張煥杰，余璐，朱文穎，孔海南，林燕上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240

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固定化反硝化菌在低污染水處理中脫氮性能研究

張煥杰，余璐，朱文穎，孔海南，林燕*
上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240

摘要：在面源低污染水的原位修復(fù)領(lǐng)域，人工濕地生物脫氮過(guò)程受溫度、pH波動(dòng)影響以及NO2--N積累抑制反硝化脫氮效果等問題，因此強(qiáng)化系統(tǒng)脫氮性能在實(shí)際工程應(yīng)用中具有重要意義。固定化微生物技術(shù)具有環(huán)境變化適應(yīng)能力以及耐毒害能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。該研究通過(guò)分離篩選高效反硝化菌，對(duì)其進(jìn)行DNA序列分析鑒定及其種屬和系統(tǒng)發(fā)育地位分析，并以包埋法加以固定，考察固定化反硝化菌在不同溫度、pH、DO和 C/N下的反硝化性能，分析各因素變化對(duì)固定化反硝化菌脫氮效果的影響，探究各影響因素對(duì)固定化反硝化菌脫氮性能的作用機(jī)理，以期為固定化反硝化菌強(qiáng)化人工濕地脫氮性能提供參考。經(jīng)反硝化能力測(cè)定，篩選得到的高效反硝化菌株對(duì)NO3--N、TN的去除率分別為98.83%、98.36%，NO2--N積累量?jī)H為0.28 mg·L-1，24 h內(nèi)脫氮效率為8.59 mg·L-1·h-1，經(jīng)16S rRNA測(cè)序結(jié)果表明該菌株與Pseudomonas stutzeri A1501的最大相似度為99.7%。采用PVA、SA為材料包埋固定該菌株，固定化反硝化菌的生物量為15.67 g·L-1，顆粒密度為0.93 g·mL-1。通過(guò)對(duì)固定化反硝化菌處理低污染水的性能研究得知，pH、T、DO的波動(dòng)對(duì)固定化反硝化菌的脫氮效果影響均小于游離反硝化菌，固定化反硝化菌在pH為7，θ為30 ℃，DO為0.87～1.54 mg·L-1，C/N為5時(shí)的脫氮效果最好。

關(guān)鍵詞：反硝化菌；固定化；脫氮性能；低污染水

引用格式：張煥杰， 余璐， 朱文穎， 孔海南， 林燕. 固定化反硝化菌在低污染水處理中脫氮性能研究［J］. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)， 2016，25（5）: 857-863.

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伴隨工業(yè)的發(fā)展，我國(guó)大部分城鎮(zhèn)飲用水源已受到不同程度的污染，有數(shù)據(jù)表明，我國(guó)七大水系中IV類和V類水體占22.9%，劣V類水體占32.0%（葉少帆等，2010），水源水的污染問題日益嚴(yán)重，尋求處理低污染水源的對(duì)策和技術(shù)變得至關(guān)重要。近年來(lái)，人工濕地作為一種生態(tài)工程手段用于處理達(dá)標(biāo)后排放的尾水或污染較重的溝渠水，對(duì)這些低污染水的處理，可有效減輕湖泊流域水體的污染負(fù)荷（黃娟等，2009），其對(duì)流域面源污染水體的原位修復(fù)研究也取得了一定效果（Rai et al.，2013）。

潛流人工濕地內(nèi)近 90%的有機(jī)物和含氮化合物是依靠附著在植物根系和土壤等基質(zhì)表面的微生物作用去除的，其中微生物的硝化和反硝化作用是人工濕地內(nèi)氮素去除的主要途徑（Saeed et al.，2012），但人工濕地的脫氮效率受氣溫影響較大，在低于15 ℃的環(huán)境下，含氮污染物的去除效果不佳（Sun et al.，2010）；脫氮過(guò)程中濕地系統(tǒng)內(nèi)pH的變化在一定程度上也會(huì)影響硝化-反硝化的作用效果（Cheikh et al.，2013）；而且，不少潛流濕地非植物根際區(qū)因溶解氧不足，硝化反應(yīng)進(jìn)行不徹底，導(dǎo)致NO2--N積累，對(duì)反硝化菌產(chǎn)生毒害作用，從而使生物脫氮的整個(gè)過(guò)程受阻（王小曉等，2014）。因此，削弱溫度、pH等因素波動(dòng)以及NO2--N積累對(duì)反硝化作用的影響可改善人工濕地的脫氮效果。

