羅春良，張　琇，徐小春

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

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濕地土壤產(chǎn)纖維素降解菌株的篩選及其性質(zhì)研究

羅春良，張琇，徐小春

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

摘要：采用稀釋涂平板法從寧夏濕地土壤樣品中篩選出一株纖維素降解活力較高的菌株C6-2，經(jīng)鑒定該菌株為煙曲霉菌(Aspergillus fumigates)，對菌株C6-2發(fā)酵產(chǎn)酶條件及其所產(chǎn)酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，菌株C6-2的最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，該菌株能在以微晶纖維素或羧甲基纖維素鈉或小麥秸稈為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，并可產(chǎn)生具有較好熱穩(wěn)定性的羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶。

關(guān)鍵詞：濕地土壤；纖維素降解菌；篩選；煙曲霉菌

以農(nóng)作物秸稈等木質(zhì)纖維素[1]原料開發(fā)纖維素乙醇等清潔能源是解決能源危機的重要途徑。纖維素乙醇是環(huán)境友好型生物質(zhì)燃料[2]，可通過纖維素酶、半纖維素酶轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素得到。雖然纖維素酶和半纖維素酶已應(yīng)用于工業(yè)中，但酶解效率低仍是木質(zhì)纖維素生產(chǎn)第二代燃料乙醇的瓶頸[3-6]。纖維素酶來源非常廣泛，原生動物、微生物(細(xì)菌、真菌、放線菌等)都具有降解纖維素或合成、分泌纖維素的能力。其中微生物的種類豐富、分布廣泛，是纖維素酶、半纖維素酶的重要來源[2]。微生物降解木質(zhì)纖維素主要依靠自身產(chǎn)生的纖維素酶和半纖維素酶[7]。濕地生態(tài)系統(tǒng)蘊藏著豐富的微生物資源[8-9]。但從濕地生態(tài)系統(tǒng)分離篩選纖維素酶產(chǎn)生菌鮮有報道。

寧夏氣候干燥，降雨量少，土壤pH值呈弱堿性，濕地生態(tài)系統(tǒng)具有獨特的環(huán)境特點，土壤微生物具有獨特的適應(yīng)性。鑒于此，作者采集寧夏銀川閱海國家濕地公園和銀川沙湖景區(qū)的濕地土壤，通過稀釋涂平板法篩選獲得纖維素降解菌株，并選擇其中一株進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)測試和菌株鑒定，擬為纖維素酶資源的開發(fā)利用提供參考。

1實驗

1.1土壤樣品采集

土壤樣品采集于銀川閱海國家濕地公園蘆葦蕩中含有腐爛蘆葦秸稈的土壤以及銀川沙湖景區(qū)蘆葦蕩中砂質(zhì)土壤和含有腐爛蘆葦秸稈的土壤，土壤樣品采集完畢后保存于4 ℃冰箱，備用。

1.2小麥秸稈樣品的制備

小麥秸稈采集于北方民族大學(xué)校園北側(cè)1km處的小麥田，自然晾干后用粉碎機粉碎至粒徑約為1mm，再依次用自來水、蒸餾水清洗、過濾，除去小麥秸稈中的灰塵。清洗后的小麥秸稈置于45 ℃烘箱中烘干，再置于14%氨水(固液比為1∶10)中于70 ℃水浴鍋中密閉浸泡18h，然后用蒸餾水反復(fù)浸泡沖洗小麥秸稈至清洗液pH值為中性，即得到小麥秸稈樣品。

1.3培養(yǎng)基

產(chǎn)酶菌株篩選液體培養(yǎng)基(g·L-1)：(NH4)2SO45，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01，CaCl20.1，小麥秸稈10，pH=5.0。固體培養(yǎng)基加入20g·L-1的瓊脂粉。

羧甲基纖維素鈉-剛果紅固體培養(yǎng)基(g·L-1)：羧甲基纖維素鈉2，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，(NH4)2SO42，NaCl0.5，剛果紅0.2，明膠2，瓊脂15，pH=7.3。

赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)基[10](g·L-1)：KH2PO41，NaCl0.1，MgSO4·7H2O0.3，NaNO32.5，F(xiàn)eCl30.01，CaCl20.1，pH=5.0。

