張亮　孫文獻(xiàn)　孫雅菲　裴文霞　羅聞?wù)妗O瑞　張占田　徐國華　孫淑斌

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 南京210095；*通訊聯(lián)系人, E-mail: sunshubin@njau.edu.cn)

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水稻轉(zhuǎn)錄因子基因OsPHR3在磷素利用過程中的作用

張亮孫文獻(xiàn)孫雅菲裴文霞羅聞?wù)鎸O瑞張占田徐國華孫淑斌*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 南京210095；*通訊聯(lián)系人,E-mail:sunshubin@njau.edu.cn)

ZHANGLiang,SUNWenxian,SUNYafei,etal.RolesoftranscriptionfactorgeneOsPHR3ontheutilizationofphosphateinrice.ChinJRiceSci, 2016, 30(4): 397-405.

張亮, 孫文獻(xiàn)， 孫雅菲, 等. 水稻轉(zhuǎn)錄因子基因OsPHR3在磷素利用過程中的作用. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(4)： 397-405.

摘要:磷是植物體生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，廣泛參與植物體多種生命活動。土壤中磷的有效性很低，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中限制作物產(chǎn)量的重要因素。OsPHR3(LOC_Os02g04640)屬于MYB-CC家族，與水稻中磷信號途徑中心調(diào)控因子OsPHR2是同源基因,且具有部分功能重疊。本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得OsPHR3基因的突變體和超表達(dá)材料，通過水培實(shí)驗(yàn)、32Pi同位素實(shí)驗(yàn)以及桶培實(shí)驗(yàn)來研究該基因在吸收利用磷素過程中的作用。水培實(shí)驗(yàn)表明，與野生型相比，突變體磷含量無明顯差異，基因超表達(dá)能夠提高水稻體內(nèi)磷含量。32Pi同位素實(shí)驗(yàn)顯示，與野生型相比，缺磷時(shí)突變體吸收速率降低，而該基因超表達(dá)能夠促進(jìn)磷素的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。桶培實(shí)驗(yàn)表明，該基因超表達(dá)能夠增加水稻有效分蘗數(shù)，提高種子中磷含量，該基因缺失使得穗長變短。OsPHR3基因可能調(diào)控促進(jìn)磷的吸收與向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)。該研究將為以后分子育種提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞:水稻； 磷酸鹽； OsPHR3

水稻是全球最重要的糧食作物之一，占世界谷類作物種植面積的1/3，約有一半的人口以稻米為主食。中國作為世界上水稻種植面積最大的國家，目前種植面積達(dá)3100多萬hm2，占世界總量的20% , 水稻產(chǎn)量占全國糧食總產(chǎn)的50%，是保證我國糧食安全的最重要作物[1,2]。世界上約有43%的耕地缺磷，我國的缺磷耕地占到2/3左右。因此，研究水稻對磷素的吸收利用機(jī)制，提高磷素利用率，對于提高作物產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

磷是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，占植物體干質(zhì)量的0.05%～0.5%[3]。是許多重要有機(jī)化合物(如核酸、蛋白、磷脂、ATP等)的組分，并且廣泛參與了植物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用、呼吸作用、糖酵解、三羧酸循環(huán)等代謝過程[4]。土壤中可以直接被植物吸收利用的磷的濃度一般不超過10μmol/L，有的甚至低于1μmol/L，遠(yuǎn)低于植物正常生長發(fā)育所需的磷濃度[5]。植物為了適應(yīng)土壤中的缺磷環(huán)境，經(jīng)過長期進(jìn)化形成了一系列的適應(yīng)性反應(yīng)，包括改變根系形態(tài)結(jié)構(gòu)、增加有機(jī)酸的分泌、與菌根真菌形成菌根共生體以及增強(qiáng)或誘導(dǎo)基因的表達(dá)等途徑來活化和提高土壤中磷的生物有效性[6-9]。