本研究將分離篩選所得的高效反硝化菌進(jìn)行DNA序列分析鑒定及其種屬和系統(tǒng)發(fā)育地位分析，并以包埋法加以固定，考察固定化反硝化菌在不同溫度、pH、DO和C/N下的反硝化性能，分析各因素變化對(duì)固定化反硝化菌脫氮效果的影響，探究固定化反硝化菌脫氮的最佳條件，并為固定化反硝化菌投加至人工濕地以強(qiáng)化脫氮效果時(shí)的投加位置和所需碳源量提供參考。

1　材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

反硝化培養(yǎng)液：KNO32 g·L-1，酒石酸鉀鈉20 g·L-1，K2HPO40.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1。

固態(tài)反硝化培養(yǎng)基：KNO31.5 g·L-1，CH3COONa 2 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，酵母膏3 g·L-1，葡萄糖1 g·L-1，NaCl 6 g·L-1，瓊脂12 g·L-1，pH為7.0～7.2。

1.2 廢水水質(zhì)

人工模擬低污染水主要污染物為 NO3--N和COD，成分為 KNO3、葡萄糖、K2HPO4、MgSO4·7H2O，具體濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。

1.3 反硝化菌的篩選

1.3.1 反硝化菌的富集

自云南大理鄧北橋濕地采集基質(zhì)樣品（礫石）50 g置于500 mL錐形瓶中，加入300 mL已滅菌的反硝化培養(yǎng)液，蓋不透氣橡膠塞，置于30 ℃、100 r·min-1搖床恒溫振蕩培養(yǎng)。待觀察到瓶中培養(yǎng)液液面有大量氣泡后，吸取20 mL的菌液進(jìn)行富集，連續(xù)富集5次。將富集后的菌液采用倍比稀釋法稀釋，并涂布至固體培養(yǎng)基，靜置于 30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至長(zhǎng)出明顯菌落。

1.3.2 反硝化菌的分離純化

待上述固體培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌落后，用接種環(huán)逐個(gè)挑取形態(tài)各異的菌落至新的固體培養(yǎng)基平板，劃線分離。挑取分離出來(lái)的菌株，在平板上劃線純化，至顯微鏡下觀察顯示無(wú)雜菌。分離出的菌株接種至斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 反硝化能力測(cè)定

將分離得到的反硝化菌（8株，分別記為A、B、C、D、E、F、G、H）以 5%的接種量分別接種于裝有300 mL反硝化培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，置于30 ℃、100 r·min-1搖床恒溫振蕩培養(yǎng)4 d。每隔12 h測(cè)定培養(yǎng)液中OD600和NO3--N、NO2--N、TN濃度，以判斷菌株反硝化能力，篩選高效菌株。

1.4 純化菌株鑒定

取菌種接種于反硝化培養(yǎng)液，置于30 ℃、100 r·min-1搖床恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，8000 r·min-1離心5 min后的菌體作為樣品，由微基生物（上海）科技有限公司完成菌種的鑒定。具體方法如下，菌種基因組DNA抽提采用CTAB法；16S擴(kuò)增引物為8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTAYGACTT-3'。 PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；步驟2循環(huán)25次，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物回收采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒；PCR產(chǎn)物克隆使用BioLinker的pED-T載體試劑盒，PCR測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.5 反硝化菌擴(kuò)培

從固態(tài)反硝化培養(yǎng)基上挑取菌株一環(huán)放入裝有300 mL反硝化培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，置于30 ℃、100 r·min-1搖床恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，然后按5%的接種量在相同條件下培養(yǎng)24 h，8000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，用無(wú)菌水重復(fù)洗滌3次，制成菌懸液備用。

1.6 反硝化菌株的固定化

稱取8 g PVA和2 g SA于90 mL蒸餾水中，80 ℃水浴加熱并攪拌至均勻糊狀，冷卻至 30 ℃后，加入10 mL菌懸液，攪拌均勻后，用注射器滴入含2% CaCl2的飽和硼酸溶液中硬化24 h，交聯(lián)成3～5 mm的固定化顆粒。無(wú)菌水沖洗后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余的放于4 ℃無(wú)菌生理鹽水中保存。

