生多種抑菌相關(guān)的代謝產(chǎn)物［15］，而對于它們的發(fā)酵上清酯提液抑菌活性分析和活性物質(zhì)檢測還是首次研究。

表4　菌株Y12發(fā)酵上清酯提物GC-MS檢測

圖2　菌株G7、Y12發(fā)酵上清酯提液物質(zhì)分析

本研究利用GC-MS技術(shù)檢測了菌株G7、Y12發(fā)酵上清酯提液的物質(zhì)成分，其中酮類、烷烴類、酸類、哌嗪類化合物的相對含量較高，物質(zhì)種類也相對較多，酸類物質(zhì)主要為有機酸，哌嗪類物質(zhì)主要為2，5-二酮哌嗪衍生物。已有研究報道稱云杉針葉水提物及松針醇提取物中主要抑菌物質(zhì)為有機酸［16-17］。有機酸可作為牛肉輔料添加劑抑制大腸桿菌等病原微生物［18］，并且在一定濃度下對常見的細菌和真菌有良好的抑制作用，尤其對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和華根霉的抑制效果較為明顯［19］。2，5-二酮哌嗪衍生物不僅具有廣譜的抗菌活性，能顯著降低多種抗生素對多種耐藥菌的最低抑制濃度，從而恢復(fù)實驗細菌對相應(yīng)抗生素的敏感性［20］；同時具有抗腫瘤、脫癮與解毒活性，可保護神經(jīng)元，改善腦功能，對心血管系統(tǒng)和細胞間信號傳導(dǎo)也有重要的作用；還可作為植物生長調(diào)節(jié)劑［21］。綜上所述，G7菌株發(fā)酵上清酯提液抑菌活性物質(zhì)主要包括有機酸類1.16%，2，5-二酮哌嗪衍生物4.57%。Y12發(fā)酵上清菌株酯提液抑菌活性物質(zhì)主要包括有機酸類8.2%，2，5-二酮哌嗪衍生物1.37%。

4　結(jié)束語

本研究成功篩選到的兩株P(guān).petiolosa內(nèi)生細菌L.sphaericus C3-41和B.amyloliquefaciens FZB42，對手術(shù)和創(chuàng)傷傷口感染以及食源性污染主要病原菌具有顯著的抑制效果。研究結(jié)果對于挖掘具有臨床醫(yī)學(xué)意義的工程菌、開發(fā)有機酸類和2，5-二酮哌嗪衍生物等抗菌藥物、合理利用P.petiolosa等中藥資源具有參考價值。

［1］王楠，王金輝，程杰，等.有柄石韋的化學(xué)成分［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2003，20（6）：425-427.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：85-86.

［3］陳露，劉布鳴，馬軍花，等.中藥石韋的研究概況［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2011，33（11）：1486-1489.

［4］韋悅，高德民.有柄石韋栽培技術(shù)［J］.特種經(jīng)濟動植物，2013（2）：33-33.

［5］畢江濤，楊薇，李萍，等.瀕危藥用植物沙冬青內(nèi)生細菌分離及其抑菌活性初步分析［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013（12）：1621-1626.

［6］ABDALLAH R A B，MOKNI-TLILI S，NEFZI A，et al. Biocontrol of Fusarium wilt and growth promotion of tomato plants using endophytic bacteria isolated from Nicotiana glauca organs［J］.Biological Control，2016（97）：80-88.

［7］KUKLA M，PLOCINICZAK T，PIOTROWSKA-SEGET Z. Diversity of endophytic bacteria in Lolium perenne and their potential to degrade petroleum hydrocarbons and promote plant growth［J］.Chemosphere，2014，117（1）：40-46.

［8］ MA Y，RUI S，NAI F，et al.The hyperaccumulator Sedum plumbizincicola harbors metal-resistant endophytic bacteria that improve its phytoextraction capacity in multi-metal contaminatedsoil［J］.Journal of Environmental Management，2015（156）：62-69.

［9］馬文義，馬志元.普通外科手術(shù)后傷口易感染菌株鑒定及客觀因素分析［J］.醫(yī)藥前沿，2012（26）：55-56.

