舒亞洲　曾冬冬　秦冉　金曉麗　鄭希　石春海

(浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 農(nóng)學(xué)系， 杭州310058； *通訊聯(lián)系人， E-mail：chhshi@zju.edu.cn)

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水稻脆稈突變體bc16的鑒定和基因精細定位

舒亞洲曾冬冬秦冉金曉麗鄭希石春海*

(浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 農(nóng)學(xué)系， 杭州310058；*通訊聯(lián)系人， E-mail：chhshi@zju.edu.cn)

SHU Yazhou, ZENG Dongdong, QIN Ran, et al. Identification and gene fine mapping of abrittleculm16 (bc16) mutant in rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(4): 345-355.

舒亞洲, 曾冬冬, 秦冉, 等. 水稻脆稈突變體bc16的鑒定和基因精細定位. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(4)： 345-355.

摘要:脆稈突變體是一類研究植物機械強度的重要材料。利用EMS(甲基磺酸乙酯)誘變粳稻品種日本晴，篩選獲得一個脆稈突變體，命名為bc16(brittle culm16)。與野生型植株相比，bc16莖稈、葉片和根明顯變脆，而株高、穗粒數(shù)降低，穗長和主根長變短。莖稈細胞壁成分分析表明，bc16纖維素含量顯著低于野生型植株，半纖維素含量則顯著增加，而木質(zhì)素含量差異不顯著。突變體bc16薄壁細胞形狀無規(guī)則、排列紊亂，表皮層下厚壁細胞次生壁和薄壁細胞壁變薄。遺傳分析表明bc16突變體由隱性單基因控制，位于水稻第2染色體長臂端InDel標記2-F和2-H間66.6 kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間共有7個候選基因，其中Os02g0738900是bc3脆稈基因的等位基因。測序結(jié)果表明，bc16突變體中的Os02g0738900基因從ATG開始第5113位，在第13內(nèi)含子近末端發(fā)生了T→A的置換，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程中該內(nèi)含子末端6個核苷酸被剪切到mRNA中，最終導(dǎo)致翻譯提前終止。實時熒光定量PCR結(jié)果表明Os02g0738900基因在bc16脆稈突變體根、莖、葉中的表達量降低。bc16基因可能通過調(diào)控厚壁組織次生細胞壁和薄壁細胞初生壁的合成來影響水稻莖稈機械強度。

關(guān)鍵詞:水稻； 脆稈； 基因定位； 細胞壁合成

植物機械強度是一種重要的農(nóng)藝性狀，直接影響著作物的抗倒性。研究表明，引起水稻倒伏的主要原因是莖稈機械強度不足[1]。植物細胞壁是由多糖、蛋白質(zhì)等成分組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，支撐著植株形態(tài)的建成[2,3]。作為植株骨架的細胞壁，其主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，這些成分含量的高低密切影響著植株的機械強度。植物機 械組織主要對植株起支撐和保護作用，可分為厚壁組織和厚角組織兩類，其中位于維管組織周圍和表皮層以下的幾層厚壁細胞起著主要的支持作用，是影響水稻莖稈強度的主要結(jié)構(gòu)因子。脆稈突變體是一類莖稈機械強度降低、脆性增加的材料。一般而言，水稻脆稈突變體在細胞壁成分上通常會表現(xiàn)出纖維素含量降低，在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為厚壁組織次生細胞壁變薄[4,5]。