2001 年，Rubio等報(bào)道了擬南芥缺磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心調(diào)控因子 AtPHR1[10]。此后不同物種中 AtPHR1 的功能性同源基因相繼被發(fā)現(xiàn),擬南芥中MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子基因家族共有 15 個(gè)成員，其中與 AtPHR1 親緣關(guān)系最近的為At5g29000，命名為AtPHR1 。EMSA等實(shí)驗(yàn)表明AtPHR1 具有類似 AtPHR1 的體外結(jié)合P1BS的能力，說明MYB-CC家族轉(zhuǎn)錄因子間存在部分功能冗余[11]。2008年，Zhou等[13]用擬南芥AtPHR1(At4g28610)蛋白序列進(jìn)行BLAST分析，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)AtPHR1 的同源基因AK063486 和AK100065，分別命名OsPHR1 和 OsPHR2， 在轉(zhuǎn)錄水平基本不響應(yīng)缺磷誘導(dǎo)。正常供磷條件下，OsPHR2超表達(dá)會導(dǎo)致地上部磷的過量積累，表現(xiàn)出磷中毒癥狀，且根毛顯著多于野生型[12,13]，同時(shí)OsPHR2是水稻磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心調(diào)控因子[13]。OsPHR3(LOC_Os02g04640)是水稻中OsPHR2的同源基因，氨基酸序列同源性為45.21%，具有部分相似功能，與OsPHR1 和 OsPHR2共同參與下游磷相關(guān)基因的調(diào)控[13,14]。本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得該基因的超表達(dá)和敲除材料，通過水培實(shí)驗(yàn)、32Pi同位素吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)以及桶培實(shí)驗(yàn)研究了該基因在磷素利用過程中的作用，以期為后續(xù)的分子育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料：日本晴野生型(WildType;WT),純合突變體osphr3和 OsPHR3超表達(dá)材料。

1.2水稻和擬南芥中MYB-CC家族成員進(jìn)化樹分析

水稻OsPHR3與OsPHR1、OsPHR2一樣，同屬于MYB-CC家族成員。為了研究該基因在MYB-CC家族的進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)水稻和擬南芥中MYB-CC家族相關(guān)基因登錄號，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和TAIR(http://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站上獲得相應(yīng)的氨基酸序列，利用ClustalX和MEGA5.0軟件做進(jìn)化樹，引導(dǎo)程序設(shè)為 1000。

1.3 缺磷條件下OsPHR3的表達(dá)模式

以粳稻品種日本晴野生型為試驗(yàn)材料，1/2MS培養(yǎng)基發(fā)苗，7d后選擇生長一致的幼苗去種子移入7L培養(yǎng)箱中，每箱20棵苗，先清水緩苗然后全營養(yǎng)液培養(yǎng)7d進(jìn)行處理。設(shè)置為正常供磷營養(yǎng)液(0.30mmol/LKH2PO4，+P)和缺磷營養(yǎng)液(0.00mmol/LKH2PO4，-P)處理，缺磷處理的營養(yǎng)液中用0.30mmol/L的KCl補(bǔ)足K+的含量，其他營養(yǎng)成分參照IRRI水稻完全營養(yǎng)液配方。每天調(diào)pH至5.5，每3d換一次營養(yǎng)液，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù),處理14d后分為地上部和根系采樣，貯存于-70℃冰箱。采用Trizol法提取總RNA,cDNA合成用TaKaRa公司的定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A),使用SYBY定量RT-PCR試劑(DRR041A)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測。

1.4轉(zhuǎn)基因材料水培實(shí)驗(yàn)

根據(jù)OsPHR3基因序列信息，從韓國突變體網(wǎng)站SIGnALSalk(http://signal.salk.edu/)查詢突變體信息,鑒定后獲得3個(gè)株系的Tos17純合突變體，沉默效果很好，分別命名為osphr3-1、osphr3-2、osphr3-3。同時(shí)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到該基因的超表達(dá)材料，經(jīng)潮霉素篩選和GUS染色鑒定，得到日本晴陽性轉(zhuǎn)基因材料29個(gè)株系。然后定量RT-PCR鑒定超表達(dá)效果，選擇效果較好的3個(gè)株系Ox1、Ox2、Ox3進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