［10］尹德鳳，張莉，張大文，等.食品中沙門氏菌污染研究現(xiàn)狀［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，27（11）：55-60.

［11］劉洋露，張杰，楊志榮，等.金銀花中產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生細菌的分離與鑒定［J］.四川大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，51 （3）：603-608.

［12］HSU C Y.Antioxidant activity of Pyrrosia petiolosa［J］. Fitoterapia，2008，79（1）：64-66.

［13］CHENG D，ZHANG Y，GAO D，et al.Antibacterial and anti-inflammatory activities of extract and fractions from Pyrrosia petiolosa（Christ et Bar.）Ching［J］.Journal of Ethnopharmacology，2014，155（2）：1300-1305.

［14］付蒙穎，王英，鐘敏，等.生物殺蟲劑球形賴氨酸芽孢桿菌的研究進展［J］.寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報，2014，21（3）：215-220.

［15］代森.解淀粉芽孢桿菌抑菌物質(zhì)分離和調(diào)控研究 ［D］.天津：南開大學(xué)，2011.

［16］李珍，林國秀，羅盛蓮，等.青藏高原云杉針葉水提物抑菌作用研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2012，14（3）：138-144.

［17］王經(jīng)洋，李姝，楊小帆，等.松針提取物抑制病原菌作用研究及成分分析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2015（2）：275-277.

［18］MOHAN A，POHLMAN F.Role of organic acids and peroxyacetic acid as antimicrobial intervention for controlling Escherichia coli O157：H7 on beef trimmings［J］. LWT-Food Science and Technology，2016（65）：868-873.

［19］梁盛年，段志芳，王志娟，等.香蕉皮中有機酸的提取及抑菌作用研究［J］.食品工業(yè)科技，2007（8）：73-76.

［20］STROM K，SJOGREN J，BROBERG A，et al.Lactobacillus plantarum Mi LAB 393 produces the antifungal cyclic depeptides cyclo（L-Phe-L-Pro）and cyclo（LPhe-trans-4-OH-L-Pro）and 3-phenyllactic acid［J］. Appl Environ Microbiol，2002，68（9）：4322-4327.

［21］劉友濤.幾種2，5-二酮哌嗪類化合物的合成及其生物活性研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.

（編輯：莫婕）

Screening of endophytic bacteria in Pyrrosia petiolosa and analysis of its antimicrobial active ingredients

YANG Xiaofan，SONG Liju，QI Panpan，WU Daoyan，MIN Xia，LI Caiyun，PENG Jingshan，ZHAO Jian
（Key Laboratory of Microbiological Resource and Technology，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

In order to study antimicrobial activity of endophytic bacteria in Pyrrosia petiolosa，plant tissue separation and traditional microbial culture methods were employed，by which fourteen bacteria strains were isolated from the roots，stems and leaves of P.petiolosa.Endophytic bacteria G7 and Y12 were screened out due to their significant antimicrobial activity through filter paper bacteriostatic method.The antimicrobial active ingredients were detected and analyzed by GC-MS technology.Strains G7 and Y12 were identified as Lysinibacillus sphaericus C3-41 and Bacillus amyloliquefaciens FZB42 respectively according to the 16S rDNA sequence analysis.Growth curves of strains G7 and Y12 showed that the stationary phase begins after 16h and 12h，respectively. The antimicrobial active materials mainly consisted of organic acids and 2，5-piperazinedione derivative through GC-MS detection.The study laid an research foundation for discovering the pharmaceutical activity of endophytic bacteria in P.petiolosa and screening a new source of antimicrobial agents.

P.petiolosa；endophytic bacteria；antimicrobial activity；GC-MS analysis；metabolites

A

1674-5124（2016）07-0047-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.07.010

2016-02-03；

2016-03-10

國家自然科學(xué)基金（31270175）；教育部新世紀人才和川大優(yōu)秀青年學(xué)者項目（NCET-13-0397，2013SCU04B14）

楊小帆（1991-），女，湖北安陸市人，碩士研究生，專業(yè)方向為資源微生物應(yīng)用。

趙建（1976-），男，江蘇揚州市人，教授，博士，主要從事資源微生物及微生物天然免疫研究。