脆稈突變體是一類比較常見的突變體，擬南芥[6]、大麥[7,8]、小麥[9,10]和水稻[11]等植物中均已發(fā)現(xiàn)該類突變體。目前，發(fā)現(xiàn)并命名的水稻脆稈突變體有20多個，如bc9311-1、NBC(t)、dbc1等[12-14]，已精細定位或克隆了BC1～BC8、BC10～BC12、BC14和BC15等基因，并對BC1、BC3、BC6、BC7、BC12、BC14、BC15等基因的功能進行了研究，研究表明多數(shù)脆稈基因參與了纖維素的代謝[15]。Li等[16]克隆了可編碼COBRA蛋白的基因BC1，該基因突變后會引起水稻細胞壁的次生壁變薄，纖維素含量降低，半纖維素和木質(zhì)素含量增加等。Hirano等[17]和Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)水稻脆稈突變體bc3，該突變體表現(xiàn)出根、莖、葉變脆易折斷，根長變短，厚壁組織細胞壁和薄壁細胞壁變薄等特點，進一步研究表明水稻脆稈基因BC3編碼1個經(jīng)典的發(fā)動蛋白家族OsDPR2B蛋白，參與水稻次生壁的合成。Kotake等[19]對位于第9染色體上的不完全顯性基因BC6進行研究，結(jié)果表明該基因參與了編碼纖維素合酶催化亞基，其突變后能夠顯著降低纖維素含量。Yan等[20]從60Co-γ射線誘導(dǎo)粳稻品種中花11中獲得脆稈突變體bc7(t)，將編碼纖維素合酶亞基突變基因定位于水稻第1染色體長臂8.4 kb的區(qū)域內(nèi)。Zhang等[21]在粳稻品種C418發(fā)現(xiàn)的脆稈突變體bc12，其纖維素含量變化不明顯，而半纖維素含量增加了50%，纖維素微纖絲方向發(fā)生改變和木質(zhì)素含量顯著增加引起植株莖稈變脆；進一步研究發(fā)現(xiàn)編碼水稻驅(qū)動蛋白BC12是一個雙靶向驅(qū)動蛋白，在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布，主要參與了細胞分裂中微管的排列。Zhang等[22]研究顯示，BC14編碼的水稻核苷酸糖轉(zhuǎn)運蛋白OsNST1位于高爾基體上，該基因突變可導(dǎo)致細胞壁纖維素含量降低，從而引起植物機械強度的下降而表現(xiàn)脆性。Wu等[23]在中花8號胚性愈傷組織中獲得了一個穩(wěn)定遺傳的脆稈突變體bc15，其纖維素含量較野生型降低23%，而阿拉伯糖和木糖分別增加58%和77%；該基因已定位于第9染色體標記M2和M3之間114 kb內(nèi)，序列分析發(fā)現(xiàn)Os09g0494200基因編碼區(qū)發(fā)生了一個錯義突變，導(dǎo)致213位丙氨酸突變成亮氨酸；蛋白功能研究表明BC15編碼了一個膜相關(guān)的類幾丁質(zhì)酶蛋白，其突變會導(dǎo)致纖維素含量的降低，進而導(dǎo)致莖稈機械強度的下降。雖然已有的水稻脆稈突變體和基因?qū)τ谇o稈機械強度分子機理的揭示起到了重要的作用，但是其分子機理有待進一步深入研究。發(fā)掘新的脆稈突變體，定位和克隆新的脆稈基因，有助于進一步揭示莖稈機械強度的分子機理。

本實驗室通過EMS誘變粳稻品種日本晴，獲得了一個脆稈突變體bc16，從表型、生理、遺傳等方面對該突變體進行鑒定，明確了相應(yīng)的遺傳特性，并對該突變基因進行了精細定位；同時采用實時熒光定量PCR對bc16基因在根、莖、葉中表達量進行了分析。通過對該突變體的研究，有利于進一步了解水稻莖稈機械強度的分子機理，為水稻抗倒育種提供理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

利用EMS誘變粳稻品種日本晴(Nipponbare)，從中篩選到一個脆稈突變體，經(jīng)多代連續(xù)自交，突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳，命名為bc16(brittleculm16)。遺傳分析和定位群體分別為突變體與日本晴和明恢63雜交形成的F2。

1.2突變體表型分析

2015年5月將脆稈突變體bc16和野生型日本晴種植于浙江大學(xué)實驗農(nóng)場，各個材料種植8行，每行6株，株行距為17 cm×17 cm。成熟時隨機選取10株野生型和突變體，分別統(tǒng)計株高、主穗長度、劍葉長、節(jié)間長度、總粒數(shù)、結(jié)實率等性狀。

1.3纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量測定

采用van Soest等[24]的方法測定成熟期莖稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量，稍有改進(消泡劑使用n-辛醇代替十氫化萘)。采用上海新嘉電子有限公司CXC-06粗纖維測定儀測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，用意大利公司生產(chǎn)的VELP CSF膳食纖維測定儀測定纖維素含量。3次重復(fù)，利用EXCEL分析實驗結(jié)果。

1.4細胞學(xué)觀察

1.4.1石蠟切片觀察

切取成熟期突變體bc16和日本晴莖稈倒一節(jié)間中間部位1 cm組織，將樣品用FAA固定液(38%甲醛5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL)固定24 h。樣品經(jīng)脫水、包埋、切片、脫蠟后用間苯三酚染色，倒置熒光顯微鏡拍照(NIKON ECLIPSE TI-SR)。