轉(zhuǎn)基因水稻株系和野生型材料，用1/2MS培養(yǎng)基發(fā)苗，7d后選擇生長一致的幼苗去種子移入7L培養(yǎng)箱中，每箱16棵苗，先清水緩苗然后全營養(yǎng)液培養(yǎng)7d進(jìn)行處理。設(shè)置為正常供磷營養(yǎng)液(0.30mmol/LKH2PO4，+P)和缺磷營養(yǎng)液(0.00mmol/LKH2PO4，-P)處理，其中缺磷處理的營養(yǎng)液用0.30mmol/L的KCl補(bǔ)足K+的含量，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，其他營養(yǎng)成分參照IRRI水稻完全營養(yǎng)液配方。每天調(diào)pH至5.5，每3d換一次營養(yǎng)液，處理21d后觀察表型并統(tǒng)計(jì)相關(guān)生理數(shù)據(jù)。

1.5水培條件下轉(zhuǎn)基因材料磷含量的測定

轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)水培缺磷處理21d后收獲，分為地上部和根系兩部分，鮮樣用液氮磨成粉末后稱取0.5g左右，用高氯酸提取法和硫酸-鉬酸銨比色法測定可提取磷含量；另外一批樣品105°C恒溫箱殺青30min，然后于70°C恒溫箱烘至恒重磨碎，稱取磨碎的植株樣品0.05g左右，采用硫酸-雙氧水消煮法和鉬銻抗比色法測定總磷含量。具體參照土壤農(nóng)化分析第三版進(jìn)行測定。

1.632Pi同位素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

正常供磷和缺磷條件下處理14d后的轉(zhuǎn)基因苗轉(zhuǎn)移到300mL的一次性杯子中進(jìn)行同位素示蹤實(shí)驗(yàn)，每杯3穴，每穴1株，每杯裝有160mL含100mg/LKH232PO4的IRRI營養(yǎng)液，每杯營養(yǎng)液中實(shí)際加入總量2.96×105Bq32Pi放射性原液。植株消解樣品鮮質(zhì)量控制在0.3g以下，消解過程使用2mL高氯酸和1mL雙氧水，室溫過夜消解樣品至清亮。取300μL消解樣進(jìn)行放射性測定，300μL消解樣加入5mL離心管中(管壁完全光滑無刻度無磨砂面)，再加入3.5mL閃爍液(型號OPTIPHASE“HISAFE”-3)，加入閃爍液后強(qiáng)烈搖晃離心管，放置后觀察混合液是否澄清均一，如無分層現(xiàn)象混勻后放置4h以上，在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)同位素實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測定。

1.7轉(zhuǎn)基因材料在正常供磷條件下的全生育期實(shí)驗(yàn)

為了觀察OsPHR3基因?qū)φ麄€(gè)生育期的影響，在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓基地進(jìn)行桶培實(shí)驗(yàn)，所用土壤取自江蘇省南京市牌樓地區(qū)酸性黃棕壤，每桶15kg土壤，每1kg土壤施肥量為尿素220mg/kg，KH2PO4120mg/kg，不施鉀肥。每個(gè)株系6個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)相關(guān)生理數(shù)據(jù)，成熟后收獲材料，把野生型和轉(zhuǎn)基因材料分為莖稈、葉鞘、穗柄3個(gè)部位，樣品在105 ℃下殺青30min，70 ℃下烘至恒重(3d左右)?？偭诇y定采用硫酸-雙氧水消煮和鉬銻抗比色法，具體參照土壤農(nóng)化分析第三版進(jìn)行測定。

1.8成熟期轉(zhuǎn)基因材料相關(guān)農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)

為了進(jìn)一步研究OsPHR3基因?qū)λ旧称鞴俚挠绊懀墒旌笫斋@材料測定種子中總磷含量，并對水稻的穗長、一次枝梗數(shù)、單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用軟件Excel和SigmaPlot10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1水稻和擬南芥中MYB-CC家族成員進(jìn)化樹分析

OsPHR3位于水稻第2條染色體上，cDNA全長1404bp，編碼467個(gè)氨基酸，有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。根據(jù)已報(bào)道的擬南芥中MYB-CC家族的15個(gè)成員和 OsPHR1、OsPHR2的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析。從圖1可以看出，水稻中OsPHR1和OsPHR2親緣關(guān)系較近，OsPHR3與擬南芥中At3g13040親緣關(guān)系較近。相對于OsPHR1來說，OsPHR3與OsPHR2的親緣關(guān)系更近一些。同時(shí)，可以看出OsPHR3與OsPHR1和OsPHR2不在一個(gè)分支上，即OsPHR3與OsPHR1和OsPHR2的功能可能存在一定的差異。