1.7 固定化反硝化菌性能

1.7.1 固定化反硝化菌投加量的確定

分別稱取固定化反硝化菌顆粒1、5、10、20 g加入裝有100 mL人工模擬低污染水（NO3--N濃度約為5 mg·L-1，C/N為5）的150 mL三角瓶中，置于30 ℃、100 r·min-1搖床振蕩，每12 h取水樣，測(cè)定NO3--N、NO2--N、TN濃度。

1.7.2 pH、θ、DO、C/N對(duì)固定化反硝化菌脫氮效果的影響

稱取固定化反硝化菌顆粒 10 g分別加入裝有100 mL人工模擬低污染水（根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整）的150 mL三角瓶中置于30 ℃（θ實(shí)驗(yàn)除外）、100 r·min-1搖床中振蕩，24 h后取水樣（C/N實(shí)驗(yàn)每隔12 h取樣1次），測(cè)定NO3--N、NO2--N、TN濃度（表1）。

表1　反硝化性能實(shí)驗(yàn)影響因素設(shè)計(jì)表Table 1　Experiment design for factors affecting denitrification performance

1.8 測(cè)試方法

水質(zhì)監(jiān)測(cè)：NO3--N、NO2--N、TN的測(cè)定分別采用 QC-8500流動(dòng)注射儀。DO、pH測(cè)定采用HQ300D DO測(cè)定儀，PHS-3CT pH計(jì)。

反硝化菌生長(zhǎng)情況（OD600）測(cè)定采用UV2600紫外可見分光光度計(jì)。

2　結(jié)果與分析

2.1 反硝化菌的反硝化能力測(cè)定

根據(jù) 4 d后 8株反硝化菌在反硝化培養(yǎng)液中NO2--N積累量和NO3--N、TN的去除率以及OD600數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)分析可知（如圖1所示），8株反硝化菌都具有較高的NO3--N去除率，但菌株A、E由于NO2--N的積累量較大而使其TN去除率較低，可見NO3--N去除率并不能作為反硝化菌反硝化能力高低的單一指標(biāo)，綜合分析NO2--N積累量和NO3--N、TN的去除率3個(gè)指標(biāo)，篩選出NO3--N、TN去除率最高（分別為98.83%、98.36%）、NO2--N積累量最低（0.28 mg·L-1）的菌株C作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的高效反硝化菌。菌株C在48 h內(nèi)的脫氮效率為5.56 mg ·L-1·h-1，在96 h內(nèi)的脫氮效率為2.75 mg ·L-1·h-1。

圖1　8株反硝化菌的反硝化能力及生長(zhǎng)情況比較Fig. 1　Comparison of denitrification ability and growth of 8 strains of denitrifying bacteria

2.2 菌種鑒定及分析

對(duì)菌株C樣品經(jīng)基因組DNA抽提，16S PCR擴(kuò)增，T載體轉(zhuǎn)化（目的條帶大小為1500 bp）后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，鑒定結(jié)果表明菌株C與Pseudomonas stutzeriA1501（序列號(hào)為NR_074829.1）的最大相似度為99.7%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道P. stutzeriA1501可以在土壤中存活，為內(nèi)生菌定殖于植物根部表面，并侵入根皮層的表面層（Rediers et al.，2003），因此該菌在人工濕地植物根區(qū)基質(zhì)中可富集并分離。燕永亮等（2005）通過(guò)全基因組“Shotgun”法繪制該菌株的基因組草圖，與其他反硝化菌比對(duì)結(jié)果表明，P. stutzeriA1501株中的 40個(gè)反硝化基因組成了一套完整的反硝化催化系統(tǒng)，且P. stutzeriA1501株中nir基因（亞硝酸鹽還原酶類）有16個(gè)，是所有已知反硝化菌中nir基因數(shù)量最多的。由亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氧化氮的過(guò)程是反硝化作用有別于其他硝酸鹽代謝的標(biāo)志性反應(yīng)，是反硝化過(guò)程中最重要的限速步驟，亞硝酸鹽還原酶（Nir）是催化此反應(yīng)的限速酶（郭麗蕓等，2011），且從圖1 可看出，P. stutzeriA1501株的NO2--N積累量很少。另外，該菌株不僅具有反硝化功能，還表現(xiàn)出對(duì)硝酸鹽的固氮酶活性，并且在自然環(huán)境和微好氧條件下具有很好的固氮能力。

