羅　丹，吳　俊，全學(xué)軍，戴　亞，馬擴(kuò)彥

(1.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶　400054；2.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，重慶　400062)

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淀粉類酶降解烤煙中淀粉的研究

羅丹1，吳俊1，全學(xué)軍1，戴亞2，馬擴(kuò)彥2

(1.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶400054；2.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，重慶400062)

摘要：以云煙85為原料，為降低烤煙中淀粉含量，研究了外加α-淀粉酶和糖化酶對(duì)淀粉降解的影響。結(jié)果表明：外加淀粉類酶能有效降低烤煙中的淀粉含量。未處理前云煙85直鏈淀粉含量約為1.42%，支鏈淀粉約為2.67%。淀粉類酶混合液處理8 h后，直鏈淀粉減少了約34.5%，支鏈淀粉減少了約66.7%。采用掃描電鏡對(duì)原樣、緩沖液處理樣品以及淀粉類酶處理樣品進(jìn)行了觀察分析，結(jié)果表明：酶處理前后煙葉組織結(jié)構(gòu)有較大變化，酶處理之后煙葉組織結(jié)構(gòu)由于淀粉降解而出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象，從而呈現(xiàn)大面積的凹凸不平區(qū)域。

關(guān)鍵詞：煙草;淀粉；淀粉類酶；表面微結(jié)構(gòu)

淀粉是煙草生長過程中積累的重要碳水化合物，廣泛存在于煙草的莖葉中。新鮮煙葉經(jīng)過調(diào)制，大部分淀粉降解為還原糖，但處理后的煙葉仍殘留一定量的淀粉。一些研究表明[1-3]：煙葉中淀粉含量較高將會(huì)影響燃吸速度，產(chǎn)生較多有害成分，對(duì)煙草的色、香、味產(chǎn)生不良影響。近年來，我國烤煙水平不斷提高，但與進(jìn)口煙相比在其內(nèi)在的化學(xué)組成協(xié)調(diào)性等方面還存在著較大差異。目前，我國烤煙中淀粉含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))約為4%～6%，而國外優(yōu)質(zhì)烤煙淀粉含量僅為1%～2%[4]。因此，進(jìn)一步研究降解烤煙中的淀粉，對(duì)提高我國煙草產(chǎn)品品質(zhì)具有重要的意義。

近年來，利用外加酶制劑降低煙葉中的淀粉，以提高煙葉的品質(zhì)已成為煙葉發(fā)酵研究的熱點(diǎn)。煙草在烘烤過程中外加淀粉類酶能有效降解煙草中淀粉，向烤后煙葉中加入一定量的糖化酶和α-淀粉酶，能有效將淀粉降解為水溶性糖[5-7]。然而，大多數(shù)研究只考察了糖化酶和α-淀粉酶對(duì)煙草總淀粉的降解情況，而沒有對(duì)糖化酶和α-淀粉酶處理之后的煙葉中淀粉組成以及煙草組織結(jié)構(gòu)的變化情況進(jìn)行研究。本研究采用高氯酸超聲提取淀粉[8]結(jié)合雙波長法[9-10]測定了淀粉類酶處理前后煙葉中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量，并考察了淀粉類酶處理前后煙葉組織結(jié)構(gòu)的變化情況。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

云煙85烤煙葉C3F， 2012年產(chǎn)于四川涼山州西昌市，由重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供；直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)樣品，美國Sigma公司出品；α-淀粉酶(活力為30μg/mg)和糖化酶(活力為120μg/mg)，美國Sigma公司出品；無水乙醇、氯化鈉、高氯酸、氫氧化鈉、碘、碘化鉀，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。

電子分析天平，感量為0.000 1g，梅特勒-托利多儀器上海有限公司出品；超聲清洗器(KQ-400KDE)，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；精密酸度計(jì)(pH-3S)，南京桑力電子廠生產(chǎn)；雙光束紫外可見分光光度計(jì)(TU-1901)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；掃描電鏡(JSM-6460LV)，日本電子株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1樣品預(yù)處理

配制NaH2PO4·2H2O緩沖溶液，添加70mg/L的Ca2+濃度，調(diào)節(jié)pH值至5.45。加入淀粉類酶，配制成12μg/mL的a-淀粉酶溶液和48μg/mL糖化酶溶液[11-12]。以煙葉質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入量為α-淀粉酶15μg/g、糖化酶150μg/g，在55℃恒溫水浴鍋中恒溫一定時(shí)間，取處理之后煙葉清水沖洗，40 ℃烘干，再進(jìn)行淀粉含量測定及電鏡掃描。

