于田田，遲 杰（天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072）

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超聲萃取-高效液相色譜測定土壤/沉積物中1-羥基芘①

于田田，遲 杰*
（天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072）

摘 要：本文對超聲萃取土壤/沉積物中 1-羥基芘（1-hydroxypyrene）的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，建立了一種超聲萃取-高效液相色譜-熒光檢測1-羥基芘的方法。結(jié)果表明：甲醇和二氯甲烷的混合溶劑為最佳萃取溶劑；甲醇與二氯甲烷的體積比是影響萃取效率的主要因素。通過正交試驗(yàn)進(jìn)一步確定了最佳提取條件為：甲醇/二氯甲烷體積比35∶65、土液比2 g∶10 ml、提取時間20 min、提取次數(shù)3次。在最佳提取條件下，5種不同類型的土壤/沉積物中1-羥基芘的加標(biāo)回收率數(shù)值變化范圍很大（6.6% ～ 83.3%），并且這種變化與樣品的pH密切相關(guān)，而與樣品總有機(jī)碳含量無關(guān)。

關(guān)鍵詞：1-羥基芘；超聲萃??；正交試驗(yàn)；pH

多環(huán)芳烴（PAHs）是環(huán)境中普遍存在的持久性有機(jī)污染物。其中，微生物降解是去除環(huán)境中PAHs的主要途徑。在細(xì)胞內(nèi)色素P450氧化酶系統(tǒng)［1］作用下，PAHs可轉(zhuǎn)化生成羥基代謝物（OH-PAHs）。較母體而言，OH-PAHs的潛在毒性和致癌性更強(qiáng)［2］，而且OHPAHs的存在還會顯著抑制其他母體PAHs的降解［3］。此外，OH-PAHs可作為生物標(biāo)志物來評價人體PAHs的近期暴露水平［4］。因此，監(jiān)測環(huán)境樣品中的 OHPAHs十分重要。其中，1-羥基芘（1-hydroxypyrene）的研究最多，也是使用最廣泛的生物標(biāo)志物［4］。例如，研究發(fā)現(xiàn)尿液中1-羥基芘與人體暴露的14種PAHs均呈顯著正相關(guān)關(guān)系［5］。

土壤/沉積物中 OH-PAHs分析方法的報道并不多，這主要是因?yàn)橥寥?沉積物的基體復(fù)雜，使得樣品中OH-PAHs的預(yù)處理過程比較復(fù)雜且回收率往往偏低［6］。王曉瑋［7］采用快速溶劑萃取-分散相液液微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測定了底泥中 8 種OH-PAHs，方法檢測限0.01 ～ 0.23 μg/kg，回收率57.6% ～ 91.1%，RSD≤11.07%。Baltrons等［8］采用微波萃取和分子印跡多聚體的預(yù)處理方法-高效液相色譜配熒光檢測器（HPLC-FLD）測定了土壤中 4種OH-PAHs，方法檢測限0.003 ～ 0.014 μg/kg，回收率68% ～ 93%，RSD≤8%。由于上述文獻(xiàn)中研究所采用的儀器比較昂貴，不是很普及，因此需要建立一個簡單、實(shí)用的測定土壤/沉積物中的OH-PAHs的方法。

超聲提取法操作簡單、省時、儀器價格低且溶劑用量較少，被廣泛使用，但是未見超聲法提取沉積物中 1-羥基芘的報道。本研究以1-羥基芘為目標(biāo) OHPAHs，建立了超聲萃取-HPLC-FLD測定土壤/沉積物中 1-羥基芘的方法，研究了萃取溶劑和萃取條件對1-羥基芘回收率的影響，確定了最佳萃取條件。然后，利用建立的方法測定了不同類型土壤/沉積物中 1-羥基芘的回收率，分析了土壤/沉積物的性質(zhì)對 1-羥基芘回收率的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1-羥基芘（98%）購自法國Sigma Aldrich公司；流動相甲醇為色譜純（加拿大Fisher Scientific公司）；水為Milli-Q超純水；其余試劑均為分析純。用丙酮配制1mg/L的加標(biāo)儲備液；用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)曲線母液1 mg/L，置于棕色瓶中4℃冰箱保存。