圖2　菌株C 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2　Phylogenetic tree of strain C based on 16S rRNA

由圖 2的系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，菌株 C與Pseudomonas stutzeri的進(jìn)化距離最為接近，確定其為施氏假單胞菌，其所屬的假單胞菌屬是自然界中存在最普遍的反硝化菌之一（方晶晶等，2010）。目前已有多種P. stutzeri的菌株被篩選出來(lái)，用于反硝化脫氮的有菌株 T13、RCH2、ZoBell等，也有用于固氮研究的，如菌株 B1SMN1、KOS6、DSM4166等（Yan et al.，2008；Li et al.，2012；Han et al.，2010；Pe?a et al.，2012；Busquets et al.，2012；Grigoryeva et al.，2013；Yu et al.，2011）。圖 2所示進(jìn)化距離與菌株 C較為接近的是Pseudomonas otitidis，有研究表明，該菌主要用于染料廢水脫色，其對(duì)三苯甲烷類染料具有不錯(cuò)的脫色效果（Wu et al.，2009）。類產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligene）也具有一定的反硝化能力，不同的是其含有耐熱堿性脂肪酶基因等。通過(guò)對(duì)菌株C的系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了其在所屬菌屬中反硝化作用的能力與地位。

2.3 固定生物量

100 mL均勻糊狀載體與反硝化菌菌懸液的混合物反硝化菌濃度為15.67 g·L-1，固定化反硝化菌顆粒密度為0.93 g·mL-1，1 g固定化顆粒中所含反硝化菌質(zhì)量平均為0.02 g。與吸附法固定微生物相比，包埋法所固定的微生物量較高。當(dāng)然，所固定微生物的量因固定材料的不同而有所差異，如Ye et al.（2012）實(shí)驗(yàn)研究中未經(jīng)固定的活性污泥反應(yīng)器中的生物量為4 g·L-1，以聚氨酯材料為載體吸附固定的微生物量為12.8 g·L-1；而Rezaee et al.（2008）研究中使用微生物纖維素吸附 P. stutzeri的生物量約為1.0 mg·g-1。

2.4 固定化反硝化菌投加量的確定

綜合分析在不同固定化反硝化菌顆粒投加量下，NO2--N濃度以及TN去除率隨時(shí)間的變化如圖3所示。當(dāng)固定化反硝化菌顆粒投加量分別為1、5、10 g時(shí)，隨著固定化反硝化菌顆粒投加量增加，TN去除率增大，但當(dāng)固定化反硝化菌顆粒投加量增至20 g，反硝化進(jìn)行12 h后，由于NO2--N的積累，其TN去除率最低。盡管36 h后其TN去除率有所提高，但仍低于投加量10 g下相同時(shí)刻的TN去除率，說(shuō)明該反硝化系統(tǒng)中的限速有可能發(fā)生在亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化中。

2.5 pH、θ、DO、C/N對(duì)固定化反硝化菌脫氮效果的影響

從圖4中不同pH下NO3--N濃度變化圖以及TN去除率變化可知，固定化反硝化菌和游離反硝化菌的適宜pH范圍均為7～8。對(duì)于游離態(tài)反硝化菌，當(dāng)pH低于7或高于8時(shí)，反硝化作用很弱，可見pH變化對(duì)其影響很大。當(dāng)pH為8和6時(shí)，固定化反硝化菌的TN去除率明顯高于游離反硝化菌，這說(shuō)明，固定化作用在一定程度上緩解了 pH變化對(duì)反硝化菌的影響（He et al.，2012），其他研究者的結(jié)論也從不同角度分析了固定化作用對(duì)反硝化性能的改善，如王建龍（2003）通過(guò)分析多種有毒抑制物質(zhì)及不利環(huán)境對(duì)固定化微生物的影響，認(rèn)為固定化微生物對(duì)環(huán)境耐受性優(yōu)于游離微生物的原因視環(huán)境因素的不同而不同，對(duì)溫度、pH等環(huán)境因素的適應(yīng)性則主要是由于固定化載體對(duì)微生物細(xì)胞產(chǎn)生了保護(hù)作用，也有研究認(rèn)為這可能是由于固定化材料對(duì)NO3--N的吸收作用造成的（Ma et al.，2015）。

