高武，吳勇

(1.國藥集團(tuán)精方(安徽) 藥業(yè)股份有限公司，安徽 宣城　242000；2.馬鞍山市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 馬鞍山　243000)

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高效液相色譜法測定硫酸阿托品的含量

高武1，吳勇2

(1.國藥集團(tuán)精方(安徽) 藥業(yè)股份有限公司，安徽 宣城242000；2.馬鞍山市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 馬鞍山243000)

摘要：目的建立一種用HPLC法測定硫酸阿托品含量的方法。方法色譜柱：Agilent Eclipse X DB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.05 mol·L-1KH2PO4溶液(含庚烷磺酸鈉0.002 5 mol·L-1)-乙腈(84∶16)(用磷酸或氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0)；檢測波長：225 nm;柱溫30℃；流速1.0 mL·min-1。結(jié)果硫酸阿托品在2.6425～42.48 mg·L-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為A=11 938C-1348 8，r=0.999 9(n=3)，回收率為：100.19%，RSD 為1.33% 。結(jié)論HPLC法操作簡單，可靠，準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性好。

關(guān)鍵詞：色譜法,高壓液相;阿托品;回收率

硫酸阿托品屬于莨菪堿類生物堿，是臨床上常用的處方藥，其作用原理主要是與毒蕈堿型膽堿受體(簡稱M受體)相結(jié)合，競爭性拮抗乙酰膽堿或其它膽堿受體激動(dòng)藥的作用。藥理作用主要表現(xiàn)減少腺體分泌、抑制胃腸道及膀胱平滑肌興奮、松弛瞳孔括約肌使瞳孔擴(kuò)大、升高眼壓、心率加快、治療量的阿托品可輕度興奮延髓及迷走神經(jīng)的興奮。臨床上常用于緩解各種內(nèi)臟絞痛，眼科擴(kuò)瞳用于驗(yàn)光配眼鏡、眼底檢查、治療虹膜睫狀體炎癥，全身麻醉前給藥用于減少腺體的分泌，治療緩慢型心律失常、各種感染性休克及有機(jī)磷類農(nóng)藥中毒的搶救[1-2]。硫酸阿托品使用不當(dāng)可引起不良反應(yīng)，故相關(guān)制劑研究較多，如有LC-MS、毛細(xì)管電泳、HPLC法等[3-6]，硫酸阿托品片及注射液標(biāo)準(zhǔn)收載于中國藥典，其含量測定方法為酸性染料比色法[7]，但實(shí)際操作過程中較繁瑣，且準(zhǔn)確性及重復(fù)性不高，因而建立更為簡便的液相色譜法，為相關(guān)的制劑含量測定作參考。

1　儀器與試藥

1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀， 2998檢測器，Empower 2色譜工作站(美國 waters 公司)；梅特勒AL-104電子天平，Sartorius BP211D電子天平，JK-2200 超聲儀(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)，METTLER TOLEDO FE 20 pH酸度計(jì)。

1.2試藥硫酸阿托品對(duì)照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100040-201011，供含量測定用，按(C17H23NO3)2·H2SO4計(jì)，含量為96.5%)，硫酸阿托品注射液與片劑為市場上抽查品種，水為純化水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件[2]色譜柱：Agilent Eclipse X DB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.05 mol·L-1KH2PO4溶液(含庚烷磺酸鈉0.0025 mol·L-1)-乙腈(84∶16)(用磷酸或氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0)；柱溫為30℃；檢測波長：225 nm;流速為1.0 mL·min-1。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液的制備將硫酸阿托品片劑碾碎，精密稱取供試品適量(約相當(dāng)于硫酸阿托品2.5 mg)，置50 mL容量瓶中，加30 mL水超聲使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。注射劑精密量取直接稀釋即可。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取硫酸阿托品對(duì)照品適量，置100 mL容量瓶中，加水60 mL超聲使溶解后，定容，搖勻，即制成對(duì)照品溶液(每1 mL約含100 μg的溶液)。

2.3測定法分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液于色譜用測試瓶中，進(jìn)樣量為20 μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得HLPC 色譜圖，見圖 1。

A.對(duì)照品

B.供試品 圖1　HPLC色譜圖

2.4系統(tǒng)適宜性按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，硫酸阿托品主峰應(yīng)與相鄰色譜峰的分離度符合要求，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于5 000。