采集了3種沉積物（0 ～ 10 cm）樣品和2種土壤樣品。沉積物分別采自海河天津市區(qū)段（H）、天津大學(xué)敬業(yè)湖（J）、南開大學(xué)馬蹄湖（M）；土壤樣品分別為江西鷹潭的紅壤（R）和天津大港的堿土（S）。采集的樣品冷凍干燥后，研磨過80目篩，備用。按文獻(xiàn)［9］方法測定樣品的基本理化性質(zhì)，結(jié)果見表1。

表1 土壤/沉積物的理化特性Table 1 Physical and chemical properties of soils/sediments

1.2 樣品的提取和分析

以海河天津市區(qū)段沉積物（H）作為實(shí)驗(yàn)沉積物進(jìn)行超聲提取條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行萃取劑的選擇，選擇二氯甲烷、甲醇、丙酮和乙腈為萃取劑進(jìn)行比較，確定最合適的溶劑。在此基礎(chǔ)上，選取溶劑體積分?jǐn)?shù)、土液比、超聲時間和超聲次數(shù)為考察因素，并根據(jù)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計4因素3水平的正交試驗(yàn)，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定最佳提取條件。

提取方法：取2 g海河沉積物（H）按照設(shè)定的萃取條件（萃取溶劑體積分?jǐn)?shù)、土液比、萃取時間和萃取次數(shù)）進(jìn)行超聲提取，水溫控制在20 ～ 30℃。超聲提取后的溶液于4 000 r/min離心15 min。合并提取液，旋轉(zhuǎn)濃縮至約1 ml，轉(zhuǎn)移并定容至2 ml。經(jīng) 0.7 μm玻璃纖維濾膜（Whatman）過濾后，HPLCFLD測定。

提取液采用Waters Alliance 2695高效液相色譜儀分析。色譜儀配有熒光檢測器和C18柱。樣品分析采用甲醇-水梯度洗脫，連續(xù)自動進(jìn)樣。柱溫40℃；自動進(jìn)樣量20 μl；流動相為甲醇和水。流動相切換程序?yàn)椋? ～ 5 min，甲醇75%；5 ～ 15 min，甲醇75% ～85%；15 ～ 20 min，甲醇85% ～ 100%；20 ～ 25 min，甲醇100%；25 ～ 28 min，甲醇75% ～ 100%；28 ～ 33 min，甲醇75%。整個過程的流速均為0.6 ml/min。熒光檢測器的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為239 nm和392 nm。

1.3 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過了嚴(yán)格的質(zhì)量控制程序。對于樣品分析，均運(yùn)行溶劑空白和方法空白，以檢查干擾和污染。沉積物和土壤的溶劑空白和方法空白中均沒有檢出目標(biāo)化合物。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對 1-羥基芘進(jìn)行定量分析，峰面積（y，μv·s）與濃度（x，μg/L）的線性回歸方程：y =1.97x-1.16（R2=0.9999）。1-羥基芘保留時間Rt= 9.295 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑的選擇

根據(jù)相關(guān)研究［8，10，11］選擇7種溶劑或混合溶劑進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。提取條件為：提取劑15 ml，超聲時間15 min，超聲次數(shù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示?？梢?，當(dāng)萃取劑為甲醇和二氯甲烷的混合溶液時，回收率最高。這一結(jié)果可以用相似相容原理解釋。由于酚羥基的存在，1-羥基芘的極性大于母體［6，12］，提取時應(yīng)選擇與之極性相似且能形成氫鍵的溶劑。表2中4種溶劑的極性大小順序?yàn)椋憾燃淄椋急技状迹家译?。二氯甲烷為弱極性溶劑，甲苯和乙腈的混合溶劑極性較強(qiáng)，并且這兩種溶劑均不能形成氫鍵，因此回收率很低（＜10%）。單獨(dú)甲醇雖能與 1-羥基芘形成氫鍵，但是極性較高且黏度較大，回收率僅為15.9%。將二氯甲烷與甲醇混合之后，可以同時降低溶劑的極性和黏度，回收率明顯提高。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇甲醇和二氯甲烷的混合溶劑進(jìn)行提取劑的進(jìn)一步優(yōu)化。