1.2.2淀粉含量測定方法

實(shí)驗(yàn)流程：煙草粉粹→過篩(40～100目)→除雜(飽和NaCl-乙醇溶液)→過濾(取濾渣)→提取(高氯酸溶液)→過濾(取濾液、淀粉提取液)→顯色反應(yīng)(I2/KI溶液)→測吸光度。最后根據(jù)對(duì)應(yīng)波長所測定的吸光度計(jì)算支鏈淀粉和直鏈淀粉的提取率。

配制直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液：稱取直鏈淀粉純品0.100 0g，置于100mL燒杯中，加入5mL1mol/LNaOH溶液，待溶解后轉(zhuǎn)移到容量瓶中，加蒸餾水定容至100mL，即為1mg/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

配置支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液：用0.100 0g支鏈淀粉按上述方法制備成1mg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3和1.5mL(1mg/mL) 直鏈淀粉貯備溶液，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0和4.5mL(1mg/mL)支鏈淀粉貯備溶液，分別加入到50mL容量瓶中，加入蒸餾水30mL稀釋，將1.5mL高氯酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%)、氫氧化鈉溶液(2.5mol/L)調(diào)節(jié)pH值至3.5左右，加0.6mLKI(0.2gI2/2g)溶液，用蒸餾水定容至刻度，在室溫下顯色15min。以蒸餾水作空白，選定波長檢測其吸光度。

1.2.3煙葉組織結(jié)構(gòu)觀察

采用日本JSM-6460LV掃描電鏡，將酶處理前后的處理煙葉平鋪于載樣臺(tái)上，按照常規(guī)方法噴金處理。噴金后樣品直接放入掃描顯微樣品室進(jìn)行觀察。掃描中采用5.00kV的加速電壓。

2　結(jié)果與討論

2.1直鏈和支鏈淀粉的測定方法

用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)對(duì)直鏈淀粉和支鏈淀粉掃描，掃描光譜如圖1所示。根據(jù)雙波長法原理，選定波長具備2個(gè)特征：一是待測組分在選擇的測定波長上的吸光度差值較大；二是共存組分在測定波長應(yīng)具有相同的吸收值，使其濃度變化不影響測定結(jié)果[13]。直鏈淀粉測定波長為510nm和590nm，支鏈淀粉測定波長為550nm和702nm。

圖1　支鏈淀粉和直鏈淀粉測定參比波長

直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)雙波長原理在波長510nm和590nm測定吸光度值，以直鏈淀粉含量為橫坐標(biāo)，ΔA=(A590nm-A510nm)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。得直鏈淀粉回歸方程為：Y1=0.008 22X1+0.010 29，R2=0.996 9。在(5～30)mg/L線性良好。

支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線：在波長550nm和702nm測定吸光度值，以支鏈淀粉含量為橫坐標(biāo)，ΔA=(A550nm-A702nm)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。得到支鏈淀粉回歸方程為：Y2=0.002 65X2+0.008 19，R2=0.995。在40～90mg/L線性良好。

圖2　直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2酶處理前后淀粉含量分析

按照以上建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙波長法測定烤煙原樣以及酶處理之后煙葉中淀粉含量，檢測結(jié)果如表1所示。未經(jīng)過任何處理的云煙85烤后煙葉中直鏈淀粉含量約為1.42%，支鏈淀粉約為2.67%。煙葉經(jīng)過α-淀粉酶和糖化酶混合溶液，在55 ℃水浴鍋中浸泡降解8h后，直鏈淀粉和支鏈淀粉均有減少，其中直鏈淀粉減少了約34.5%，支鏈淀粉減少了約66.7%。這可能是因?yàn)橹ф湹矸墼诿附膺^程中整個(gè)側(cè)鏈斷開而形成新的直鏈淀粉[14]，因此在整個(gè)酶解過程中支鏈淀粉的降解速度更快。采用雙光束紫外可見分光光度計(jì)(TU-1901)對(duì)淀粉類酶處理煙葉的淀粉提取液與KI(0.2gI2/2g)溶液的顯色溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖4所示。由吸收光譜可以看出：相同質(zhì)量煙葉酶處理前的吸收峰明顯高于酶處理之后的吸收峰，這表明α-淀粉酶和糖化酶對(duì)烤煙中的淀粉的降解有較好的效果。此外，酶處理后的最大吸收峰波長由處理前的591nm移向603nm，這主要因?yàn)樵茻?5酶處理前淀粉支鏈含量∶直鏈含量為1.88∶1，酶處理之后為1∶1.05，而直鏈淀粉的最大吸收峰為620nm，支鏈淀粉的最大吸收峰為560nm[15]，因此酶降解處理之后的淀粉提取液與KI(0.2gI2/2g)溶液顯色的最大吸收峰波長向高波長(直鏈淀粉最大吸收峰波長)移動(dòng)。