2.2缺磷條件下OsPHR3的表達(dá)模式

如圖2所示，在正常供磷和缺磷處理14d后，分別為地上部和根系采樣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后定量RT-PCR檢測OsPHR3基因的表達(dá)情況。從表達(dá)部位上來說，該基因在地上部的表達(dá)量高于根系。與正常供磷相比，缺磷條件下OsPHR3基因地上部和根系的相對表達(dá)量分別增加了40.6%和52.9%。說明該基因不論是地上部還是根系均受缺磷誘導(dǎo)。

2.3OsPHR3基因的缺失和超表達(dá)對水稻苗期生長的影響

為了研究OsPHR3基因?qū)λ久缙谏L的影響，選取苗齡7d的水稻幼苗正常供磷和缺磷處理，14d后統(tǒng)計(jì)并觀察表型。如圖3所示，與野生型相比，不論是在正常供磷還是缺磷條件下，突變體株高和根長均無明顯差異。在正常供磷條件下與野生型相比，超表達(dá)植株變得矮小，3個(gè)株系Ox1、Ox2和Ox3的株高分別比野生型降低了26.3%、17.3%和19.2%；根長也微弱降低(圖3-A、B、C)；而在缺磷條件下，與野生型相比，超表達(dá)材料株高和根長無明顯變化(圖3-D、E、F)。由此可見，與野生型相比，正常供磷條件下超表達(dá)植株生長受到抑制，而缺磷條件下并無明顯差異。這可能是由于正常供磷下，OsPHR3基因超表達(dá)導(dǎo)致水稻體內(nèi)磷過度積累，進(jìn)而導(dǎo)致超表達(dá)株系的生長受到抑制。

圖1水稻和擬南芥中MYB-CC家族成員進(jìn)化樹分析

Fig. 1.PhylogeneticanalysisofMYB-CCfamilymembersinriceandArabidopsis.

2.4水培條件下OsPHR3基因?qū)λ久缙诹缀康挠绊?/p>

為了解該基因的缺失和超表達(dá)后是否影響水稻苗期地上部和根系的磷含量，我們測定了野生型和轉(zhuǎn)基因株系在正常供磷和缺磷條件下地上部和根系的磷含量。我們發(fā)現(xiàn)(圖4)，不論是正常供磷還是缺磷條件下，突變體地上部和根系中磷含量均無明顯變化。正常供磷條件下，與野生型相比，超表達(dá)株系Ox1、Ox2地上部可提取磷含量分別增加了42.4%、35.2%(圖4-A)；而總磷含量的變化趨勢與可提取磷含量的變化趨勢相似，超表達(dá)Ox1、Ox2地上部的總磷含量分別增加了29.4%、28.8%，根系分別增加了48.8%、41.1%(圖4-C)。缺磷條件下，與與野生型相比較，超表達(dá)地上部和根系可提取磷含量無明顯變化(圖4-B)；而超表達(dá)Ox1、Ox2根系中總磷含量分別增加了58.3%、45.2%(圖4-D)。可以看出，不論是正常供磷還是缺磷條件下，OsPHR3的超表達(dá)均能促進(jìn)水稻磷素的吸收，提高水稻體內(nèi)的磷含量；但缺磷條件下，超表達(dá)株系只有根部總磷增加，而地上部變化不明顯?？赡苁窃摶虻某磉_(dá)雖然促進(jìn)水稻對磷的吸收，但是由于磷的轉(zhuǎn)運(yùn)相對滯后，且磷素的利用先發(fā)生于根部，因此，該基因的超表達(dá)未能影響其在缺磷條件下的轉(zhuǎn)運(yùn)。為此我們設(shè)計(jì)了32Pi同位素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果。

圖2OsPHR3基因在正常供磷和缺磷條件下的相對表達(dá)量

Fig. 2.RelativeexpressionofOsPHR3underPi-sufficientandPi-deficientconditions.