1.4.2透射電鏡觀察

取成熟期突變體bc16和日本晴倒一節(jié)中間部位1 cm組織，用刀片縱切成5～6個小片。樣品于2.5%戊二醛溶液中4℃下固定過夜，經(jīng)漂洗、包埋等處理后利用Reichert超薄切片機切取70～90 nm薄片。切片在檸檬酸鉛溶液、醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液中各染色15 min，之后采用透射電鏡(Hitachi H-7650)觀察、拍照。

1.5bc16突變體基因定位和測序

采用Michelmore等[25]提出的BSA(Bulk Segregation Analysis)法，在定位群體中分別取突變和正常單株各12株，利用CTAB法提取單株DNA，將其濃度均調(diào)至200 ng/μL。突變株和正常單株的DNA分別取50 μL構(gòu)成突變池和正常池。利用本實驗室在日本晴和明恢63中篩選到的334對多態(tài)引物對兩個池進行連鎖標記篩選，對得到的連鎖標記用F2群體突變單株進行驗證。利用Gramene(http://www.gramene.org)數(shù)據(jù)庫和NCBI序列匹配數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.

cgi?PAGE=MegaBlast&PROGRAM=blastn&

BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE

=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&

QUERY=&SUBJECTS=)以及DNASTAR等軟件設(shè)計新引物，進一步進行精細定位。根據(jù)水稻基因組注釋計劃數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice)和水稻注釋計劃數(shù)據(jù)庫(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)對候選基因進行功能注釋，并對其測序，最終確定目的基因及其突變位點。

1.6RT-PCR

采用Trizol法提取bc16脆稈突變體和野生型3葉期根、莖、葉部位總RNA，隨后將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。利用實時熒光定量PCR分析目的基因在野生型和突變體根、莖、葉中的表達量。每個樣品中各基因的相對表達量以野生型為對照用內(nèi)參照基因OsActin1進行歸一化處理，相對表達量計算方法為2-△△CT[26]。熒光定量操作步驟參照Takara去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[Primer ScripttmRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)]說明書。實驗所用試劑為Takara公司的定量PCR試劑盒(SYBR Premix ExTaqTM)，所用儀器為CFX96TM熒光定量PCR儀。實時qPCR體系包括cDNA模板2 μL、SYBRPremix ExTaq12.5 μL、正反向引物各1 μL、超純水8.5 μL。每個樣品重復(fù)4次。PCR擴增采用兩步法，程序如下：95℃下30 s；95℃下5 s，60℃下30 s，39個循環(huán)。溶解曲線分析：95℃下10 s，65℃下5 s，95℃下5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1bc16表型特征和農(nóng)藝性狀分析

突變體bc16莖稈、葉片、根從苗期就開始表現(xiàn)脆性，直至成熟期(圖1-A、B)。與野生型相比，突變體bc16的株高降低、穗長變短、每穗粒數(shù)明顯減少(圖1-C、D、E)，而結(jié)實率和千粒重的差異則不明顯(表1)。同時，突變體bc16還表現(xiàn)出主根長(圖1-F)，劍葉、倒2葉、倒3葉葉片變短，抽穗、灌漿、成熟時間推遲。此外，各節(jié)間長度統(tǒng)計表明，突變體bc16倒1節(jié)間、倒2節(jié)間、倒3節(jié)間、倒5節(jié)間長度明顯低于野生型植株，而倒4節(jié)間長度有明顯增加，差異都達到了極顯著水平(表1)。

2.2bc16細胞壁主要組分含量分析

成熟期野生型和突變體bc16細胞壁纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等主要組成成分含量的測定結(jié)果表明，突變體bc16的莖稈纖維素含量要比野生型植株降低36.9%，而半纖維素含量則提高了23.6%，均達到極顯著水平，但木質(zhì)素含量差異不明顯(圖2)。