濾紙條培養(yǎng)基：40mL赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)基中加入1條去淀粉新華濾紙(1cm×6cm)后裝于100mL三角瓶中，121 ℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨3，酵母粉0.5，(NH4)2SO42，KH2PO44，MgSO4·7H2O0.3，CaCl2·2H2O0.3，羧甲基纖維素鈉2，pH=5.0。

發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨3，酵母粉 0.5，(NH4)2SO42，KH2PO44，MgSO4·7H2O0.3，CaCl2·2H2O0.3，小麥秸稈20，吐溫20 0.2，pH=5.0。

1.4纖維素降解菌的篩選

在超凈工作臺中，按無菌操作程序，取0.5g土壤樣品置于100mL無菌三角瓶中，加入30mL無菌水和5～10個滅菌的小玻璃珠，30 ℃、120r·min-1振蕩30min，充分混勻得到土壤懸液，在無菌操作臺中靜置5～10min，采用梯度稀釋法將稀釋至10-3～10-6的土壤懸液分別涂布于產(chǎn)酶菌株篩選固體培養(yǎng)基平板上，于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每種平板重復(fù)2次。

待產(chǎn)酶菌株篩選固體培養(yǎng)基平板上長出菌落，觀察菌落大小、顏色、表面皺褶等，挑取形態(tài)有差異的菌落置于產(chǎn)酶菌株篩選液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、220r·min-1下培養(yǎng)24～48h。再通過菌落劃線法將菌液培養(yǎng)于產(chǎn)酶菌株篩選固體培養(yǎng)基平板，純化菌株，同時將篩選的菌株保藏于20%甘油中。

為驗證篩選到的木質(zhì)纖維素降解菌分泌表達(dá)羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶的特性，將篩選到的80株菌株用無菌牙簽點種于羧甲基纖維素鈉-剛果紅固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔12h觀察并記錄水解圈直徑及透明度、菌落直徑，選取水解圈直徑/菌落直徑(D)大于2的單菌落進(jìn)行后續(xù)實驗。

將篩選得到的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 30 ℃、220r·min-1下培養(yǎng)，分別測定各菌液的羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶活力；另將所獲單菌落接種于濾紙條培養(yǎng)基中，于30 ℃搖床中30r·min-1培養(yǎng)120h，觀察濾紙條降解情況。

1.5纖維素降解菌相關(guān)酶活力的測定

纖維素降解菌的羧甲基纖維素酶活力、木聚糖酶活力和葡聚糖酶活力均采用DNS方法測定。所用底物分別為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的羧甲基纖維素鈉、櫸木木聚糖和大麥葡聚糖，緩沖液為0.1 mol·L-1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH=5.0)。取1 800 μL相應(yīng)底物和200 μL稀釋的發(fā)酵液在50 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，加入3 mL DNS終止反應(yīng)，煮沸，5 min后冷卻至室溫，用分光光度計測定540 nm處吸光度(OD540)。將分析純的葡聚糖和木聚糖按上述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相關(guān)酶的活力。

1.6纖維素降解菌發(fā)酵特性和產(chǎn)酶分析

分析篩選菌株的發(fā)酵液酶活力及濾紙降解性能，最終選擇菌株C6-2作為測試菌株。在三角瓶中利用發(fā)酵培養(yǎng)基分別測試以2 g·L-1羧甲基纖維素鈉、2 g·L-1微晶纖維素和2 g·L-1小麥秸稈為底物時發(fā)酵液中不同酶活力的差異，分析測試不同培養(yǎng)溫度下菌株的生長情況和酶活力變化，利用發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株C6-2，測試?yán)w維素降解酶的熱穩(wěn)定性。

1.7菌種鑒定

離心收集發(fā)酵培養(yǎng)的C6-2菌株菌體，按照真菌基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Fungal DNA Midi Kit)的說明進(jìn)行真菌基因組提取，以真菌18S rDNA的通用引物(NS1 5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和NS8 5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′)對菌株C6-2進(jìn)行PCR 擴增，反應(yīng)體系(50 μL)為：10×PCR buffer 5 μL，dNTP mixture (2.5 mmol·L-1) 4 μL，Taq 酶(5 U·μL-1) 0.5 μL，NS1(20 μmmol·L-1) 1 μL，NS8(20 μmmol·L-1) 1 μL，基因組DNA(30 ng·μL-1) 1 μL，ddH2O 37.5 μL。

