雷　玲，王紅霞，高　儀，張志華*

（1河北省贊皇縣林業(yè)旅游局　051230；2河北農(nóng)業(yè)大學山區(qū)研究所；3河北農(nóng)業(yè)大學園藝學院）

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河北核桃ISSR反應(yīng)體系的建立

雷玲1，王紅霞2，高儀3，張志華2*

（1河北省贊皇縣林業(yè)旅游局051230；2河北農(nóng)業(yè)大學山區(qū)研究所；3河北農(nóng)業(yè)大學園藝學院）

摘要：以3個河北核桃樣品為材料，對ISSR反應(yīng)體系中的主要影響因子DNA模板濃度、引物濃度、?DNA聚合酶用量、退火溫度進行優(yōu)化篩選。最后確定河北核桃 ISSR-PCR反應(yīng)體系為 20L體系中含 10×PCR Buffer （Mg2+Plus）2L，dNTPs（各2.5 mM）1.6L，?DNA聚合酶1.0 U，引物25M，模板DNA 50 ng。反應(yīng)的基本程序為：94℃預變性5 min（1個循環(huán)），然后94℃變性30 s，52℃退火60 s，72℃鏈延伸60 s（32個循環(huán)），72℃延伸10 min（1個循環(huán)），4℃保持。不同引物間適宜的退火溫度不同。通過對影響 ISSR反應(yīng)體系的主要因子進行優(yōu)化篩選，建立了適合河北核桃 ISSR分析的反應(yīng)體系，為進一步開展河北核桃指紋圖譜、遺傳多樣性及品種鑒定等的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：河北核桃；ISSR；反應(yīng)體系

河北核桃（Juglans hopeiensis Hu）又稱麻核桃［1］，自然群體中類型較多，堅果的大小、形狀、紋理的起伏及變化等存在較大差異，并且其引種資源也比較混亂，國內(nèi)通過鑒定的河北核桃新品種唯見張志華等［2］選育的“藝核1號”，因此，建立河北核桃ISSR反應(yīng)體系為品種鑒定和育種改良打下基礎(chǔ)是非常必要的。ISSR （inter-simple sequence repeat）是由Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種新型的分子標記［3-5］，這種SSR指紋是用SSR為引物來擴增重復序列之間的區(qū)域，因此又稱為Inter-SSR，簡稱ISSR［3］。

因ISSR分子標記技術(shù)特點其應(yīng)用越來越廣泛，柑橘、蘋果和枇杷等物種的反應(yīng)體系及其品種的指紋圖譜相繼建立［6-10］。在核桃屬ISSR體系建立方面也有些報道，如陳少瑜等［11］以漾濞核桃為研究對象，建立了適合漾濞核桃ISSR-PCR分析的反應(yīng)體系。河北核桃堅果個大、種皮厚且表面紋理皺褶變化多樣，適宜雕刻、觀賞和玩耍等，民間稱之為“耍核桃”或“文玩核桃”。隨著人民生活水平提高，將麻核桃作為健身品的興趣隨之日益濃厚，其越來越受人們的重視。建立和優(yōu)化河北核桃ISSR反應(yīng)體系，為進一步開展河北核桃指紋圖譜、遺傳多樣性、品種鑒定及育種改良等的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料本試驗隨機選取大邊公子帽5號、昌平麻核桃和楊偉公子帽三份材料。材料均采自定州小奇連德勝農(nóng)林科技有限公司核桃園。取其幼嫩葉片，低溫下帶回實驗室，液氮速凍，放入超低溫冰箱中保存待用。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取方法采用加3%PVP40的高鹽低pH法進行基因組DNA提取，具體方法參照文獻［］。

1.2.2ISSR反應(yīng)體系的初始條件ISSR-PCR反應(yīng)體系參照TaKaRa Taq（寶生物工程有限公司）產(chǎn)品說明初步確定如下。

反應(yīng)的基本程序為：94℃預變性5 min（1個循環(huán)），然后94℃變性30 s，52℃退火60 s，72℃鏈延伸60 s（32個循環(huán)），72℃延伸10 min（1個循環(huán)），然后4℃保持。

1.2.3ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化本試驗采用單因素遞進的篩選方法，對DNA模板濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶用量、退火溫度等作了比較分析。引物參照楊恩［13］確定的ISSR引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成，應(yīng)用篩選的隨機引物ISSR01、ISSR08優(yōu)化反應(yīng)體系。

TaqDNA聚合酶的用量設(shè)為6個水平：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U；引物濃度設(shè)為5個水平：10、20、 25、30、40M；DNA濃度設(shè)6個水平：10、30、50、70、 90、100 ng。

ISSR-PCR反應(yīng)基本體系確定后，根據(jù)每個引物自身的Tm值做退火溫度梯度試驗。具體方法如下：在該引物的Tm值左右各加或減5℃確定大概范圍，使用的PCR儀（Bio-Rad）能自動將這個溫度范圍由高到低分為8個不同的溫度。然后，將所得結(jié)果進行2%瓊脂糖凝膠電泳，最后根據(jù)電泳圖像確定該引物的最佳退火溫度。