2.3莖稈橫切面細胞學(xué)觀察

倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體bc16的薄壁細胞表現(xiàn)為近圓形、細胞規(guī)則且排列均勻，而野生型薄壁細胞的形狀無規(guī)則、排列紊亂(圖3-A、B黑色箭頭所示)；突變體bc16和野生型表皮層下的厚壁組織細胞壁厚度(圖3-A、B方框所示)有明顯差異。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體bc16的厚壁組織細胞壁厚度明顯變薄(圖3-C、D)、次生細胞壁變窄，而初生細胞壁厚度差異不明顯；此外bc16次生壁分層較為明顯，而野生型則完全未分層(3-E、F)；突變體bc16薄壁細胞壁明顯薄于野生型，細胞結(jié)合方式不規(guī)則(圖3-G、H)。上述結(jié)果表明，脆性基因bc16可導(dǎo)致表皮層下厚壁細胞次生壁和薄壁細胞壁變薄，薄壁細胞結(jié)合方式發(fā)生改變。

A-苗期； B-成熟期； C-拔節(jié)期； D-成熟期； E-稻穗； F-苗期根長比較。標尺=12.0 cm(C)、15.0 cm(D)、3.0 cm(E)、2.5 cm(F)。

A, Seedling stage; B, Mature stage; C, Wild type andbc16 mutant at the elongation stage; D, Wild type andbc16 mutant at the mature stage; E, Panicles; F, Root length at seedling stage. Bar=12.0 cm (C), 15.0 cm (D), 3.0 cm (E) and 2.5 cm (F).

圖1野生型和突變體bc16表型

Fig. 1. Phenotype of wild type and bc16 mutant.

表1野生型和突變體bc16的農(nóng)藝性狀比較

Table 1. The comparison of agronomic traits between wild type and bc16.

性狀Trait野生型Wildtypebc16株高Plantheight/cm100.43±3.9370.21±1.64**穗長Paniclelength/cm22.05±0.9917.87±1.06**每穗粒數(shù)Filledgrainnumberperpanicle125.70±7.5474.60±8.20**結(jié)實率Seed-settingrate/%89.79±2.4388.83±3.28千粒重1000-grainweight/g24.70±0.5622.40±0.99劍葉長Flagleaflength/cm31.51±6.1226.01±3.21*倒1節(jié)間1stinternodefromthetop/cm37.01±1.9826.49±3.22**倒2節(jié)間2ndinternodefromthetop/cm18.83±0.8811.91±1.47**倒3節(jié)間3rdinternodefromthetop/cm12.57±1.336.46±0.73**倒4節(jié)間4thinternodefromthetop/cm4.84±0.915.91±0.69**倒5節(jié)間5thinternodefromthetop/cm2.97±0.721.50±0.35**

數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=10，其中千粒重n=3)。*，**表示t-測驗在0.01水平上差異顯著，*表示t-測驗在0.05水平上差異顯著。

Figures are mean ±SD(n=10, for 1000-grain weight,n=3).*,**indicate significant difference atP<0.05 andP<0.01 between wild type andbc16 mutant, respectively. The same as below.

圖2野生型和突變體bc16植株細胞壁的主要成分含量

Fig.2. Contents of main ingredients in cell wall of WT and bc16.

2.4突變體bc16的遺傳分析

2.5bc16基因定位

利用在親本間篩選到的334對多態(tài)性引物對突變池和正常池進行多態(tài)性條帶篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第2染色體SSR標記RM64、RM66、RM5607、RM14099在兩池間有多態(tài)性(表2)。利用12個F2單株驗證這些標記，只有RM66存在一個單交換，其他標記沒有單交換，這表明這些標記與目的基因連鎖。采用另外21個F2單株擴增RM64、RM5607、RM66，發(fā)現(xiàn)交換單株在這些標記間均相同，交換單株數(shù)目分別為4、4、6，根據(jù)標記在染色體上的位置可以推知目的基因位于標記的左側(cè)(圖4-A)。通過擴大F2群體和設(shè)計新的InDel標記，將目的基因進一步定位于標記2-C和2-D之間(圖4-B)；隨后利用871個單株最終將bc16基因精細定位于2-F和2-H之間66.6 kb的候選區(qū)間內(nèi)(圖4-C)。在該區(qū)間里存在7個候選基因(圖4-D)，其中Os02g0738900是bc3脆稈基因的等位基因，編碼一個經(jīng)典的發(fā)動蛋白OsDRP2B，該蛋白是次生壁形成所必需的[17,27]。因此，推測Os02g0738900基因可能就是目的基因。

表2bc16基因定位部分引物

Table 2. Part of primers for bc16 gene mapping.

