王冠杰 ，趙婭娟 ，董濟民

(西安市中心醫(yī)院,a腫瘤科，b體檢中心；陜西 西安　710004)

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◇藥學(xué)研究◇

脂質(zhì)體和厚樸酚聯(lián)合熱療對腺樣囊性癌增殖的協(xié)同抑制作用

王冠杰a，趙婭娟b，董濟民a

(西安市中心醫(yī)院,a腫瘤科，b體檢中心；陜西 西安710004)

摘要：目的探討脂質(zhì)體和厚樸酚聯(lián)合熱療對人腺樣囊性癌腫瘤模型的增殖抑制作用。方法用DOTAP:Chol脂質(zhì)體包裹和厚樸酚來進行抗腫瘤體內(nèi)實驗；構(gòu)建小鼠人腺樣囊性癌腫瘤模型，瘤內(nèi)注射和厚樸酚并聯(lián)合局部熱療，觀察腫瘤大小及小鼠生存期及生長狀態(tài)，對移植瘤進行CD31免疫組化染色和TUNEL分析。結(jié)果脂質(zhì)體和厚樸酚聯(lián)合熱療的抗腫瘤效應(yīng)更強，聯(lián)合治療組腫瘤的體積明顯小于對照組、熱療組、和厚樸酚組(P<0.05)，部分腫瘤完全消退。聯(lián)合治療組小鼠的生存期有明顯獲益(P<0.05)，在殘存腫瘤中，腫瘤組織內(nèi)微血管密度低于其他組，凋亡細胞明顯增多。 結(jié)論脂質(zhì)體和厚樸酚能明顯抑制人腺樣囊性癌增殖，與熱療聯(lián)合能夠增強誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，產(chǎn)生更強腫瘤殺傷效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：囊腺癌；高溫,誘發(fā)；脂質(zhì)體；厚樸酚；細胞凋亡

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC) 是淚腺上皮性腫瘤中最為常見并且惡性程度最高的腫瘤，其發(fā)生率居于第 2 位，僅次于多形性腺瘤。具有極強的侵襲性，早期即可侵犯血管和神經(jīng)，而且還易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，以肺轉(zhuǎn)移最為常見， 轉(zhuǎn)移率高達40%。目前臨床對于ACC的治療主要采取手術(shù)聯(lián)合放療，但遠期療效仍不甚理想[1]。和厚樸酚(Honokiol，HNK)是從木蘭科木蘭屬植物厚樸的根皮和枝皮中提取的小分子化合物。有研究表明其具有抗炎[2]、抗血栓[3]、抗氧化[4]、抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞毒作用[5]等作用。其中一種機制為和厚樸酚還可以通過誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，激活細胞內(nèi)MAPK信號通路，上調(diào)表達蛋白JNK、P38、ERK( P42/P44)水平以促進腫瘤細胞的凋亡[4]，同時和厚樸酚促使細胞停滯在G1期并誘導(dǎo)細胞凋亡[5]。然而和厚樸酚的水溶性極低，正常給藥后血藥濃度很低，從而限制了它的臨床應(yīng)用。在本課題組前期研究中，我們制備得到PEG-PE修飾的脂質(zhì)體和厚樸酚。實驗證明，PEG-PE修飾的脂質(zhì)體和厚樸酚顯著改善了和厚樸酚的溶解性和在血漿中的藥物濃度，延長了它的半衰期[6]。本研究旨在觀察脂質(zhì)體和厚樸酚對小鼠腺樣囊性移植瘤的治療作用及其聯(lián)合熱療的療效。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器和厚樸酚(HNK 99．99%純度)購自上海純優(yōu)生物科技有限公司，二甲基亞砜 (DMSO)購自Sigma公司，PEG-PE修飾的脂質(zhì)體由四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室合成；胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自杭州四季青公司。大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體：購自BD Pharmingen公司;原位TUNEL檢測試劑盒：購自Promega公司；熒光倒置顯微鏡(Nikon TI-S)為日本尼康公司。腺樣囊性癌 ACC-2 細胞株購自中科院上海細胞所，BALB/c小鼠購自南京君科生物工程有限公司，動物使用許可證號WCCSIB-D-2011-029。

1.2細胞培養(yǎng)與動物腫瘤模型的建立腺樣囊性癌 ACC-2 細胞株用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于37℃，5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。動物模型參考文獻建立[7]。采用6～8周齡、20 g左右的BALB/c雌性小鼠,SPF級動物房飼養(yǎng)，將ACC-2細胞接種到小鼠右后肢外側(cè)皮下，每只接種5×105～1×106個細胞(0.1 mL)。

1.3實驗動物分組及處理將小鼠隨機分為對照組、熱療組、和厚樸酚組、和厚樸酚+熱療組，每組10只，采用尾靜脈注射給藥的方式在每4天治療一次，生理鹽水、脂質(zhì)體和厚樸酚分別為100 μL、50 μg。局部水浴熱療42℃，每天1 h。療程結(jié)束后處死小鼠后取腫瘤組織，固定、切片，按TUNEL試劑盒說明書操作染色，熒光顯微鏡下觀察。

