楊仙萍，涂傳龍，莊聰文，石曉磊，翁向群

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院僑賓科，福建 福州　350025)

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漆黃素逆轉慢性應激鼠認知損害突觸可塑性研究

楊仙萍，涂傳龍，莊聰文，石曉磊，翁向群

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院僑賓科，福建 福州350025)

摘要：目的探討漆黃素逆轉慢性束縛應激小鼠認知損害的突觸可塑性研究。方法用CD1小鼠建立慢性束縛應激模型，漆黃素(25 mg·kg-1·d-1)灌胃給藥,漆黃素給藥前30 min雙側背側海馬微量注射U0126(0.5 μg/側)。場電生理研究海馬CA1區(qū)長時程增強(LTP)的變化，高爾基染色觀察樹突棘數(shù)量改變，Western blot檢測突觸膜蛋白表達。結果漆黃素逆轉慢性應激鼠海馬CA1區(qū)LTP損害，提高海馬樹突棘數(shù)量，ERK特異性阻斷劑U0126阻斷其效應。結論漆黃素逆轉慢性應激鼠海馬突觸可塑性損害，可能與ERK通路有關。

關鍵詞：漆黃素;CA1區(qū),海馬;認知障礙;神經(jīng)元可塑性;小鼠,近交ICR

應激激活下丘腦-垂體-腎上腺軸和提高應激激素糖皮質激素循環(huán)濃度[1]。急性應激可提高身體和精神反應，但長期應激反應會導致一系列負面效應，包括損害海馬依賴的認知功能[2]。與學習記憶密切相關海馬組織分布高密度糖皮質激素受體，因此特別容易受高糖皮質激素的損傷。長期慢性應激損害海馬組織，包括神經(jīng)化學、興奮性和神經(jīng)形態(tài)，甚至導致神經(jīng)細胞死亡，繼而損害海馬依賴的相關學習記憶功能[3-4]。

突觸可塑性是指突觸傳遞效率在某些因素的作用下可出現(xiàn)不同程度的持續(xù)性上調(diào)或下調(diào)，包括突觸傳遞可塑性、突觸發(fā)育可塑性和突觸形態(tài)的可塑性[5]。長時程增強(Long-term potentiation，LTP)是突觸傳遞可塑性重要一種。大量實驗證實海馬突觸可塑性與學習記憶密切相關，是學習與記憶功能的細胞分子機制[5]。

我們既往已證實富含于草莓等水果、蔬菜中的黃酮類化合物漆黃素改善慢性束縛應激導致的海馬相關學習記憶損害[6-7]，且海馬組織突觸可塑性是學習記憶的細胞分子機制，因此，我們將進一步研究漆黃素逆轉慢性束縛應激導致的認知損害的突觸可塑性研究。

1　材料與方法

1.1動物雄性CD1(ICR)小鼠8～10周齡，CD1小鼠購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2002-0003。動物飼養(yǎng)于環(huán)境溫度24～27 °C，自由獲得食物和水，光照周期12 h。動物適應1周后才開始實驗處理。

1.2藥品及試劑漆黃素粉末購買于美國Sigma公司，純度≥98%，漆黃素溶解于5%羧甲基纖維素鈉溶液，連續(xù)漆黃素灌胃(25 mg·kg-1) 14 d，對照組給予等體積5%羧甲基纖維素鈉溶液。U0126，ERK特異性阻斷劑，溶于50%二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，最終濃度為1 g·L-1，漆黃素給藥前30min雙側背側海馬微量注射U0126，每側注射量為0.5 μL，每天注射1次，連續(xù)給藥14 d[8]。Synapsin I抗體(Abcam)、PSD95抗體(Abcam)。

1.3慢性束縛應激CD1鼠塞于50 mL通風離心管，保持小鼠僅能呼吸運動，每天3 h，連續(xù)21 d，束縛應激結束后放回飼養(yǎng)籠。束縛應激期間對照鼠禁飲禁食3 h。

1.4海馬場電位記錄記錄配制人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)(1 000 mL)：KCl 3.6 mmol·L-1，NaCl 119 mmol·L-1，MgSO4.7H2O 1.3 mmol·L-1，NaH2PO4.2H2O 1.0 mmol·L-1，CaCl22.5 mmol·L-1，NaHCO326 mmol·L-1，葡萄糖 10 mmol·L-1。振動切片機切取厚度為400 μm的冠狀腦片，切好的腦片轉移至孵育槽孵育1.5 h后開始場電位記錄。記錄Schaffer側支( CA1區(qū)錐體細胞的場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)，輸出單刺激，每30秒刺激一次標本，記錄基礎fEPSP曲線，基礎fEPSP記錄穩(wěn)定后給予高頻刺激，后繼續(xù)用單刺激方式刺激記錄fEPSP。LTP幅度的計算方法：高頻刺激后45～60 min的fEPSP幅度疊加平均值與高頻刺激前fEPSP幅度均值的比值計為LTP的幅度。