標記Marker正向引物(5'→3')Forwardprimer反向引物(5'→3')Reverseprimer用途PurposeRM64GGTTCAAACCAAGCTGATCAGATGAAGGCCTTCCACGCAG定位MappingRM66GGTCCTGGGTCAATAATTGGGTTACCTTGCTGCATGATCCTAAACCGG定位MappingRM68CCATTCGTGAGAAGATCTGACACCTCATCCTCGTAACGCC定位MappingRM5607TTTCTTGCCCACACGACTACGGTACGTGGCCAACTGGCTATACATACG定位MappingRM1405CGGCTTGTTTATGCTACCAGAGGCGAGGAGACTAACCAAATTGATCG定位MappingRM14099GGTAGCTGAGCAATTGGCATGGGATGATCAGGAACTCATCCATCTCC定位Mapping2-BATGGTTCTTGTTTCTCTGCTGATGTGGATACTGATGTTGCTGGCTAAG定位Mapping2-CATATGCATGCAAATCGACCAACTCCAGCATAAGCACCGCCATCA定位Mapping2-DTCCTCGCCCTTCCGCCTCCTTATCACCGCCATTCCCCTCACCAT定位Mapping2-FCGACGATGGTTGGTGGGATAGCAGAGTGTGTTGGGTAATGCTAATG定位Mapping2-JATAAAAGCCGGCTTGATACTGT CCCGATGAAAAGGATGAGC定位Mapping2-LAGCATACGCGCACAGAAAAGGCGGCGCAGTTGGCATGAAAAGG定位Mapping2-HTTTGCTGGGCTCGGGGTTTACGCTGCCACGTTGCTTGATGATG定位Mapping2-1CACAAAGAAGAATGGAAAGGCAACGACCACCAGGCCCAGCAACC定位Mapping2-ETTGGCCTTCGCTTGTTTTGGAGTGCGAATATTTGGGGTCCTG定位Mapping2-CFTGGAAAGGCAACGTCGTGAGGATGTTCACCACCAGGCCCAGCAACC測序Sequencing2-CCGCTCTAGAATGGAGGCCATGGACGAGCTGCTCTAGATTAATATTTTTGCCCTGGAG測序Sequencing2-CC-2TTCAGGCTATCTTGTCTAACGGAGTATTTAAACCCTTCAC測序Sequencing2-1DGGCAGGCTGAAGCGGAGACACTGCCCGGACAAAAGGTTAGGTAGCRT-PCROsActin1GTGGTCGCCCCTCCTGAAAGGGCTTAGCATTCTTGGGTCCGRT-PCR

A-野生型日本晴部分橫切面； B-突變體bc16部分橫切面； C-野生型日本晴表皮層下厚壁組織細胞； D-突變體bc16表皮層下厚壁組織細胞； E-野生型日本晴厚壁組織細胞壁，PCW(初生壁)、SCW(次生壁)； F-突變體bc16 厚壁組織細胞壁，PCW(初生壁)、SCW(次生壁)； G-野生型日本晴薄壁細胞壁； H-突變體bc16薄壁細胞壁。標尺=1 μm(C和D)、0.2 μm(E和F)、0.5 μm(G和H)。

A, Part of cross section of the wild type; B, Part of cross section ofbc16; C, The wild type sclerenchyma cells below the epidermis layer (bar=1μm); D, Thebc16 mutant sclerenchyma cells below the epidermis layer (bar=1μm); E, The wild type sclerenchyma cell wall, PCW(Primary Cell Wall), SCW(Secondary Cell Wall) (bar=0.2 μm); F, Thebc16 mutant sclerenchyma cell wall, PCW(Primary Cell Wall), SCW(Secondary Cell Wall) (bar=0.2 μm); G, The wild type parenchyma cell wall (bar=0.5 μm); H, Thebc16 mutant parenchyma cell wall (bar=0.5 μm).

圖3日本晴野生型和突變體bc16莖稈倒1節(jié)間中間部位橫切面組織學(xué)和細胞學(xué)觀察

Fig. 3. Stem cross-sections histology and cytology observation of wild type and bc16 mutant at the middle of the first internode from the top.