A-正常供磷條件下野生型和轉(zhuǎn)基因材料的表型，A的標(biāo)尺為5cm；B,C-正常供磷條件下野生型和轉(zhuǎn)基因材料的株高和根長；D-缺磷條件下野生型和轉(zhuǎn)基因材料的表型,D的標(biāo)尺為5cm；E,F-缺磷條件下野生型和轉(zhuǎn)基因材料的株高和根長。

A,PhenotypeofWTandtransgenicplantsunderPi-sufficientcondition,bar=5cm;B,C,PlantheightandrootlengthofWTandtransgenicplantsunderPi-sufficientcondition;D,PhenotypeofWTandtransgenicplantsunderPi-deficientcondition,bar=5cm;E,F,PlantheightandrootlengthofWTandtransgenicplantsunderPi-deficientcondition.

圖3不同供磷條件下野生型和轉(zhuǎn)基因材料表型分析

Fig. 3.ThephenotypicanalysisofWTandtransgenicplantsunderPi-sufficientandPi-deficientconditions.

A、C-正常供磷；B、D-缺磷。

A,C,UnderPi-sufficientcondition;B,D,UnderPi-deficientcondition.

圖4不同供磷條件下野生型和轉(zhuǎn)基因材料磷含量

Fig. 4.TotalPandPiconcentrationofWTandtransgenicplantsunderPi-sufficientandPi-deficientconditions.

A、C-正常供磷；B、D-缺磷。

A,C,UnderPi-sufficientcondition;B,D,UnderPi-deficientcondition.

圖532Pi同位素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)速率

Fig. 5.RateofPiuptakebyrootsandtransportationfromroottoshootsusing32Piisotope.

A-野生型和突變體桶培表型，標(biāo)尺為5cm；B-野生型和超表達(dá)桶培表型，標(biāo)尺為5cm。

A,ThephenotypeofWTandmutantmaterials,Bar= 5cm;B,ThephenotypeofWTandover-expressionmaterials,Bar= 5cm.

圖6正常供磷條件下桶培實(shí)驗(yàn)中野生型和轉(zhuǎn)基因材料表型及各部位總磷含量

Fig. 6.PhenotypeandtotalPconcentrationindifferenttissuesofWTandtransgenicplantsunderPi-sufficientpotexperiments.

2.5OsPHR3基因?qū)λ玖姿匚蘸娃D(zhuǎn)運(yùn)能力的影響

為了驗(yàn)證水培實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定OsPHR3基因缺失和超表達(dá)對水稻吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)磷素能力的影響，我們做了32Pi同位素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因材料在正常供磷和缺磷處理14d后，在加入100mg/LKH232PO4的IRRI營養(yǎng)液處理3h，測定吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)速率。結(jié)果如圖5所示，在缺磷條件下，與野生型相比，突變體材料吸收速率降低，其他無明顯變化。正常供磷條件下，與野生型相比，超表達(dá)材料的吸收速率明顯升高，但是轉(zhuǎn)運(yùn)速率無明顯變化(圖5-A、C)；缺磷條件下，超表達(dá)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)速率明顯升高(圖5-B、D)。可見，不論是在正常供磷還是缺磷條件下，OsPHR3超表達(dá)都能促進(jìn)磷的吸收，缺磷時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)速率明顯提高。

2.6OsPHR3基因缺失和超表達(dá)對水稻成熟期表型及各部位磷含量的影響

為了進(jìn)一步研究該基因在水稻整個(gè)生育期中的作用，我們對桶培至成熟期的野生型、突變體和超表達(dá)材料農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與觀測，并測定了野生型和轉(zhuǎn)基因材料莖稈、葉鞘和穗柄3個(gè)部分的總磷含量。如圖6所示，與野生型相比，突變體株高有變矮趨勢，但是有效分蘗數(shù)和各部位總磷含量無明顯變化。與野生型相比，超表達(dá)株高升高，三個(gè)株系Ox1、Ox2、Ox3的有效分蘗數(shù)分別增加了18.8%、16.3%、8.9%; 葉鞘總磷含量分別增加了38.3%、57.8%、30.3%，穗柄總磷含量分別增加了41.8%、63.4%、37.4%?？梢姡琌sPHR3基因超表達(dá)能夠提高水稻有效分蘗數(shù)，可能通過提高磷的吸收和向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高地上部磷含量。