1.5高爾基染色10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，后將其固定在手術臺上手術，將灌流針插入小鼠心間并將針管連接到用0.5%亞硝酸鈉溶液滴注，剪破右心耳放血，至從右心耳流出的液體無血色，遂將灌注液換成10%甲醛生理鹽水溶液繼續(xù)灌注進行固定。固定液灌注充分后用媒染液灌注，至流出液顯濃厚桔紅色。開顱取出腦組織，仍用媒染液浸泡，置暗處避光，室溫3 d。換瓶用1%硝酸銀水溶液浸泡鍍銀，置暗處3 d。每日換新銀液一次，并及時搖動瓶，使鍍銀充分。后用震蕩切片機切為厚度為50 μm的切片。切片再浸于2%重鉻酸鉀水溶液漂洗10 min。流水漂洗后貼片于預先涂有1%明膠并烘干的載玻片上。經(jīng)酒精梯度脫水：70%-80%-90%-95%-95%-100%-100%，每次5 min。經(jīng)二甲苯漂洗10 min，樹膠封片，然后用蓋玻片覆蓋組織。

1.6突觸小體的準備與Western blot適量海馬組織加入勻漿液(0.32 mol·L-1蔗糖，4 mmol·L-1HEPES(pH7.4)，1X蛋白酶抑制劑混合物)中勻漿，勻漿液1 000×g、4℃離心10 min，上層液12 000×g、4°C離心15 min，細胞碎片重新加入勻漿液(0.32 mol·L-1蔗糖，4 mmol·L-1HEPES(pH7.4)，1×蛋白酶抑制劑混合物)中勻漿，勻漿液12 000×g、4°C離心15 min，突觸小體碎片加入溶液(50 mmol·L-1HEPES(pH7.4)，2 mmol·L-1EDTA，1×蛋白酶抑制劑混合物)，即為突觸小體蛋白提取物，檢測突觸膜蛋白表達變化。BCA法制作標準曲線，測定樣品總蛋白濃度。SDS-PAGE膠單孔上樣量20 μg總蛋白，恒壓(80～120 V)電泳，恒流250 mA電轉膜后封閉PVDF膜1 h，一抗4°C冰箱搖床孵育過夜，二抗室溫搖床孵育1 h，TBST洗脫3次后化學發(fā)光成像系統(tǒng)發(fā)光。

1.7腦立體定位及雙側套管安置取實驗用小鼠，稱重，用2%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為40 mg·kg-1。待小鼠完全麻醉后，將其固定在立體定位儀上，使其頭部固定并盡量保持水平。將針管對準前囟，以前囟為基點，按照需要定位的腦區(qū)坐標，在顱骨表面找到相應位置，做上記號。用鉆頭在記號處鉆孔，將針管按照定位坐標的深度插入到需要的腦區(qū)。用牙托粉固定套管。雙側背側海馬具體坐標如下：(前囟為基點)前囟向后1.8 mm，中線旁開1.4 mm，向下2.2 mm。套管安放好之后，小鼠需休息1周再展后續(xù)的實驗。

2　結果

2.1漆黃素逆轉慢性應激鼠海馬LTP損害海馬CA1區(qū)突觸LTP研究見圖1。與對照組相比，應激組海馬長時程增強(Long-term potentiation，LTP)受損(P<0.05)，慢性漆黃素處理逆轉其損害(P<0.05)?？紤]到LTP的增強或逆轉效果可能與漆黃素引起的基礎突觸傳遞改變有關，因此我們觀察反映基礎突觸傳遞功能的指標：輸入-輸出曲線(input-output curve，I/O曲線)。漆黃素不影響小鼠海馬區(qū)I/O曲線，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這些結果表明，漆黃素對慢性應激鼠海馬LTP的逆轉作用并不是通過改變海馬基礎突觸傳遞功能起作用的，而可能是通過作用于突觸后的某些信號分子實現(xiàn)的。

注：(A)海馬CA1區(qū)高頻刺激誘發(fā)的LTP；(B)各組HFS-LTP比較的條形圖，與對照組對比，aP<0.05；與應激組相比，bP<0.05；(C)各組輸入-輸出曲線。

圖1漆黃素逆轉慢性應激鼠海馬LTP損害

2.2漆黃素提高慢性應激鼠海馬樹突棘密度既往研究發(fā)現(xiàn)慢性漆黃素處理逆轉慢性應激鼠海馬突觸前蛋白Synapsin I和突觸后蛋白PSD95的減少(P<0.05)。而突觸膜蛋白的表達增加，常提示突觸形態(tài)和數(shù)量增多，常由樹突棘密度增加間接提示[9]。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，慢性應激鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度明顯減低(P<0.01)，漆黃素處理可逆轉其改變(P<0.05)。