將日本晴和bc16突變體Os02g0738900基因進行PCR擴增和測序。DNA測序結(jié)果表明Os02g0738900基因第13內(nèi)含子從ATG開始5113位堿基位置發(fā)生了T→A的置換，造成剪切位點前移，該內(nèi)含子末端6個核苷酸(TATTAG)被剪切到mRNA中，造成翻譯提前終止(圖4-D)。為進一步驗證突變位點，對野生型和bc16突變體目的基因全長cDNA進行擴增，并在bc16基因序列發(fā)生突變的位點兩端設(shè)計引物PCR擴增目的片段，電泳結(jié)果證實了測序結(jié)果(圖4-E)。以上結(jié)果表明基因Os02g0738900第13內(nèi)含子剪切位點前移，內(nèi)含子的一部分被剪切到mRNA中，進而導(dǎo)致蛋白序列和結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，功能發(fā)生了缺失。

A-bc16基因初定位于第2染色體SSR標記RM64、RM5607、RM66左側(cè)； B-bc16基因初定位于InDel標記2-C、2-D兩側(cè)； C-bc16基因精細定位于InDel標記2-F、2-H之間66.6 kb的區(qū)域； D-突變體bc16和野生型DNA和cDNA測序目標基因序列結(jié)果比較。E-野生型和突變體bc16全長cDNA以及發(fā)生突變的部分cDNA電泳結(jié)果比較，M1為DL15000，M2為DL500。

A,bc16 gene was primarily mapped on the left side of SSR markers RM64, RM5607, RM66 on chromosome 2; B,bc16gene was mapped between InDel markers 2-C and 2-D; C,bc16gene was fine mapped between InDel markers 2-F and 2-H; D, Target DNA and cDNA sequencing results comparison betweenbc16 and wild type； E, The electrophoresis results comparison of full length cDNA, partial cDNA with mutation sites between wild type andbc16, M1and M2are markers DL15000 and DL500, respectively.

圖 4bc16基因定位以及突變體bc16和野生型日本晴序列匹配

Fig. 4. Gene mapping of bc16 and the sequence alignment between bc16mutant and wild type.

2.6bc16 基因RT-PCR分析

RT-PCR分析結(jié)果表明，bc16基因在根、莖、葉中均有表達，以莖中的表達量為最高，其次是葉和根，且脆稈突變體的表達量均低于野生型(圖5)。說明Os02g0738900基因突變導(dǎo)致其表達量降低，引起植株根、莖、葉機械強度降低，導(dǎo)致脆性增加。

3討論

在已發(fā)現(xiàn)的水稻脆稈基因中，至少有兩個脆稈基因，即bc6、bc7會導(dǎo)致細胞壁纖維素含量降低、半纖維素含量升高[19,20]。BC6和BC7都是編碼纖維素合酶基因，其中BC6編碼OsCesA9，是一個不完全顯性基因，而BC7是OsCesA4的等位基因。本研究發(fā)現(xiàn)的bc16是一個編碼動力蛋白的基因，可能參與到細胞內(nèi)吞作用和高爾基體轉(zhuǎn)膜過程。這表明莖稈機械強度的調(diào)控是一個很復(fù)雜的過程，許多不同類型的基因共同作用參與調(diào)節(jié)莖稈機械強度。Xiong等[27]和Hirano等[17]采用不同材料發(fā)現(xiàn)BC3基因，該基因編碼一個經(jīng)典的發(fā)動蛋白家族成員，啟動子GUS分析表明該基因的表達和次生壁的形成是直接相關(guān)的。bc16基因和bc3基因均來源于Os02g0738900基因，兩者在結(jié)構(gòu)和功能上存在不少異同點，如兩個基因都能引起水稻莖稈、葉片、根變脆、植株變矮、主根長縮短、厚壁組織次生細胞壁和薄壁細胞初生壁變薄等。但兩者之間的差異也非常明顯：一是兩個基因發(fā)生突變的位置不同，bc3基因第3內(nèi)含子缺失了156個核苷酸，而bc16基因是在第13內(nèi)含子近末端發(fā)生了T→A的置換(圖4)；二是bc3基因只能使細胞壁纖維素含量降低，而bc16基因不僅可使纖維素含量降低，還能使半纖維素含量明顯升高。

圖5bc16(Os02g0738900)基因在水稻不同組織的表達情況

Fig. 5. Expression analysis of the bc16 (Os02g0738900) gene in different tissues of rice.

