李宇，張蕾，鄧明影，張永煌，陳衛(wèi)東，史天陸

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥代動力學研究室，安徽 合肥　230031； 2.安徽省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥　230001)

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反相高效液相色譜法測定人血漿中伏立康唑的濃度

李宇1,2，張蕾2，鄧明影2，張永煌1,2，陳衛(wèi)東1，史天陸1,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥代動力學研究室，安徽 合肥230031； 2.安徽省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥230001)

摘要：目的建立反相高效液相色譜法(Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography,RP-HPLC)測定人血漿中伏立康唑的濃度。方法Syncronis C18柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm)；流動相：0.025 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液pH=5.25(加三乙胺62.5 μL)∶乙腈∶甲醇=35∶45∶20；流速：1.0 mL·min-1；紫外檢測波長260 nm；柱溫：30 ℃，以酮康唑為內(nèi)標，血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白，20 μL進樣檢測。結(jié)果伏立康唑血漿濃度在0.2～10 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LLOQ為0.2 mg·L-1，標準曲線為As=0.460 9C+0.0301(r2=0.999 6，n=5)，低濃度、中濃度、高濃度的日內(nèi)和日間變異RSD均小于7%，準確度范圍為98%～103%，提取回收率在86%～95%。穩(wěn)定性考察RSD<8%。結(jié)論本方法操作簡便，靈敏度和準確度均較高，穩(wěn)定性好，適用于伏立康唑血藥濃度檢測，為臨床實施伏立康唑的個體化藥物治療提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：色譜法,反相;伏立康唑;血藥濃度

伏立康唑是一種臨床療效非常確切和使用較廣泛的抗真菌藥物，主要用于治療嚴重的念珠菌和曲霉菌真菌感染[1-2]。與其他抗真菌藥物相比，伏立康唑的抗菌譜較寬，抗菌活性強，已成為治療深部真菌感染的一線藥物[3-4]。雖然伏立康唑的抗菌譜廣，有較高的抑菌活性，但體內(nèi)代謝呈非線性藥代動學力特性，個體差異較大，且其血藥濃度受多種藥物顯著影響，如患者的性別、年齡、疾病、藥物等非遺傳因素，其中最主要的影響因素是轉(zhuǎn)運及代謝酶的基因多態(tài)性，所以其臨床療效和不良反應(yīng)具有顯著個體差異，臨床使用劑量難以把握[5]。同時，應(yīng)用伏立康唑時可出現(xiàn)肝毒性、視覺障礙等不良反應(yīng)，有研究通過對伏立康唑不良反應(yīng)分析表明伏立康唑引起肝功能異常不良反應(yīng)較高，可能與有較高的血藥濃度和(或)劑量有關(guān)[6]。

患者體內(nèi)藥物濃度與其基因型的相關(guān)性研究是我們課題組主要研究方向之一。鑒于此，本文擬通過先建立伏立康唑的血藥濃度反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定方法，來監(jiān)測患者用藥后血藥濃度狀況，為后期研究伏立康唑的血藥濃度與CYP2C19的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)，為最終指導(dǎo)臨床個體化使用伏立康唑提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器Thermo高效液相色譜儀(ultiMate 3000，賽默飛世爾科技(上海)有限公司)；百色龍色譜數(shù)據(jù)工作站；VORTEX-5漩渦混合器；HC-2518高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；ME204E電子天平(瑞士梅特勒)。

1.2試藥伏立康唑(中國食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號：100862-201402，純度99.7%)；酮康唑(中國食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號：100294-201203，純度99.4%)；甲醇(色譜純，OCEANPAK)；乙腈(色譜純，OCEANPAK)；磷酸二氫鉀(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；三乙胺(分析純，天津光復(fù)精細化工研究所)；純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件Syncronis C18柱(5 μm,4.6 mm ×250 mm)；流動相：0.025 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液pH=5.25(加三乙胺62.5 μL)∶乙腈∶甲醇=35∶45∶20；流速1.0 mL·min-1；紫外檢測波長260 nm；進樣量20 μL。柱溫：30 ℃。