2.7OsPHR3基因缺失和超表達(dá)對水稻繁殖器官的影響

為了研究該基因?qū)λ痉敝称鞴俚挠绊?，我們在水稻成熟期統(tǒng)計(jì)并觀察野生型、突變體及超表達(dá)材料繁殖器官的變化，并測定種子中的磷含量。如圖7所示，與野生型相比，突變體三個(gè)株系phr3-1、phr3-2、phr3-3穗長分別變短了17.6%、17.5%、13.3%, 一次枝梗數(shù)微弱降低，種子總磷含量無明顯變化。與野生型相比，超表達(dá)材料3個(gè)株系Ox1、Ox2、Ox3種子中總磷含量分別增加了22.2%、18.3%、21.6%，穗長和一次枝梗數(shù)無明顯變化。此外，與野生型相比，超表達(dá)材料3個(gè)株系Ox1、Ox2、Ox3的單株產(chǎn)量分別增加了15.8%、12.1%、7.7% ?？梢姡墒炱谕蛔凅w有株高、穗長、一次枝梗數(shù)降低的趨勢，而超表達(dá)種子中磷含量和單株產(chǎn)量增加。推測OsPHR3超表達(dá)材料可能通過增加種子中磷含量，影響水稻單株產(chǎn)量。

3討論

擬南芥中AtPHR1的發(fā)現(xiàn)是植物磷信號調(diào)控研究的重要節(jié)點(diǎn)，PHR1-miR399-PHO2調(diào)控模塊逐漸被驗(yàn)證[15,16]，并且以AtPHR1為中心的磷信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)越來越清晰[10,11,17,18]。在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)了AtPHR1的同源基因OsPHR1和OsPHR2，它們共同參與水稻中磷信號的調(diào)控，其中OsPHR2是水稻中磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心調(diào)控因子[13]。雖然水稻和擬南芥中PHR家族成員都存在著功能冗余，調(diào)節(jié)機(jī)制相似[19,20,21]，但是家族成員的功能上也存在著差異[14,22,23]。 例如，擬南芥中高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtPht1;1、AtPht1;4以及AtPHF1直接被AtPHR1調(diào)控[24,25]，但水稻中重要的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控基因OsPHF1，卻不是直接被OsPHR2調(diào)控[14,26]。水稻是單子葉植物，磷信號的調(diào)控過程十分復(fù)雜，許多基因是在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生作用，進(jìn)一步通過生理和形態(tài)學(xué)上的改變來適應(yīng)環(huán)境的變化[14,27-29]。

A-標(biāo)尺為2.5cm。

A,Bar= 2.5cm.

圖7野生型和轉(zhuǎn)基因材料穗型及種子總磷含量

Fig. 7.PaniclephenotypeandtotalPconcentrationingrainsofWTandtransgenicplants.

OsPHR3是OsPHR2的同源基因，氨基酸序列同源性為45.21%。進(jìn)化樹分析表明, 相對于OsPHR1來說，OsPHR3與OsPHR2的親緣關(guān)系更近一些(圖1)，推測兩者在調(diào)控水稻磷素利用過程中的功能相近。OsPHR3與OsPHR1和OsPHR2在表達(dá)模式上不同，后兩者在轉(zhuǎn)錄水平上不受缺磷誘導(dǎo)，而OsPHR3地上部和根系均受缺磷誘導(dǎo)(圖2),這3個(gè)基因共同參與水稻下游磷相關(guān)基因的調(diào)控[13,14]。AtPHR1和OsPHR2超表達(dá)材料能夠?qū)е碌厣喜苛追e累，從而使葉片壞死和生長受到抑制，出現(xiàn)磷中毒現(xiàn)象[10,12,13,30]。正常供磷條件下，OsPHR3超表達(dá)地上部可提取磷含量明顯高于野生型，同時(shí)地上部和根系總磷含量升高，但并未表現(xiàn)出磷中毒現(xiàn)象(圖4)。32Pi同位素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)表明超表達(dá)在不同供磷條件下都能促進(jìn)磷的吸收，缺磷條件下能夠提高磷的轉(zhuǎn)運(yùn)速率(圖5)。一般來說，擬南芥和水稻在缺磷條件下會出現(xiàn)根毛變長的現(xiàn)象[31-33]。最近，Guo等研究表明，與野生型相比，水稻OsPHR1、OsPHR2和OsPHR3基因的突變體根毛變短，而超表達(dá)根毛變長[14,31]。因此，水培條件下超表達(dá)株系的根毛變長，可以促進(jìn)對磷的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高植株體內(nèi)磷含量。OsPHR2超表達(dá)材料桶培高磷條件下表現(xiàn)出地上部磷中毒，結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量下降的現(xiàn)象[13]，但Guo等磷梯度田間實(shí)驗(yàn)顯示OsPHR3基因超表達(dá)能夠提高磷的利用效率，增強(qiáng)其耐低磷的能力，提高水稻產(chǎn)量[14]。本研究正常供磷桶培至成熟期，與野生型相比突變體材料無明顯變化；而超表達(dá)材料葉鞘、穗柄和種子等地上部總磷含量顯著提高，有效分蘗數(shù)和單株產(chǎn)量也明顯升高(圖6，圖7)。因此，OsPHR3有可能通過該基因超表達(dá)提高磷素的吸收和利用效率，從而影響水稻單株產(chǎn)量。