2.3抑制海馬ERK活性阻斷漆黃素逆轉神經(jīng)可塑性損害既往研究發(fā)現(xiàn)漆黃素可激活神經(jīng)細胞內(nèi)的ERK通路，且通過激活ERK發(fā)揮神經(jīng)保護、認知增強效應[6,10]。漆黃素灌注口服前0.5 h海馬局部腦區(qū)微量注射ERK阻斷劑U0126，觀察其阻斷效應。與應激組相比，漆黃素處理提高應激鼠海馬突觸前蛋白和突觸后蛋白表達(P<0.05)，漆黃素灌注口服前半小時海馬微量注射U0126完全逆轉其效應(P<0.05)。同樣地，海馬微量注射U0126也逆轉漆黃素提高海馬LTP和樹突棘密度(P<0.05)，即U0126阻斷漆黃素逆轉慢性應激鼠突觸可塑性損害的效應。

注：(A)代表性海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘Golgi-cox染色圖像(5 μm)；(B)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度統(tǒng)計圖，與對照組對比，aP<0.01；與應激組相比，bP<0.05。

圖2漆黃素提高慢性應激鼠海馬樹突棘密度

注：(A)代表性突觸膜蛋白免疫條帶；(B)相對蛋白條帶強度；(C)各組HFS-LTP比較的條形圖；(D)各組樹突棘密度統(tǒng)計圖；與stress組對比，aP<0.05；與stress+fisetin組相比，bP<0.05。

圖3抑制ERK活性阻斷漆黃素逆轉神經(jīng)可塑性損害

3　討論

短時溫和應激提高實驗動物學習和記憶功能，長期強烈應激損害海馬依賴的記憶功能，而且，長時間或高劑量糖皮質激素給藥獲得同樣的效應[11]。人類受到長期應激后也導致海馬依賴的外顯記憶損害。海馬LTP是海岸依賴的學習記憶功能的分子機制，既往研究也證實慢性應激同時也損害海馬LTP[11]，本實驗發(fā)現(xiàn)慢性束縛應激損害小鼠海馬LTP，慢性漆黃素給藥逆轉其損害，說明漆黃素逆轉慢性束縛應激導致的認知損害[6]，也逆轉海馬LTP損害。長期應激或高濃度糖皮質激素損傷海馬突觸樹突棘形態(tài)，即導致海馬錐體神經(jīng)元頂端樹突棘萎縮和退化[12]。高劑量糖皮質激素甚至可導致海馬錐體神經(jīng)元死亡。本實驗發(fā)現(xiàn)漆黃素逆轉慢性束縛應激鼠海馬錐體神經(jīng)元樹突棘密度，也表明漆黃素逆轉其神經(jīng)纖維網(wǎng)稀疏。既往實驗證實海馬微注射ERK抑制劑U0126完全阻斷漆黃素改善認知功能[6]，本實驗也發(fā)現(xiàn)U0126完全阻斷漆黃素逆轉慢性應激鼠海馬突觸蛋白的表達、海馬LTP和樹突棘的變化?？傊?，漆黃素逆轉慢性束縛應激導致的學習記憶功能，也逆轉其突觸可塑性變化，且漆黃素可能通過ERK通路調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性發(fā)揮改善認知功能。

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基金項目：福建省自然科學基金資助項目(2009J01188)

通信作者：翁向群，女，副主任醫(yī)師，研究方向：老年病，E-mail：xqwengzj@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.008

(收稿日期：2016-03-12，修回日期：2016-05-20)

Synaptic plasticity following fisetin’s reversion of cognitive impairment provoked by chronic stress in mice

YANG Xianping,TU Chuanlong,ZHUANG Congwen,et al

(FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou,Fujian350025,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate synaptic plasticity following the prevention of cognitive deficits by fisetin treatment provoked by chronic stress in mice.MethodsMice were subjected to chronic restraint stress for 21 days.Stressed mice received repeated gavage of 25 mg·kg-1fisetin once daily for 14 consecutive days.Mice were injected with U0126(0.5 μg/side) 30 min before fisetin treatment.Effects of fisetin on long-term potentiation (LTP) in mouse hippocampal slices were investigated by electrophysiological methods.The expressive levels of proteins in the hippocampus of mice were analyzed by Western blot.The spine density in mice was investigated by Golgi staining.ResultsFisetin reversed hippocampal LTP in stressed mice,increased the density of dendritic spines.However,pretreatment with U0126,a specific ERK inhibitor,blocked the restoration of synaptic plasticity by fisetin in stressed mice.ConclusionsChronic oral administration of fisetin restores synaptic plasticity in stressed mice,which may be related to ERK signaling pathway involved in the hippocampus.

Key words:Fisetin;CA1 Region,hippocampal；Cognition disorders；Neuronal plasticity；Mice,inbred ICR