2　結(jié)果

2.1荷瘤小鼠移植瘤生長情況及瘤體的變化趨勢

將ACC-2細胞接種到小鼠右后肢外側(cè)皮下，每只接種1×106個細胞(0.1 mL)，腫瘤體積測定按照Steel經(jīng)驗公式：腫瘤體積(mm3) = π/6 × 長 × 寬2，長：腫瘤最長徑，寬：腫瘤最短經(jīng)。當腫瘤體積達到 200 mm3時，開始給藥。開始治療1月后，聯(lián)合治療組腫瘤生長最緩慢，甚至有1只小鼠腫瘤完全消退。從圖中可以看出單藥和厚樸酚或局部熱療可以抑制腫瘤生長，但聯(lián)合治療可以發(fā)揮更強的作用(圖1)，進一步進行兩因素重復(fù)測量方差分析發(fā)現(xiàn)： 4個治療組間(F分組，P分別為：25.68，0.000)、各時點間(F時間，P分別為：554.21，0.000)、組和時間的交互作用(F交互，P分別為：60.77 0.000)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示腫瘤體積在組間、時點間的變化很大，且隨時間的變化趨勢受分組影響。熱療組對比HNK組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　移植瘤生長情況及腫瘤體積的變化趨勢

2.2荷瘤小鼠不同治療的生存時間比較在腺樣囊性癌 ACC-2小鼠腫瘤模型中，聯(lián)合治療小鼠有明顯生存獲益，聯(lián)合治療組中位生存期達42.3 d，而生理鹽水組為14.5 d，熱療組為36.6 d，厚樸酚組均為37.9 d。Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組的生存期明顯優(yōu)于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.90 ，P<0.05)(圖2)。

圖2　荷瘤小鼠不同治療后生存時間比較

2.3不良反應(yīng)觀察隨著腫瘤逐漸增大及化療藥物使用，各組荷瘤鼠攝食均出現(xiàn)減少，活動逐漸遲緩，精神狀態(tài)變差，體質(zhì)量減輕。后期出現(xiàn)腫瘤惡病質(zhì)表現(xiàn)，甚至死亡。處死小鼠后取重要臟器進行大體及顯微鏡下觀察，聯(lián)合治療組與對照組均未見發(fā)現(xiàn)明顯的異常(圖3)。

圖3　荷瘤小鼠重要臟器HE染色(×200)

2.4免疫組化染色檢測腫瘤組織內(nèi)微血管密度取腫瘤組織石蠟切片，采用CD31單抗做腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞免疫組化染色后顯微鏡下觀察(圖4)，200倍光鏡下，每組切片拍攝5個陽性視野，每個視野計數(shù)微血管數(shù)，計算平均微血管數(shù)作為腫瘤組織內(nèi)微血管密度(MVD)，各組微血管密度分別為生理鹽水對照組 26.7%±5.5%、熱療組18.3%±4.6%、和厚樸酚組24.6%±6.5% 、聯(lián)合治療組13.5%±4.7% 。聯(lián)合治療組腫瘤組織內(nèi)微血管密度顯著低于其他三組(F=5.63，P<0.05)。(圖5)。

注：A.對照組 B.熱療組 C.HNK組 D.熱療+HNK組

圖4移植瘤CD31免疫組化染色(×200)

圖5　各組荷瘤小鼠移植瘤組織內(nèi)微血管密度(n=5)

2.5原位細胞凋亡檢測(TUNEL)移植瘤內(nèi)腫瘤細胞凋亡數(shù)取腫瘤組織石蠟切片，用原位細胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒染色后熒光顯微鏡下觀察(圖6)，每組切片拍攝6個陽性視野，每個視野計數(shù)200個細胞，計算平均凋亡細胞數(shù)所占百分比作為凋亡指數(shù)。各組凋亡指數(shù)分別為生理鹽水組 6.7%±0.5%、熱療組38.3%±0.6%、和厚樸酚組34.8%±0.5%、聯(lián)合治療組55.6%±4.8%。聯(lián)合治療組腫瘤凋亡指數(shù)顯著高于其他三組(F=251.57，P<0.05)。見圖7。

注：A.對照組 B.熱療組 C.HNK組 D.熱療+HNK組

圖6移植瘤原位細胞凋亡檢測(TUNEL染色) (×200)

圖7　各組荷瘤小鼠腫瘤凋亡指數(shù)(n=6)

3　討論

腺樣囊性癌是一種少見的腫瘤類型，多發(fā)生于頭頸部，尤其是涎腺區(qū)，也有發(fā)生于乳腺、淚腺、支氣管的報導(dǎo)。腺樣囊性癌是涎腺第三大常見腫瘤，治療首選根治性手術(shù)切除，然而頭頸部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且腫瘤極易延神經(jīng)蔓延，導(dǎo)致手術(shù)難以根治，術(shù)后常需進行輔助放療，化療療效有限，僅用于晚期遠處轉(zhuǎn)移的患者，因此亟需開發(fā)更為有效的治療性藥物。