2　結(jié)果與分析

2.1TaqDNA聚合酶用量在PCR反應(yīng)中，TaqDNA聚合酶用量受到反應(yīng)體積、酶活性等方面的影響。酶量過多會使擴增產(chǎn)物的非特異性增加，且形成浪費，提高成本；過少則產(chǎn)量降低甚至擴增失敗。TaqDNA聚合酶用量設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U 6個水平，其中聚合酶用量為0.5、1.5、2.0、2.5、3.0 U時檢測到其擴增條帶彌散且不清楚，結(jié)果以1.0 U擴增的譜帶清晰效果最好（圖1）。

圖1　TaqDNA聚合酶用量的篩選注：M為DL2000；泳道1～6：DNA聚合酶用量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U。

2.2引物濃度引物濃度對擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量與特異性、對PCR的帶型產(chǎn)生都有影響，引物濃度的降低會使引物與模板的結(jié)合率降低，產(chǎn)生的多態(tài)性條帶減少，特別是低分子量的條帶。本試驗引物濃度設(shè)10、20、25、30、40M 5個水平，結(jié)果以25M擴增的譜帶多而清晰（圖2）。

圖2　引物濃度的篩選注：M為DL2000；泳道1～5：所選引物的濃度分別為10、20、25、30、40　M。

2.3模板DNA濃度在一定范圍內(nèi)模板DNA含量對ISSR擴增結(jié)果的影響不大［14］，本研究對模板DNA的濃度設(shè)10、30、50、70、90、100 ng 6個水平，結(jié)果以50 ng DNA含量擴增的譜帶效果最好，其他擴增的條帶少且不清晰（圖3）。

圖3　DNA模板濃度的篩選注：M為DL2000；泳道1～6：模板DNA濃度分別為：10、30、50、70、90、100 ng。

經(jīng)過上述各因子的篩選，最后確定河北核桃的ISSR-PCR反應(yīng)體系為：20L體系中含10×PCRBuffer（Mg2+Plus）2L，dNTPs（各2.5 mM）1.6L，TaqDNA聚合酶1.0 U，引物25M，模板DNA 50 ng。

2.4引物退火溫度引物的退火溫度對ISSR-PCR的影響非常明顯，不同的引物其退火溫度亦不相同，為了得到專一性好、分辨率高的擴增譜帶，本試驗對引物進行退火溫度的測定。圖4是對引物ISSR08進行的退火溫度篩選，結(jié)果以53.2℃擴增的條帶最清晰（圖4）。

圖4　不同退火溫度對擴增結(jié)果的影響注：M為DL2000；泳道1～8：56、55.4、54.6、53.2、51.5、50.3、49.4、49℃。

2.5優(yōu)化條件的應(yīng)用按照以上擴增體系，利用引物ISSR08對18個河北核桃樣品進行PCR擴增，結(jié)果表明，這18個河北核桃樣品均能擴增出清晰可辨的條帶，多態(tài)性較高，條帶分子量一般都在2 000 bp以內(nèi)（圖5）。說明本試驗優(yōu)化的體系適合河北核桃ISSRPCR擴增。

圖5　部分樣品材料的ISSR擴增結(jié)果電泳圖（引物ISSR08）注：從左向右樣品依次為：細紋獅子頭、寶雞大邊公子帽、寶雞雞心、淶水2號、邯鄲獅子頭、寬邊獅子頭、YW、大邊公子帽5號、昌平3號、WW、昌平17號、昌平4號、昌平8號、昌平6號、淶水6號、楊偉獅子頭、淶水5號、昌平19號，DL2000 marker。

3　結(jié)論與討論

ISSR技術(shù)雖然具有重復性好、原理簡單的優(yōu)點，但由于ISSR是基于PCR的一種標記技術(shù)，其穩(wěn)定性易受許多因素的干擾。為此，必須對河北核桃ISSR反應(yīng)體系進行優(yōu)化。

PCR反應(yīng)中對模板濃度要求的范圍較寬，但不同材料及提取方法會對 DNA純度產(chǎn)生影響，其最佳DNA用量也是不同的，所以對DNA濃度進行優(yōu)化是必要的。

引物的濃度是影響擴增特異性的重要因素之一，較低或較高的引物濃度均不能得到清晰的產(chǎn)物。本試驗中所設(shè)計的幾個引物濃度中，結(jié)果以25M效果最佳。

Taq酶的用量也是影響PCR的一個重要因素，本試驗選用1.0 U的Taq酶為最佳用量，與果樹上已建立的柑橘類［15-16］、板栗［17］等ISSR反應(yīng)體系的TaqDNA聚合酶用量相同。

引物的退火溫度極大地影響著ISSR反應(yīng)的進行，引物、物種或類型不同，其退火溫度亦不相同。本試驗與楊恩使用同一物種不同類型的材料，利用同一引物，其退火溫度亦不相同。所以必須對引物退火溫度進行篩選，確定最佳溫度，提高反應(yīng)的特異性。此外，為確保試驗的穩(wěn)定性，盡量選用同型號儀器、同一廠家同批藥品與試劑等。

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國家科技支撐計劃項目（2006BAD01A17）

中圖分類號：S664.1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-9402（2016）02-0005-03

收稿日期：2016-01-05

*通訊作者：張志華