圖3　不同固定化反硝化菌投加量下的TN去除率及NO2--N濃度變化Fig. 3　Changes in total nitrogen removing rate and nitrite concentration under different dosage of immobilized denitrifying bacteria

從圖4可以看出，固定化反硝化菌與游離反硝化菌對(duì)TN的去除效果最好的溫度均為30 ℃，不同的是二者抵抗環(huán)境溫度變化的能力，當(dāng)溫度自30 ℃降至10 ℃，從不同溫度下NO3--N濃度變化圖以及TN去除率變化圖中可明顯看出，固定化反硝化菌的脫氮效果雖不如其在 30 ℃時(shí)，但優(yōu)于相同溫度下游離反硝化菌的脫氮效果。雖然在此過(guò)程中固定化反硝化菌的 NO2--N濃度稍高于游離反硝化菌，但總體 NO2--N濃度很低，而且，隨著處理時(shí)間的增加，NO2--N繼續(xù)減少。結(jié)合目前人工濕地在低污染水處理的脫氮效率受氣溫影響較大的現(xiàn)狀（Werker et al.，2002），本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較固定化與游離反硝化菌在溫度范圍為 10～40 ℃時(shí)的反硝化性能，可以看出固定化反硝化菌在人工濕地系統(tǒng)中應(yīng)用占據(jù)一定優(yōu)勢(shì)。

圖4　pH、溫度、DO、C/N對(duì)固定化反硝化菌的反硝化性能影響Fig. 4　Effects of Ph， Temperature， DO， C/N on denitrification of immobilized denitrifying bacteria

在DO對(duì)固定化反硝化菌影響實(shí)驗(yàn)中，DO設(shè)置為5個(gè)梯度范圍。由圖4中TN去除率變化分析可見，游離反硝化菌在整個(gè) DO變化范圍內(nèi)，TN去除率隨DO濃度升高呈減弱趨勢(shì)。與此不同的是，固定化反硝菌的TN去除率先升高后降低，DO濃度為0.87～1.54 mg·-L1時(shí)固定化反硝化菌的TN去除率最高，為71.21%。結(jié)合NO3--N和NO2--N濃度變化圖分析，DO濃度從 0.38～0.82 mg·L-1增至0.87～1.54 mg·L-1的過(guò)程中，固定化反硝化菌對(duì)NO3--N的利用增加，且NO2--N的積累量減少，可能是由于在一定的DO濃度范圍內(nèi)，適當(dāng)提高混合速度有利于固定化顆粒固液界面物質(zhì)的傳質(zhì)過(guò)程，從而有利于反硝化作用的進(jìn)行。當(dāng) DO濃度從0.87～1.54 mg·L-1增至1.78～2.26 mg·L-1時(shí)，TN去除率變化明顯，說(shuō)明此時(shí)的DO變化對(duì)固定菌的反硝化作用影響較大。DO濃度在 1.78～2.26 mg·L-1到3.31～4.16 mg·L-1波動(dòng)范圍內(nèi)，固定化作用對(duì)氧氣擴(kuò)散的阻礙（Omar，1993）使得多余DO對(duì)固定化反硝化菌的影響小于游離反硝化菌，從而使固定化反硝化菌顯示出一定的優(yōu)勢(shì)。研究表明，固定化實(shí)驗(yàn)操作中微生物細(xì)胞濃度和PVA、SA凝膠的均勻性會(huì)影響固定化顆粒對(duì)氧氣的擴(kuò)散速率（Hulst et al.，1985；Martinsen et al.，1992）。

對(duì)于低污染水的脫氮處理常存在碳源不足的問題，通過(guò)外加碳源可加強(qiáng)脫氮效果，但外加碳源如果不適量，有可能造成二次污染，而通過(guò)固定化方法將反硝化過(guò)程控制在投加碳源的反應(yīng)器內(nèi)部，使多余碳源重復(fù)利用成為可能。由圖4可知，當(dāng)固定化反硝化菌處理低污染水（初始NO3--N濃度為5 mg·L-1）12 h時(shí)，NO3--N濃度隨C/N的增加而減少，NO2--N濃度和TN去除率隨著C/N的增加而增加，其中C/N為1的固定化反硝化菌的TN去除率明顯低于其他幾組。當(dāng)處理48 h時(shí)，C/N為5、7、10 的3組實(shí)驗(yàn)之間的TN去除率相差不到2%，多余碳源的存在反而會(huì)增加NO2--N積累量。因此，實(shí)驗(yàn)中固定化反硝化菌所需的最佳C/N為5。在實(shí)際人工濕地系統(tǒng)中，可通過(guò)固定菌投加位置及方式的設(shè)計(jì)改進(jìn)，綜合考慮系統(tǒng)進(jìn)水水質(zhì)特點(diǎn)，以及濕地植物根系分泌物中可利用碳源的產(chǎn)生情況，提高系統(tǒng)對(duì)碳源的利用率，從而緩解碳源不足的問題。