2.2貯備液配制精確稱量伏立康唑?qū)φ掌?.010 g，用甲醇溶解后定容至刻度線，得到伏立康唑貯備液(濃度為1.0 g·L-1)，臨用前用甲醇稀釋貯備液配置成標準工作液備用；精確稱量酮康唑?qū)φ掌?.012 g，用甲醇溶解后定容至刻度線，得到酮康唑貯備液(濃度為1.2 g·L-1)。

2.3血漿樣品處理精密吸取200 μL血漿樣品于1.5 mL EP管中，加入20 μL酮康唑?qū)φ掌?50 mg·L-1)，渦旋混勻1 min，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻3 min，然后14 000 r·min-1離心10 min，20 μL進樣檢測。

2.4專屬性考察在本色譜條件下，伏立康唑和內(nèi)標酮康唑分離度和拖尾因子均能滿足要求且峰形較好，空白血漿無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，伏立康唑和酮康唑的保留時間(tR)分別為6.4 min和14.9 min，色譜圖見圖1。

2.5標準曲線及定量下限取180 μL空白血漿加入20 μL伏立康唑標準工作液液，配制成一系列濃度0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 mg·L-1的血漿樣品，按照2.3項下處理，20 μL進樣檢測。記錄伏立康唑峰面積 A1 與酮康唑峰面積 A2，以血漿濃度(C)與峰面積比As(A1 / A2)作線性回歸分析，得回歸方程：As=0.460 9C+0.030 1(r2=0.999 6)，LLOQ為0.2 mg·L-1，伏立康唑血漿濃度在0.2～10 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

A

B

C

D

注：A.空白血漿色譜圖， B.對照品色譜圖(2 mg·L-1)， C.空白血漿加藥物色譜圖(2 mg·L-1)，D.患者色譜圖。

圖1伏立康唑色譜圖

2.6精密度及準確度配制3批0.5、2.0、8.0 mg·L-13個濃度的血漿樣品各5份，按照2.3項下處理，20 μL進樣檢測，1 d測定1批樣品，連續(xù)測定3 d。計算日內(nèi)和日間精密度及準確度。精密度的實測平均值代入回歸方程得實測濃度與實際濃度的比值百分數(shù)即為準確度，結(jié)果見表1。

表1　伏立康唑精密度與準確度試驗

2.7提取回收率配制0.5、2.0、8.0 mg·L-13個不同濃度的含藥血漿樣品各5份，按照2.3項下處理，20 μL進樣檢測，測得伏立康唑面積為A1。取180 μL空白血漿，按照2.3項下操作，取全部上清液于離心管中，再加20 μL低、中、高三種不同濃度對照品溶液各5份，然后加20 μL酮康唑內(nèi)標溶液，混勻后進樣檢測，測得伏立康唑面積為A2。A1與A2比值百分數(shù)即為提取回收率，結(jié)果見表2。

表2　伏立康唑提取回收率(n=5)

2.8穩(wěn)定性考察

2.8.1反復(fù)凍融穩(wěn)定性配制0.5、2.0、8.0 mg·L-13個不同濃度的血漿樣品各5份，反復(fù)凍融3次后，按照2.3項下處理，20 μL進樣檢測，結(jié)果見表3。

表3　伏立康唑反復(fù)凍融穩(wěn)定性(n=5)

2.8.2室溫放置穩(wěn)定性配制0.5、2.0、8.0 mg·L-13個不同濃度的血漿樣品各5份，按照2.3項下處理，分別放置0，12，24 h后測定分析，結(jié)果見表4。

2.8.3儲備液穩(wěn)定性將0.5、2.0、8.0 mg·L-13個濃度伏立康唑儲備液與內(nèi)標儲備液放置在4℃冰箱，分別于第0、7、14天按照2.3項下處理，20 μL進樣檢測，結(jié)果見表5。