表2 不同提取溶劑下的1-羥基芘回收率（%）Table 2 Recovery percentage of 1-hydroxypyrene with different extraction solvents

2.2 超聲提取條件的優(yōu)化

以 1-羥基芘的提取量為考察目標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果列于表3和表4。表3中，極值R反映了各因素對回收率影響的主次順序。可見，各因素對回收率的影響順序?yàn)椋杭状俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲時間＞土液比＞超聲次數(shù)。方差分析結(jié)果（表4）顯示，所選取的4個因素中，甲醇體積分?jǐn)?shù)對提取率有顯著影響（P＜0.1），超聲時間、土液比和超聲次數(shù)的影響不顯著。根據(jù)表3中k的最大值所對應(yīng)的水平可以確定提取條件的優(yōu)水平組合為A2B3C3D3。

考慮到溶劑量大會造成污染，而且超聲次數(shù)是影響回收率的次要因素，因此在優(yōu)水平的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了A2B2C3D2的驗(yàn)證試驗(yàn)（即超聲次數(shù)取3次，土液比2g︰10ml）。結(jié)果表明：超聲3次時，回收率為64.9% （RSD = 9.01%），與超聲4次時的回收率（65.8%，RSD = 3.21%）相差不大。而且超聲3次時1-羥基芘提取量為132.85 μg/kg，高于正交試驗(yàn)表中任何一種組合。最終確定最佳的提取條件為：甲醇/二氯甲烷體積比35︰65、土液比2 g︰10 ml、超聲時間20 min、超聲次數(shù)3次。

表3 超聲法提取1-羥基芘的正交試驗(yàn)設(shè)計L9（34）及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design L9 （34） and results of 1-hydroxypyreneby ultrasonic extraction

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

2.3 土壤/沉積物的性質(zhì)對回收率的影響

按照最佳提取條件研究了土壤/沉積物的性質(zhì)對回收率的影響，結(jié)果見表 5?？梢姡煌愋屯寥?沉積物中 1-羥基芘的回收率值相差很大，其數(shù)值范圍在6.6% ～ 83.3%。其中，紅壤R中1-羥基芘的回收率最高，堿土S中1-羥基芘的回收率最低。王愛麗［9］對酞酸酯的主要代謝物MBP和MEHP的研究中發(fā)現(xiàn)，其回收率隨土壤/沉積物總有機(jī)碳含量的降低而明顯增加。然而，本研究中紅壤和堿土的總有機(jī)碳含量相同（表1），這說明總有機(jī)碳對1-羥基芘回收率的影響不顯著。值得注意的是，紅壤和堿土的pH相差很大。堿土 pH最高，為 9.8；紅壤pH最低，為5.7（表1）。進(jìn)一步的 Pearson相關(guān)分析證實(shí)，1-羥基芘的回收率與土壤/沉積物 pH呈顯著負(fù)相關(guān)（r =-0.928，n =5，P = 0.023），這可能是因?yàn)椋?-羥基芘是弱酸，在酸性環(huán)境中以分子態(tài)形式存在。分子態(tài)1-羥基芘在甲醇與二氯甲烷的混合溶劑中溶解度大，因此提取效率高。與此相反，在堿性環(huán)境中 1-羥基芘以離子態(tài)形式存在，在甲醇與二氯甲烷的混合溶劑中溶解度小，因而提取效率低。