3　結(jié)論

經(jīng)富集、分離、純化后得到8株反硝化菌，篩選得到NO3--N、TN去除率最高（分別為98.83%、98.36%）、NO2--N積累量最低（0.28 mg·L-1），24 h內(nèi)脫氮效率為8.59 mg·L-1·h-1的菌株C，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后為Pseudomonas stutzeriA1501（序列號(hào)為NR_074829.1）。

固定化反硝化菌的生物量為15.67 g·L-1，固定化反硝化菌顆粒密度為0.93 g·mL-1， 1 g固定化顆粒中所含反硝化菌量平均為0.02 g。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中人工模擬低污染水（NO3--N濃度約為5 mg·L-1，C/N 為 5），固定化反硝化菌顆粒的最適投加量為 0.1 g·mL-1。pH為 7，θ為 30 ℃，DO質(zhì)量濃度為0.87～1.54 mg·L-1時(shí)的脫氮效果最優(yōu)。

在模擬低污染水處理實(shí)驗(yàn)研究中，pH、θ、DO的波動(dòng)對(duì)固定化反硝化菌的脫氮效果影響均小于游離反硝化菌。低溫10 ℃時(shí)，固定化反硝化菌仍可實(shí)現(xiàn)47.35%的總氮去除率。

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DOI：10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.05.019

中圖分類號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5906（2016）05-0857-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)（2012ZX07105-003）

作者簡(jiǎn)介：張煥杰（1991年生），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗廴究刂萍吧鷳B(tài)修復(fù)。E-mail: 963484028@qq.com

*通信作者：林燕（1976年生），博士，副教授。E-mail: linyan2002@sjtu.edu.cn

收稿日期：2016-03-08

Nitrogen Removal Characteristics of Immobilized Denitrifying Bacteria for Treatment of Slightly-polluted Water

ZHANG Huanjie， YU Lu， ZHU Wenying， KONG Hainan， LIN Yan
School of Environmental Science and Engineering， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China

Abstract：Denitrification technology plays an important role in in situ remediation of slightly-polluted water. However， the denitrification performance is affected by temperature， pH and the nitrite accumulation particularly in constructed wetland （CW）. In this work， a novel immobilized microbial technology， with the advantages of high adaptability and strong poison resistance， was developed to improve the nitrogen removal efficiency in CW systems. A dominant species denitrifying bacteria “C” was isolated and identified by DNA sequence and phylogenetic analysis. On this basis， its denitrification performances and mechanisms were investigated at varied temperatures， pH， DO， and C/N to address the optimized conditions for nitrogen removal. The results showed that strain “C”， which had 99.7% maximum sequence similarity with Pseudomonas stutzeri A1501， was the superior bacteria with the removal efficiencies of 98.83% for NO3--N and 98.36% for TN， respectively. The nitrate removal rate was found to be up to 8.59 mg N·L-1·h-1by 24 h while the nitrite accumulation was just 0.28 mg·L-1. Furthermore， the denitrifying bacteria “C” was immobilized with PVA and SA to address its denitrification performance in practice. Given the operating conditions of 15.67 g·L-1biomass and 0.93 g·mL-1density， the influence of pH， T， DO on nitrogen removal for immobilized denitrifying bacteria were less than that for free denitrifying bacteria. Also， the optimized conditions for maximum nitrogen removal were found to be pH=7， θ=30 ℃，DO=0.87～1.54 mg·L-1and for C/N=5. The results may provide a positive reference for the enhanced denitrification technology used in the remediation for constructed wetland.

Key words：denitrifying bacteria； immobilization； constructed wetland； slightly-polluted water