PCR擴增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將電泳獲得的產(chǎn)物切膠純化、測序[11]。

2結(jié)果與討論

2.1纖維素降解菌的篩選

通過產(chǎn)酶菌株篩選固體培養(yǎng)基平板共獲得具有水解圈的菌株30株，其中D大于2的菌株共18株，其性狀見表1。

表1纖維素降解菌株的性狀

Tab.1　Characteristics of cellulose degradation strains

注：“+”表示濾紙邊緣膨脹；“++”表示濾紙整齊膨脹并彎曲；“+++”表示濾紙不定型；“++++”表示濾紙成團(tuán)糊狀。

由表1可知，菌株C6-2能有效降解濾紙。

通過測定18株菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h的發(fā)酵液的木聚糖酶活力、葡聚糖酶活力和羧甲基纖維素酶活力，篩選出9株性狀優(yōu)良的菌株，其發(fā)酵培養(yǎng)液的酶活力見表2。

由表2可知，在以2 g·L-1羧甲基纖維素鈉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h，菌株C6-2發(fā)酵液中的木聚糖酶活力、葡聚糖酶活力和羧甲基纖維素酶活力均明顯高于其它菌株。因此，選擇菌株C6-2作為纖維素降解菌。

表2性狀優(yōu)良的菌株發(fā)酵培養(yǎng)液的酶活力/(IU·mL-1)

Tab.2　Enzyme activities for fermentation broth of strains with good properties/(IU·mL-1)

2.2菌株C6-2的鑒定

以菌株C6-2基因組DNA為模板PCR擴增18S rDNA序列。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出的18S rDNA片段為2.3 kb左右。將測序得到的18S rDNA序列使用Blast工具與GenBank序列比對，結(jié)果顯示，該序列與煙曲霉菌(Aspergillusfumigates)的相似性為99%。

2.3菌株C6-2的發(fā)酵特性分析

2.3.1發(fā)酵培養(yǎng)基對酶活力的影響

在250 mL三角瓶中分別用含有2 g·L-1的羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、小麥秸稈的發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基在30 ℃、220 r·min-1下培養(yǎng)菌株C6-2，每隔24 h取樣，測定葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力，結(jié)果見圖1。

圖1　發(fā)酵培養(yǎng)基對酶活力的影響Fig.1　Effect of fermentation medium on enzyme activity

由圖1可知，以微晶纖維素為碳源時發(fā)酵液中木聚糖酶活力和葡聚糖酶活力最高；以羧甲基纖維素鈉為碳源時葡聚糖酶活力高于以小麥秸稈為碳源時的酶活力；發(fā)酵24 h，以小麥秸稈為碳源時木聚糖酶活力最高，以羧甲基纖維素鈉為碳源時木聚糖酶活力最低；發(fā)酵48 h和72 h，以微晶纖維素為碳源時木聚糖酶活力最高；發(fā)酵48 h，以小麥秸稈為碳源時的木聚糖酶活力高于以羧甲基纖維素鈉為碳源時的酶活力；發(fā)酵72 h，以羧甲基纖維素鈉為碳源時的木聚糖酶活力高于以小麥秸稈為碳源時的酶活力。

2.3.2培養(yǎng)溫度對酶活力的影響

在250 mL三角瓶中用含有2 g·L-1小麥秸稈的發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株C6-2，分別在30 ℃、37 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃下于200 r·min-1培養(yǎng)，每隔24 h取樣，測定葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力，結(jié)果見圖2。

圖2　培養(yǎng)溫度對酶活力的影響Fig.2　Effect of cultural temperature on enzyme activity

由圖2可知，相同培養(yǎng)溫度下，葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力均隨著培養(yǎng)時間的延長而迅速升高，48～72 h的酶活力顯著升高；相同培養(yǎng)時間下，隨著培養(yǎng)溫度的升高，葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力總體呈下降趨勢。當(dāng)培養(yǎng)溫度為40 ℃時，第48～72 h的葡聚糖酶活力略高于37 ℃時的酶活力。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃、培養(yǎng)時間為72 h時，葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力均最高。表明，該菌株的最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，但30～40 ℃時的酶活力未出現(xiàn)顯著下降，說明該菌株能夠適應(yīng)30～40 ℃的培養(yǎng)溫度。

