劉思思，田佳，張美艷，侯巧燕，莫文法，周英瓊

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院 病理科，廣西 桂林 541001）

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論著

細胞周期突變體相關蛋白激酶2、P-糖蛋白和谷胱甘肽巰基轉移酶-π在宮頸癌中的表達及臨床意義*

劉思思，田佳，張美艷，侯巧燕，莫文法，周英瓊

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院 病理科，廣西 桂林 541001）

摘要：目的檢測宮頸癌中細胞周期突變體（NIMA）相關蛋白激酶（Nek2）與耐藥蛋白P-糖蛋白（P-gp）、胱甘肽巰基轉移酶-π（GST-π）的表達及其與臨床病理特征的相關性。方法應用免疫組織化學法檢測144例宮頸癌組織和32例慢性宮頸炎非癌組織中Nek2、P-gp、GST-π的表達。結果①Nek2、P-gp和GST-π在宮頸癌及宮頸炎組織中的陽性表達率分別為（51.4%vs31.2%）、（55.6%vs 12.5%）和（73.6%vs53.1%），組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。②Nek2表達與宮頸癌組織學分級、臨床分期相關（P<0.05），與年齡、組織學類型、浸潤深度、細胞角蛋白（CK）、CK14、癌胚抗原（CEA）、抗癌基因P16、生存時間無關（P>0.05）。P-gp、GST-π在宮頸癌的陽性表達與以上臨床病理特征無相關性（P>0.05）。③宮頸癌中Nek2與P-gp、GST-π表達呈正相關（r=0.193和0.207，P<0.05）。結論Nek2可能介導宮頸癌中P-gp、GST-π的表達。Nek2、P-gp及GST-π蛋白在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及耐藥機制中發(fā)揮重要作用。聯(lián)合檢測對宮頸癌治療方案的合理制定及化療反應性的評估可能具有積極的臨床指導意義。

關鍵詞：宮頸癌；細胞周期突變體相關蛋白激酶2；P-糖蛋白；胱甘肽巰基轉移酶-π；耐藥性

宮頸癌是全世界女性的第2位高發(fā)癌癥，目前存在年輕化趨勢[1]。如今針對宮頸癌的治療仍以手術為主，聯(lián)合化療和放療的綜合治療?；熥鳛閷m頸癌患者主要的輔助治療越來越受到重視，但是隨著各種化療藥物的運用，腫瘤細胞表現(xiàn)出多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象，限制化療藥物的運用，從而導致化療失敗[2]。國內外研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌MDR的形成是多種機制共同參與的結果，主要與P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽巰基轉移酶-π（glutathione S-transferase-π，GST-π）過度表達，活性下降有關[3]。細胞周期突變體（never-inmitosis A，NIMA）相關蛋白激酶2（NIMA-related kinase 2，Nek2）是目前倍受關注的調節(jié)染色體分離的蛋白激酶，Nek2異常表達會影響有絲分裂的正常進行，從而誘導中心體不穩(wěn)定、細胞周期失調，亦與腫瘤的多藥耐藥產生有關[4]。對于不同級別宮頸癌中Nek2的表達及其與P-gp、GST-π相關性的研究國內外鮮見報道。因此，本研究旨在探討宮頸癌及慢性宮頸炎非癌組織中Nek2、P-gp、GST-π的表達，分析其與臨床病理特征的相關性以及相互間表達的聯(lián)系。

1　資料與方法

1.1病例資料

選取2009年1月-2011年12月廣西桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院手術切除的144例宮頸組織標本，經病理組織學證實均為宮頸癌。144例女性患者年齡29～79歲，中位年齡50歲。其中≤40歲23例，40～60歲96例，≥60歲25例；生存期≥5年123例，生存期在<5年21例（其中最短1例僅存活1月）；依《腫瘤組織病理學診斷》標準分級：Ⅰ級97例，Ⅱ級46例，Ⅲ級1例；采用宮頸癌國際婦產科協(xié)會（Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）臨床分期標準：Ⅰ、Ⅱ期95例，Ⅲ、Ⅳ期49例；據組織學類型：鱗癌136例，腺癌8例。另取經病理證實為慢性宮頸炎非癌組織32例（來自本院2015年就診患者）作為對照組。所有患者臨床及病理資料較完整。