2.9臨床應(yīng)用共收集使用伏立康唑抗真菌治療患者10例。給藥方法為： 成人每次200 mg，q12h，靜脈滴注或口服；兒童每次4 mg·kg-1，q12h靜脈滴注或口服。臨床結(jié)果評定標準：改善或緩解為臨床有效； 癥狀持續(xù)存在或未改善為臨床無效。應(yīng)用上述建立的HPLC法檢測真菌感染患者伏立康唑的血藥谷濃度，10例患者平均血藥谷濃度為(2.86±3.14)mg·L-1，其中有3例患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，4例患者使用伏立康唑治療無效。

3　討論

目前伏立康唑的血藥濃度監(jiān)測方法主要HPLC-MS和 HPLC等，因HPLC-MS成本較高，不適于常規(guī)開展伏立康唑的臨床血藥濃度監(jiān)測。因此，本文通過優(yōu)化HPLC相關(guān)方法條件，篩選出了最佳蛋白沉淀劑和優(yōu)化了蛋白沉淀劑的體積；并通過加入三乙胺調(diào)整峰形，使其滿足生物樣品分析要求。通過查閱相關(guān)文獻[7-10]，發(fā)現(xiàn)多采用乙腈-磷酸鹽緩沖溶液或水為流動相，但在實驗中發(fā)現(xiàn)伏立康唑和酮康唑出峰條件均較差，選用乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖溶液為流動相，用三乙胺調(diào)節(jié)PH在4.8～6.0之間，通過反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)流動相的比例明顯影響伏立康唑和酮康唑的出峰時間，磷酸鹽緩沖溶液的pH顯著影響峰形；最終通過摸索，確定以乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH=5.25)(45∶20∶35)為流動相。實驗結(jié)果表明，在此條件下，伏立康唑和酮康唑能夠與血漿中的雜質(zhì)完全分離，不會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，保留時間適中，能夠滿足臨床大批量樣本的監(jiān)測分析。

此外，在血樣處理方面，文獻報道一般采用萃取法處理樣品，樣品預(yù)處理操作煩瑣、耗時長、系統(tǒng)誤差較大，而直接沉淀法則較為簡單易行，更適合臨床上樣品的分析[8,11]。所以，本實驗分別考察了甲醇、乙腈、15%高氯酸三種常用蛋白沉淀劑的沉淀效果，最終選擇乙腈作為蛋白沉淀劑，通過優(yōu)化最終選用1.5倍體積乙腈進行沉淀，蛋白沉淀較為徹底且回收率較高。

一些獨立研究發(fā)現(xiàn)伏立康唑血漿谷濃度(Cmin)與臨床療效和不良反應(yīng)的關(guān)系，如肝毒性和幻覺。基于不同的統(tǒng)計方法目標Cmin被確定最大限度地提高治療反應(yīng)和減少肝毒性。例如，有Meta分析表明伏立康唑Cmin范圍是1.0～4.0 mg·L-1是最有效和安全的[12]。獨立研究通過Logistic回歸分析顯示Cmin范圍是1.7～5 mg·L-1[13]。本研究有3例患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，4例患者使用伏立康唑無效，故認為對伏立康唑進行血藥濃度監(jiān)測是有必要的。

綜上所述，本研究建立的人血漿中伏立康唑的RP-HPLC測定方法靈敏度和準確度均較高，專屬性強，分析快速，操作簡便，符合生物樣本分析要求，可滿足臨床血藥濃度的常規(guī)監(jiān)測需要，可為伏立康唑的血藥濃度與CYP2C19基因型相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)，為指導(dǎo)伏立康唑的臨床個體化用藥提供依據(jù)。

表4　樣品處理后室溫放置穩(wěn)定性(n=5)

表5　伏立康唑儲備液穩(wěn)定性(n=5)

參考文獻

[1]Li SX,Song YJ,Zhang LL,et al.An in vitro and in vivo study on the synergistic effect and mechanism of itraconazole or voriconazole alone and in combination with tetrandrine against Aspergillus fumigatus[J].J Med Microbiol,2015,64(9):1008-1020.

[2]Karthaus M,Lehrnbecher T,Lipp HP,et al.Therapeutic drug monitoring in the treatment of invasive aspergillosis with voriconazole in cancer patients-an evidence-based approach[J].Ann Hematol,2015,94(4):547-556.