2.5線性范圍考察取對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，以Waters自動(dòng)進(jìn)樣器分別進(jìn)樣5、10、20、30、40、60及80 μL，注入Waters液相色譜儀中，記錄硫酸阿托品的色譜圖，峰面積分別為46 487.67、100 044、227 664.5、345 772、469 653.3、700 985.3、939 798，以色譜圖中硫酸阿托品峰面積A為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度C(mg·L-1)為橫坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得硫酸阿托品的回歸方程為：A=11 938C-13488，r-0.9 999(n=3)，結(jié)果表明硫酸阿托品濃度在2.6425～42.48 mg·L-1范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6精密度試驗(yàn)取2.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，測得硫酸阿托品的色譜峰面積分別為224489、223916、230142、232629、227287、227524，RSD為1.46%，表明該方法精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次硫酸阿托品供試品溶液，分別在0、1、2、4、8及12h取樣測定，結(jié)果硫酸阿托品峰面積17500、18500、19580、19580、17580，RSD為0.26%，表明硫酸阿托品供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次硫酸阿托品供試品，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液 5 份，精密進(jìn)樣 20 μL進(jìn)行測定峰面積分別為289376、287531、291152、285531、290180，RSD 為0.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收試驗(yàn)取已知含量的硫酸阿托品供試品共 6 份，精密加入相同量的對(duì)照品溶液進(jìn)行平行操作，分別按樣品含量測定方法進(jìn)樣進(jìn)行測定，計(jì)算硫酸阿托品的回收率。結(jié)果見表 1。平均回收率為100.19%，RSD 為1.33% 。

表1　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.10樣品的含量測定按上述溶液的制備2.2項(xiàng)下的方法配制相應(yīng)的供試品溶液及對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣進(jìn)行測定，記錄相應(yīng)的硫酸阿托品色譜圖，按外標(biāo)法以硫酸阿托品的峰面積進(jìn)行計(jì)算，即得。結(jié)果見表2。

表2　樣品測定結(jié)果(n=3)

3　討論

硫酸阿托品片劑及注射液的含量測定采用酸性染料比色法，先用三氯甲烷提取，再用溴甲酚綠顯色，用紫外分光光度法測定，該操作比較繁瑣，且三氯甲烷毒性較大，不利于環(huán)保，用分液漏斗提取過程較復(fù)雜，測定過程中吸收波長不在給定波長處等影響因素較多，使得測定的結(jié)果重復(fù)性極差，因而對(duì)提高標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。

流動(dòng)相及色譜條件的選擇：參照相關(guān)文獻(xiàn)及中國藥典中硫酸阿托原料中有關(guān)物質(zhì)的測定方法，發(fā)現(xiàn)藥典中測原料有關(guān)物質(zhì)的色譜條件測硫酸阿托品含量更簡便可行，這與藥典中大多數(shù)藥品的含量測定與有關(guān)物質(zhì)的測定方法相同相吻合[8-10]。

本法測硫酸阿托品，同時(shí)用Agilent 1260及Kromasil C18，Hypersil C18色譜柱測定，均能取得相近的結(jié)果，說明本法適用性好。此外，測試中無其它雜質(zhì)峰的干擾，簡化了實(shí)驗(yàn)操作，與現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)相比[7]，本法操作更簡便，準(zhǔn)確度、精密度更高，可用于硫酸阿托品類相關(guān)藥品的質(zhì)量控制，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.016

(收稿日期：2016-02-11，修回日期：2016-04-09)

Determination of Atropine Sulfate by HPLC

GAO Wu1，WU Yong2

(1.SinopharmGroupJingfang(Anhui)PharmaceuticalCo.Ltd,Xuancheng,Anhui242000,China;2.Ma’anshanCenterforFoodandDrugInspection,Ma'anshan,Anhui243000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the analysis of Atropine Sulfate by HPLC.MethodsThecolumnwas Agilent Eclipse X DB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase consisted of 0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate solution(containing 0.002 5 mol·L-1sodium heptanesulfonate) -acetonitrile(84∶16)(the pH value adjusted to 5.0 by phosphoric acid or sodium hydroxide solution).The detection wavelength was set at 225 nm with a column temperature at 30℃,and the flow rate was 1.0 mL·min-1.ResultsThe linear range was 2.6425～42.48 mg·L-1.The regression equation was A=11 938C-13 488，r=0.9 999(n=3).The average recovery was 100.19% and RSD was 1.33%.ConclusionThis method of operation is simple,reliable,accurate and well reproducible.

Key words:Chromatography,high pressure liquid;Atropine;Retrieving rate