2.4菌株C6-2發(fā)酵產(chǎn)酶分析

采用發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)菌株C6-2，每隔24 h取樣，測定羧甲基纖維素酶、葡聚糖酶和木聚糖酶的活力，結(jié)果見圖3。

圖3　菌株C6-2在發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)時的酶活力Fig.3　Enzyme activity of strain C6-2 cultivated in fermentation induction medium

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，羧甲基纖維素酶活力、葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力均呈升高趨勢。在相同條件下，羧甲基纖維素酶活力和葡聚糖酶活力相差不大，而木聚糖酶活力最高。

將培養(yǎng)了72 h的發(fā)酵液離心，取上清液在50 ℃水浴鍋中分別熱處理30 min和60 min，測試相應(yīng)的酶活力，結(jié)果見圖4。

圖4　菌株C6-2纖維素降解酶的熱穩(wěn)定性Fig.4　Thermostability of cellulose degradation enzyme from strain C6-2

由圖4可知，熱處理30 min后，葡聚糖酶殘余酶活力為65.76%，木聚糖酶殘余酶活力為74.25%，羧甲基纖維素酶殘余酶活力為72.87%；熱處理60 min后，葡聚糖酶、木聚糖酶、羧甲基纖維素酶的殘余酶活力依次為61.53%、69.03%和69.64%。表明，菌株C6-2所產(chǎn)纖維素降解酶具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.5討論

通過稀釋涂平板法篩選出一株具有良好纖維素降解性能的煙曲霉菌C6-2，該菌株易于培養(yǎng)，能夠利用多種木質(zhì)纖維素底物生長，具有較寬的生長溫度范圍。

發(fā)酵培養(yǎng)實驗表明，菌株C6-2能在以微晶纖維素或羧甲基纖維素鈉或小麥秸稈為唯一碳源的發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長，同時產(chǎn)生纖維素酶和半纖維素酶。所產(chǎn)羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶均具有較好的熱穩(wěn)定性。因此，以木質(zhì)纖維素小麥秸稈基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為原料，同時也作為誘導(dǎo)物，能夠開發(fā)適應(yīng)于木質(zhì)纖維素降解菌的發(fā)酵工藝，在降低生產(chǎn)成本的同時也能夠生產(chǎn)纖維素、半纖維素降解酶，有助于擴大農(nóng)作物秸稈的應(yīng)用范圍。

3結(jié)論

采用稀釋涂平板法從寧夏濕地土壤樣品中篩選出一株纖維素降解活力較高的菌株C6-2，經(jīng)鑒定該菌株為煙曲霉菌(Aspergillusfumigates)。對菌株C6-2發(fā)酵產(chǎn)酶條件及其所產(chǎn)酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，菌株C6-2的最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，該菌株能在以微晶纖維素或羧甲基纖維素鈉或小麥秸稈為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，并可產(chǎn)生具有較好熱穩(wěn)定性的羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶。

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基金項目：國家民委留學(xué)人員擇優(yōu)資助項目，寧夏自然科學(xué)基金資助項目(NZ13080)，北方民族大學(xué)研究生創(chuàng)新項目

收稿日期：2016-03-08

作者簡介：羅春良(1985—)，男，河北保定人，碩士研究生，研究方向：生物資源利用，E-mail：luochunliang2008@126.com；通訊作者：張琇，博士，教授，E-mail：zhangxiu101@aliyun.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.010

中圖分類號：Q 939.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)07-0043-05

Screening and Characteristics of Cellulose Degradation Strains from Wetland Soils

LUO Chun-liang,ZHANG Xiu,XU Xiao-chun

(CollegeofBiologicalScienceandEngineering,BeifangUniversityofNationalities,Yinchuan750021,China)

Abstract：Strain C6-2 with high cellulose degradation activity was screened from Ningxia wetland soil samples by a dilution plate method.And it was identified as Aspergillus fumigates.The fermentation conditions and enzymatic properties of the strain C6-2 were studied.Results showed that，the optimal fermentation temperature was 30 ℃.Strain C6-2 could grow in a fermentation medium with wheat avicel or CMC or straw as the only carbon source and produce carboxymethyl cellulase,xylanase and glucanase with good thermostability.

Keywords：wetland soil;cellulose degradation strain;screening;Aspergillus fumigates

羅春良，張琇，徐小春.濕地土壤產(chǎn)纖維素降解菌株的篩選及其性質(zhì)研究[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(7)：43-47.