表1　烤煙中酶處理前后淀粉含量

圖4　酶處理前后淀粉測定的吸收光譜圖

2.3煙葉組織結(jié)構(gòu)變化情況分析

圖5分別為云煙85原樣、緩沖液處理樣品以及酶處理樣品的掃描電鏡圖。由圖5(a)、(b)可以看出：未經(jīng)過緩沖液和酶液處理烤煙呈現(xiàn)出大量不規(guī)則、表面光滑的編織狀溝槽紋理結(jié)構(gòu)[16]。圖5(c)、(d)為緩沖液浸泡處理8h后的煙葉組織電鏡圖，對(duì)比緩沖液處理前后，處理之后煙葉表面光滑凸起結(jié)構(gòu)消失，變成扁平狀結(jié)構(gòu)，裸露出少量纖維痕跡。這主要因?yàn)榭緹熃?jīng)過緩沖液浸泡以及清水的沖洗使組織中部分水溶性物質(zhì)溶解流失，從而導(dǎo)致原有凸起結(jié)構(gòu)發(fā)生變化形成扁平狀。圖5(e)、(f)為云煙85在α-淀粉酶15μg/g和糖化酶150μg/g混合液中浸泡處理8h后的煙葉組織掃描電鏡圖。酶液處理后的煙葉組織結(jié)構(gòu)和原樣結(jié)構(gòu)相比，表面光滑的編織狀溝槽紋理結(jié)構(gòu)幾乎全部消失，與緩沖液浸泡處理烤煙結(jié)構(gòu)相比扁平區(qū)域出現(xiàn)嚴(yán)重的凹凸不平現(xiàn)象，且呈現(xiàn)出更多的纖維線狀結(jié)構(gòu)。這可能因?yàn)榈矸垲惷傅募尤胧篃熑~中部分淀粉降解轉(zhuǎn)化成水溶性糖類溶解流失[17-18]，從而使原有的淀粉組織部位出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象，形成大量雜亂凹凸不平區(qū)域。

3　結(jié)束語

本研究用α-淀粉酶和糖化酶處理云煙85烤后煙葉，對(duì)處理前后煙葉的淀粉含量以及煙葉的組織結(jié)構(gòu)變化情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：α-淀粉酶和糖化酶處理云煙85，使直鏈淀粉減少約34.5%，支鏈淀粉減少約66.7%。淀粉類酶溶液對(duì)煙葉組織結(jié)構(gòu)也有較大的影響；未經(jīng)處理的煙葉組織呈現(xiàn)出大量不規(guī)則的、表面光滑的溝槽紋理結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過淀粉類酶液處理之后的煙葉表面光滑的溝槽紋理結(jié)構(gòu)幾乎全部消失，且在淀粉降解部位出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象，有大面積凹凸不平區(qū)域。煙草中淀粉的減少與組織結(jié)構(gòu)的變化對(duì)于煙草制品品質(zhì)的提高應(yīng)該具有較好的改善作用。

圖5　云煙85組織結(jié)構(gòu)電鏡掃描圖

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(責(zé)任編輯劉舸)

收稿日期：2016-05-16

基金項(xiàng)目：重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目“煙草中淀粉的存在形態(tài)及其分析方法研究”(hx201314)

作者簡介：羅丹(1989—)，女，重慶人，碩士研究生，主要從事材料化學(xué)研究。

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.07.011

中圖分類號(hào)：TS411.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-8425(2016)07-0064-05

EffectsofAmylasesonDegradationofStarchinFlue-CuredTobaccoLeaves

LUODan1，WUJun1，QUANXue-jun1，DAIYa2，MAKuo-yan2

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ChongqingUniveristyofTechnology,Chongqing400054,China；2.ChinaTobaccoChongqingIndustrialCo.,Ltd.,

Chongqing400062,China)

Abstract:The effects of amylases on the degradation of starch in flue-cured tobacco leaves were investigated using Yunyan 85 as the raw material in order to reduce the content of starch in flue-cured tobacco leaves. Results show that applying amylases to degrade starch in flue-cured tobaccos leaves was effective. Before treatment, the amylose and amylopectin contents in Yunyan 85 are 1.42% and 2.67% respectively. After 8 h treatment of flue-cured tobaccos leaves, the amylose and amylopectin contents in the sample leaves were decreased by about 34.5% and 66.7%, respectively. Scanning electron microscopy (SEM) observation showed that amylase treatment caused greater changes in the texture of the flue-cured tobacco leaves, and the original smooth surface was turned into rugged surface with obvious cellulose substance.

Key words：tobacco; starch; amylases；surface micro-structure

引用格式：羅丹，吳俊，全學(xué)軍，等.淀粉類酶降解烤煙中淀粉的研究[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2016(7):64-68.

Citationformat：LUODan，WUJun，QUANXue-jun,etal.EffectsofAmylasesonDegradationofStarchinFlue-CuredTobaccoLeaves[J].JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience)，2016(7):64-68.