OsPHR3基因缺失后對水稻整個(gè)生長發(fā)育過程沒有顯著的影響，只有在成熟期水稻的株高、穗長等發(fā)生變化?？赡苁撬局写嬖贠sPHR1、OsPHR2和OsPHR3等磷調(diào)控基因且部分功能冗余[12-14,34]，OsPHR3基因缺失后代替該基因發(fā)揮功能，從而彌補(bǔ)該基因缺失帶來的影響。而OsPHR3超表達(dá)對水稻整個(gè)生長發(fā)育過程產(chǎn)生顯著影響，苗期地上部磷積累，成熟期種子中磷含量升高?？梢娫摶虺磉_(dá)對于磷素的利用具有重要的作用。

綜上所述，水稻OsPHR3基因超表達(dá)能夠促進(jìn)磷素的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，提高水稻有效分蘗數(shù)以及地上部和種子中的磷含量，提高水稻磷素利用效率。對于分子育種具有重要的借鑒意義，在減少肥料的施用和保護(hù)環(huán)境等方面具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會意義。

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收稿日期:2016-01-22； 修改稿收到日期: 2016-02-04。

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31172014)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20141367)；轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2014ZX0800931B; 2016ZX08009-003-005)。

中圖分類號:Q755; Q945.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1001-7216(2016)04-0397-09

RolesofTranscriptionFactorGeneOsPHR3ontheUtilizationofPhosphateinRice

ZHANGLiang,SUNWen-xian,SUNYa-fei,PEIWen-xia,LUOWen-zhen,SUNRui,ZHANGZhan-tian,XUGuo-hua,SUNShu-bin*

(College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;*Correspondingauthor,E-mail:sunshubin@njau.edu.cn)

Abstract:Phosphorus, an essential macronutrient element for plant growth and development, is broadly participating in various plant life activities. However, low availability of soil phosphate is a major constraint for crop production in many agricultural systems. OsPHR3(LOC_Os02g04640)is a homolog of OsPHR2, the central regulator of Pi-signaling in rice. Both OsPHR2and OsPHR3 belong to the MYB-CC family members and have functional redundancy in part. In this study, OsPHR3 knock-out and over-expression transgenic plants were obtained. The hydroponic culture,32Pi isotopic and pot experiments were used to demonstrate the role of OsPHR3 in rice phosphate untilization. First, hydroponic experiments showed that over-expression of OsPHR3increased the phosphorus content of the rice, although the knock-out lines had no significant difference with wild type plants. Second,32Pi isotopic experiments revealed that over-expression of the gene promoted the absorption and distribution of phosphate, while the absorption rate in knock-out lines decreased in comparison with wild type plants under Pi-deficient condition. Third, pot experiments demonstrated that over-expression of OsPHR3 enhanced the effective tillers and phosphorus content in seed. However, the panicle length in knock-out lines is shorter than in wild type plants. In conclusion, OsPHR3 is a potential transcription factor for improving P efficiency in rice through molecular breeding.

Key words:rice; phosphate; OsPHR3