1.2實驗方法與試劑

組織標本常規(guī)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4.0μm連續(xù)切片，采用即用型二步法（以EnVision通用檢測試劑盒為例）免疫組織化學法染色。按照免疫組織化學法試劑盒說明步驟進行Nek2、P-gp、GST-π檢測，其中一抗Nek2為兔抗人單克隆抗體，稀釋濃度為1∶800，購自艾博抗上海貿易有限公司（ab55550）。EnVision通用檢測試劑盒、即用型鼠抗人單克隆抗體P-gp、GST-π及二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯示試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。選取人的睪丸組織作為Nek2的陽性對照，選取人腸癌組織作為P-gp陽性對照，GST-π陽性對照為肺鱗癌組織，磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對照組。

1.3結果判定標準

Nek2蛋白主要表達于胞質及部分胞核。P-gp蛋白表達于胞膜及胞質。GST-π蛋白主要表達于胞質及部分胞核。以細胞內出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽性表達[5]。每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞。著色強度：無色為0分，淺黃色為1分，黃色及棕黃色為2分。陽性細胞數：<10%為0分；10%～50%為1分；>50%為2分，兩項得分相乘后分為兩級，結果≥2分為陽性，<2分為陰性。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計數資料以用百分比或率表示，用χ2檢驗及Spearman相關性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1宮頸癌組織與慢性宮頸炎非癌組織Nek2、P-gp、GST-π的表達及其與臨床病理特征的相關性

Nek2在癌組織的陽性表達率為51.4%，明顯高于慢性宮頸炎非癌組織（31.2%），經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.256，P=0.039）（見表1和圖1、2）。P-gp在癌組織的陽性表達率為55.6%，慢性宮頸炎非癌組織的陽性表達率12.5%，經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=41.454，P=0.000）（見表1和圖1、2）。GST-π在癌組織中陽性表達率為73.6%，高于慢性宮頸炎非癌組織的陽性表達率為53.1%，經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.221，P=0.022）（見表1和圖1、2）。在癌組織中，Nek2陽性表達隨組織學分級及臨床分期的增高而升高（P<0.05）（見表2）。兩組患者年齡、組織學類型、浸潤深度、細胞角蛋白（Cytokeratin，CK）、CK14、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、抗癌基因P16、生存時間等臨床病理特征比較，經χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（見表2）。而P-gp、GST-π在宮頸癌的陽性表達與以上臨床病理特征比較，經χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（見表2）。

2.2宮頸癌組織中Nek2與P-gp、GST-π表達的相關性

宮頸癌中Nek2與P-gp表達呈正相關（r=0.193，P<0.05）；Nek2與GST-π的表達呈正相關（r=0.207，P<0.05）（見表3）。

圖1　宮頸癌組織免疫組織化學法染色 （×40）

圖2　宮頸炎組織免疫組織化學法染色 （×40）

表1　宮頸炎和宮頸癌組織中Nek2、P-gp、GST-π表達比較　例

表2　臨床病理特征與宮頸癌組織中Nek2、P-gp、GST-π表達的關系　例

表3　宮頸癌組織中Nek2與P-gp、GST-π表達的相關性　例

3　討論

Nek2是有絲分裂酶第三家族中與絲/蘇氨酸蛋白激酶相關蛋白激酶同源性最高的基因。Nek2通過參與調節(jié)中心體和染色質凝縮及分離，直接干擾染色體，在整個基因組的穩(wěn)定中發(fā)揮至關重要的作用，同時可促使細胞惡性轉化，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤[6]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，Nek2在癌組織中的表達明顯高于慢性宮頸炎非癌組織，差異有統(tǒng)計學意義，與HAYWARD等[7]的研究結果相似。說明Nek2是一個危險因素，對促進腫瘤進展，宮頸癌的惡性轉化可能具有一定的意義。另外，耐藥基因P-gp、GST-π在宮頸癌組織中表達較高，均高于慢性宮頸炎非癌組織，提示耐藥基因的高表達可能在宮頸癌癌變耐藥的產生過程中發(fā)揮重要作用。