[3]Oyake T,Kowata S,Murai K,et al.Comparison of micafungin and voriconazole as empirical antifungal therapies in febrile neutropenic patients with hematological disorders:a randomized controlled trial[J].Eur J Haematol,2015,7：28.

[4]Xue M,Gao X,Ferreira CN,et al.Cost analysis of voriconazole versus liposomal amphotericin B for primary therapy of invasive aspergillosis among high-risk hematologic cancer patients in Brazil[J].Value Health,2015,18(7):820.

[5]陳文瑛,黃思琪,謝白露,等.伏立康唑個體化給藥研究新進展[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2013,(14):1181-1184.

[6]朱萍,蔣正立.伏立康唑的不良反應(yīng)綜述[J].中國藥業(yè)，2011,(23):95-96.

[7]Johnson HJ,Han K,Capitano B,et al.Voriconazole pharmacokinetics in liver transplant recipients[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(2):852-9.

[8]肖翔林,銀雪艷,孟冬梅,等.伏立康唑血藥濃度的測定與方法學考察[J].抗感染藥學,2014,11(4):292-294.

[9]Sangsiriwut K,Chayakulkeeree M.Rapid high performance liquid chromatographic assay for determination of voriconazole concentration in human plasma[J].J Med Assoc Thai,2013,96(Suppl 2):98-103.

[10] Gomez-Lopez A,Cendejas-Bueno E,Cuesta I,et al.Voriconazole serum levels measured by high-performance liquid chromatography:a monocentric study in treated patients[J].Med Mycol,2012,50(4):439-445.

[11] 李順煒,袁孔現(xiàn),朱虹,等.反相高效液相色譜法測定血液中去甲萬古霉素濃度的研究[J].安徽醫(yī)藥，2015，19(8):1470-1473.

[12] Hamada Y,Seto Y,Yago K,et al.Investigation and threshold of optimum blood concentration of voriconazole:a descriptive statistical meta-analysis[J].J Infect Chemother,2012,18(4):501-507.

[13] Dolton MJ,Ray JE,Chen SC,et al.Multicenter study of voriconazole pharmacokinetics and therapeutic drug monitoring[J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(9):4793-4799.

基金項目：安徽省軟科學研究計劃基金資助項目(12020503083)，安徽中醫(yī)藥大學研究生科技創(chuàng)新基金項目(201506)

通信作者：史天陸，男，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物代謝動力學，E-mail：tianlu828@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.015

(收稿日期：2016-02-23，修回日期：2016-04-08)

Determination of voriconazole in human plasma by RP-HPLC

LI Yu1,2,ZHANG Lei1,DENG Mingying1,et al

(1.PharmacokineticsLaboratory,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei,Anhui230031,China;2.DepartmentofPharmacy,AnhuiProvincialHospital,Hefei,Anhui230001,China)

Abstract:ObjectiveTo establish RP-HPLC method for the determination of voriconazole in human plasma.MethodsSyncronis C18column(5 μm,4.6 mm×250 mm) was adopted.The mobile phase was 0.025 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate buffer solution(pH = 5.25,added with triethylamine 62.5 μL) and acetonitrile and methanol( 35∶45∶20).The flow rate was 1.0 mL·min-1,the detection wavelength was 260 nm,and the column temperature was 30℃.Ketoconazole was used as internal standard,20 μL injected directly after plasma samples were extracted by acetonitrile.ResultsA linearity was obtained within the range of voriconazole concentrations from 0.2 to 10 mg·L-1.LLOQ was 0.2 mg·L-1.The standard curve was As=0.460 9C+0.030 1(r2=0.999 6,n=5).The intra-day and inter-day RSD were less than 7%.The accuracy of voriconazole was between 98% and 103%,and the extraction recoveries of voriconazole was between 86% and 95%.The stable inspection RSD was less than 8%.ConclusionThe method was simple,high sensitive,accurate,and well stable for the determination of voriconazole in human plasma,which provided a basis for individualized voriconazole treatment.

Key words：Chromatography,Reverse-Phase;voriconazole;PLASMA CONCENTRATION