付登強(qiáng)等［13］的研究指出，土壤pH顯著影響PAHs的去除，酸性條件下有利于高環(huán)PAHs的去除，中性條件下有利于低環(huán)PAHs的去除。究其原因，可能是，土壤pH既影響PAHs的化學(xué)行為，又影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和活性。該研究首次報道了pH對泥漿反應(yīng)去除土壤中PAHs的影響，但土壤/沉積物pH對1-羥基芘回收率的影響，國內(nèi)外還未見報道。

表5 超聲提取各土壤/沉積物中1-羥基芘的回收率（%）Table 5 Recovery percentage of 1-hydroxypyrene from different soils/sediments by ultrasonic extraction

將文獻(xiàn)值標(biāo)記在圖 1中，與本研究結(jié)果進(jìn)行比較。采用快速溶劑萃取-分散相液液微萃取-GC-MS法測定紅樹林底泥（pH 5.3）中 1-羥基芘，加標(biāo)濃度0.01 mg/kg，回收率為67.6% ± 11.1%［7］；采用微波萃取和分子印跡多聚體的預(yù)處理方法測定淋溶的棕壤土（pH 5.7）中1-羥基芘，加標(biāo)濃度0.2 mg/kg，回收率為68% ± 6%［8］。對比可知，對于pH相近的土壤/沉積物，本研究中提取方法的回收率（83.3%）明顯高于文獻(xiàn)值。

圖1 1-羥基芘回收率與沉積物pH的關(guān)系Fig.1 Relationship between 1-hydroxypyrene recovery and sample pH

3 結(jié)論

1） 本研究建立了一種低成本、省時的超聲萃取土壤/沉積物中 1-羥基芘的方法。最佳萃取條件為：提取劑為甲醇/二氯甲烷混合溶液（35︰65，v/v），土液比2 g︰10 ml，超聲時間20 min，超聲次數(shù)3次。其中，甲醇與二氯甲烷的體積比是影響萃取效率的主要因素。

2） 土壤/沉積物的pH對1-羥基芘的回收率影響顯著。pH越低，1-羥基芘的回收率越高；酸性和弱堿性土壤/沉積物中 1-羥基芘的回收率可達(dá) 60% 以上。對于pH相近的土壤/沉積物，本研究建立的超聲提取法的回收率明顯高于文獻(xiàn)值。

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中圖分類號：X502

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.03.018

基金項目：①國家自然科學(xué)基金項目（21377091）資助。

* 通訊作者（cjiechi@163.com）

作者簡介：于田田（1991—），女，山東高唐人，碩士研究生，主要從事環(huán)境生物修復(fù)研究。E-mail: yutiantian057@163.com

Determination of 1-hydroxypyrene in Soil/Sediment byUltrasonic Extraction-High Performance Liquid Chromatography

YU Tiantian， CHI Jie*
（Institute of Environmental Science and Technology， Tianjin University， Tianjin 300072， China）

Abstract:This study optimized the ultrasonic extraction conditions for 1-hydroxypyrene from soil/sediment， and established a method of ultrasonic extraction and high performance liquid chromatography with fluorescence detection for 1-hydroxypyrene.The results showed that: the mixed solvent of methanol and dichloromethane is the best extraction solvent； the volume ratio of methanol/dichloromethane is the key factor determining extraction efficiency.The optimal parameters determined by orthogonal experiment were: the volume ratio of methanol / dichloromethane 35︰65， sample/solvent ratio 2 g︰10 ml，extraction time 20 min， and repeated extraction three times.Under the optimal extraction conditions， recovery percentage of 1-hydroxypyrene in five types of soil/sediment changed in the range of 6.6%- 83.3%， and the change was closely related to the sample pH.The total organic carbon of the samples did not affect the recovery percentage of 1-hydroxypyrene.

Key words:1-hydroxypyrene； Ultrasonic extraction； Orthogonal experiment； pH