在對宮頸癌Nek2、P-gp、GST-π蛋白臨床病理特征的研究中發(fā)現(xiàn)，P-gp、GST-π的表達與患者年齡、組織學類型、臨床分期、組織學分級無關，與郭慈仁[3]和高波等[8]研究結果一致。在宮頸癌中Nek2的表達隨組織學分級及臨床分期的增高而升高，其與年齡、組織學類型、浸潤深度、CK、CK14、CEA、P16、生存時間無關，說明該基因的表達除組織學分級及臨床分期外是獨立于病理特征之外的因素，并不能充分反映與惡性程度的相關關系，并且可能需與其他因素共同作用才能影響腫瘤細胞癌變的發(fā)展程度。其與宮頸癌患者預后之間的關系是否可以作為宮頸癌獨立的預后指標，還需要進一步研究。

另外，研究表明，Nek2基因的過表達可顯著增強將化療藥物泵出細胞外的蛋白質活性，從而產生耐藥性[9]。而P-gp是多藥耐藥基因MDR-1的編碼產物，經ATP水解供能將藥物主動轉運出胞外，最終導致腫瘤耐藥[10]。GST-π是一種多功能藥物代謝酶，通過促進化療藥物與谷胱甘肽結合而產生耐藥，與腫瘤細胞的多藥耐藥關系最為密切[11]。Nek2基因與P-gp、GST-π呈正相關（P<0.05），可能共同調節(jié)宮頸癌的癌變，并在耐藥方面具有聯(lián)合促進作用。

綜上所述，Nek2是新發(fā)現(xiàn)的基因，廣泛高表達于多種腫瘤，在調節(jié)腫瘤細胞生長中發(fā)揮重要功能[12]。學者LIU等[13]認為，Nek2在卵巢癌的耐藥方面扮演重要角色，并可能成為主要的治療靶點。而在宮頸癌組織Nek2表達與臨床病理參數間的關系，及與公認的P-gp、GST-π多藥耐藥基因表達的相關性研究鮮有報道。本研究中，Nek2、P-gp、GST-π在宮頸癌組織中表達異常，且Nek2與P-gp、GST-π呈正相關，提示Nek2的表達異常與P-gp、GST-π介導的多藥耐藥在宮頸癌的化療耐藥中發(fā)揮協(xié)同作用，可能共同參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，為腫瘤耐藥機制的探索提供實驗依據。

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（童穎丹編輯）

中圖分類號：R 737.33

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.011

文章編號：1005-8982（2016）13-0058-05

收稿日期：2016-01-28

*基金項目：廣西省桂林市科學研究與技術開發(fā)項目（No：20140120-1-11）

[通信作者]周英瓊，E-mail：15977321166@163.com；Tel：15977321166

Expressions of Nek2，P-gp and GST-π in cervical cancer and their clinical significance*

Si-si Liu，Jia Tian，Mei-yan Zhang，Qiao-yan Hou，Wen-fa Mo，Ying-qiong Zhou
（Department of Pathology，the Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin，Guangxi 541001，China）

Abstract:Objective To explore the expressions of never-in-mitosis A-related kinase 2（Nek2），P-glycoprotein（P-gp）and glutathione S-transferase-π（GST-π）in cervical cancer，and analyze their correlations with clinical pathological features.Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of Nek2，P-gp and GST-π in the cervical cancer tissues of 144 cases and chronic cervicitis tissues of 32 cases.Then the relationships of Nek2，P-gp and GST-π with clinicopathologic parameters were analyzed.Results The positive expression rate of Nek2，P-gp and GST-π in 144 cases of cervical cancer and 32 cases of chronic cervicitis tissues were 51.4%vs 31.2%，55.6%vs 12.5%and 73.6%vs 53.1%respectively（P ＜0.05）.The positive expression rate of Nek2 in the cervical cancer tissues was correlated to histological grade and clinical stages（P ＜0.05），but not correlated with age，pathological type，depth of invasion，CK14，CEA，CK，P16 or survival time（P ＞0.05）.The positive expressions of P-gp and GST-π in the cervical cancers were not in correlation with the above clinicopathological features（P ＞0.05）.The expression of Nek2 in the cervical cancer was positively correlated with P-gp and GST-π expressions（r=0.193 and 0.207，P ＜0.05）.Conclusions Nek2 maybe mediates P-gp and GST-π expressions in cervical cancer.Nek2，P-gp and GST-π play vitalroles in the occurrence，development and drug-resistant mechanism of cervical cancer.

Keywords:cervicalcancer；never-in-mitosisA-relatedkinase2；P-glycoprotein；glutathione S-transferase-π；drug resistance