和厚樸酚是天然植物厚樸的皮中提取的一種化合物，氣味辛香，具有獨特的物理特性，能夠穿過血腦屏障，中醫(yī)認為其具有化濕導(dǎo)滯的作用。有研究表明，和厚樸酚還具有抗癌作用，可體外誘導(dǎo)結(jié)黑色素瘤、骨肉瘤、腸癌和肝癌等腫瘤細胞凋亡[8-11]。和厚樸酚可抑制Akt磷酸化，調(diào)節(jié)核生長因子NF-кB激活，進一步調(diào)控VEGF、MCL1、COX-2等蛋白，從而誘導(dǎo)凋亡[12]。另外，和厚樸酚還能誘導(dǎo)caspase介導(dǎo)的凋亡途徑[13]，在p53缺失時，和厚樸酚通過激活caspas3、7、9而激活外源性凋亡途徑，p53存在時，還可通過內(nèi)源性途徑啟動凋亡程序，這一途徑在各腫瘤細胞系中更為常見和廣泛。

熱療是繼手術(shù)、放療、化療及生物治療后又一腫瘤治療手段，由于其不良反應(yīng)小，已經(jīng)被越來越多的臨床工作者所重視[14-15]。不少國內(nèi)外相關(guān)文獻對其機制進行了研究與闡明，文獻顯示熱療能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[15]增加腫瘤細胞對放化療敏感性[16]減輕患者的放化療期間不良反應(yīng)[17]。熱療還能使細胞VEGF 的表達受抑制，從而抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞經(jīng)過高溫作用后可產(chǎn)生熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)其能夠激活機體的免疫功能， 產(chǎn)生針對自身腫瘤細胞的細胞因子[16]。

在我們的研究中，單藥脂質(zhì)體和厚樸酚或單純熱療均能產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，然而聯(lián)合治療組腫瘤生長更慢，小鼠生存期更長，腫瘤組織內(nèi)微血管密度更低，TUNEL染色可見更多凋亡細胞。目前熱療已廣泛用于臨床，具有很好的療效，體外研究證明熱療具有促進藥物進入腫瘤細胞和誘導(dǎo)的凋亡的作用，而和厚樸酚可誘導(dǎo)Caspase介導(dǎo)的凋亡途徑[18]。熱療增加脂質(zhì)體和厚樸酚的抗腫瘤作用，其具體機制可能是：兩種治療從不同位點激活Caspase途徑，產(chǎn)生協(xié)同作用從而促進細胞凋亡，但真實的內(nèi)在機制仍需進一步研究。

綜上所述，脂質(zhì)體和厚樸酚聯(lián)合熱療治療腺樣囊性癌 ACC-2荷瘤小鼠，具有好的近期療效和遠期生存，且無明顯不良反應(yīng)。熱療能協(xié)同脂質(zhì)體和厚樸酚誘導(dǎo)促進腫瘤凋亡，其內(nèi)在機制仍需進一步研究，但可以預(yù)期，聯(lián)合治療具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金(81172589)

通信作者：董濟民，男，主任醫(yī)師，研究方向：實體腫瘤內(nèi)科綜合治療，E-mail：1065048045@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.004

(收稿日期：2016-02-27，修回日期：2016-05-09)

Synergistic antitumor effects of liposomal honokiol combined with hyperthermia in adenoid cystic carcinoma models

WANG Guanjiea,ZHAO Yajuanb,DONG Jimina

(a.DepartmentofOncology;b.ExaminationCenter,Xi’anCentralHospital，Xi’an，Shannxi710004,China)

Abstract:ObjectiveTo assess the inhibitory effects of liposomal honokiol on proliferation in human adenoid cystic carcinoma in vivo.MethodsDOTAP-embedded honokiol was adopted and injected in animal tumor models of adenoid cystic carcinoma(ACC-2cells)cells.The mice were treated with 0.9% saline,local thermotherapy,lipo-honokiol,and lipo-honokiol plus thermotherapy respectively.Tumor size,suvival time,adverse events were observed.Histological analyses of tumors were taken.ResultsWe found that lipo-honokiol plus thermotherapy increased the apoptotic tumor cells dramatically with smallest mean tumor volumes，microvessel density and survival time.ConclusionsThis study suggests that lipo-honokiol may suppress the proliferation of adenoid cystic carcinoma cells.The combined treatment of lipo-honokiol plus thermotherapy may enhance the apoptosis process in adenoid cystic carcinoma(ACC-2cells)cells.

Key words：Cystadenocarcinoma；Hyperthermia,Induced；Liposomes；MAGNOLOL；Apoptosis