發(fā)動蛋白與發(fā)動蛋白相關(guān)蛋白(DRPs)是一類大的GTP酶，與細胞壁的合成緊密相關(guān)。該類蛋白不僅存在于細胞膜和囊泡中，而且還存在于反面囊膜網(wǎng)中[17]。除了纖維素和胼底質(zhì)外，細胞壁絕大部分成分如半纖維素等是由高爾基體裝配和運輸?shù)郊毎?。半纖維素由位于高爾基體膜上的糖基轉(zhuǎn)移酶合成[28]。糖基轉(zhuǎn)移酶是專門負責(zé)催化糖基化反應(yīng)的酶類，主要包括GT-A和GT-B兩類，它們將活性糖基從糖基供體轉(zhuǎn)移到糖基受體，形成糖苷鍵。核苷酸糖是糖基供體最主要的化合物，包括 UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖和UDP-葡萄糖醛酸[29]。水稻OsDRP2B蛋白由位于N端的GTPase結(jié)構(gòu)域、保守的中間結(jié)構(gòu)域、PH結(jié)構(gòu)域、PR結(jié)構(gòu)域和C端GED結(jié)構(gòu)域五部分組成。王海峰[30]認為具有多個結(jié)構(gòu)域的基因產(chǎn)生的不同剪切體形成的是有功能的蛋白。體外生化實驗研究表明OsDRP2B蛋白N端GTPase結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合和水解GTP[27]。就bc16突變體而言，由于其翻譯的蛋白具有完整的GTPase結(jié)構(gòu)域，在體內(nèi)纖維素含量合成量不足的誘導(dǎo)下，其水解GTP形成的GDP可作為合成核苷酸糖的底物，生成的核苷酸糖從而可以產(chǎn)生更多的半纖維素。Kotake等[19]認為水稻莖稈在纖維素含量降低的情況下，植株體內(nèi)可能存在的某種機制會使半纖維素含量升高，從而補償纖維素含量降低對植株生活能力的不利影響。雖然不少水稻脆稈突變體細胞壁纖維素含量顯著降低，但并非所有突變體半纖維素含量都升高。這表明這種補償機制的發(fā)生需要一定的條件。核苷酸糖可能是誘發(fā)這種機制的一種重要的物質(zhì)。bc16突變體半纖維素含量升高也可能是由于誘發(fā)了這種機制導(dǎo)致的。雖然bc3和bc16基因翻譯的蛋白功能缺失，但bc16基因翻譯的蛋白具有完整的GTPase。這可能是bc16突變體半纖維素含量升高而bc3突變體半纖維素保持不變的原因。

目前，對于植物次生細胞壁在莖稈機械強度的研究相對較多，而初生細胞壁在莖稈機械強度發(fā)揮的作用，相關(guān)研究還比較缺乏。Didi等[31]發(fā)現(xiàn)雖然厚壁組織主要決定莖稈機械強度，初生細胞壁也可以為植物提供機械支撐功能。目前水稻中發(fā)現(xiàn)的脆性基因絕大部分都會使厚壁組織次生細胞壁變薄，而本研究發(fā)現(xiàn)的突變體bc16除了使厚壁組織次生細胞壁變薄外，薄壁細胞壁同時出現(xiàn)了變薄的現(xiàn)象(圖3-G、3-H)，這說明bc16基因不僅可以調(diào)控厚壁組織次生細胞壁的合成，還能影響薄壁細胞壁的合成。雖然薄壁細胞在植物機械支撐方面的作用不如厚壁組織那么明顯，但由于薄壁組織細胞數(shù)目多且分布廣，其在影響機械強度的作用方面也不容忽視。目前在水稻中發(fā)現(xiàn)的脆性突變體和野生型薄壁細胞大多沒有什么變化，因此突變體bc16可能是一個深入研究薄壁細胞壁機械強度的好材料。

脆稈水稻由于具有獨特的機械特性和細胞壁組成，可用于抗倒伏品種和稻飼兩用特種稻的選育[32]。一方面，脆稈水稻由于細胞壁主要成分如纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量改變，使脆稈水稻抗倒伏能力變?nèi)?。通過研究水稻脆性基因的功能，可以了解水稻莖稈強度增加的分子機理，為培育抗倒伏新品種提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)材料。另一方面常規(guī)品種水稻秸稈不易斷裂，會影響口感，牲畜不喜食，應(yīng)用于飼料加工中有一定的困難，但是脆稈水稻的粗纖維含量高，牲畜飼用口感相對較好，具有良好的飼料利用前景。汪海峰等[33]將脆稈全株水稻應(yīng)用到生長肥育豬日糧的試驗中，發(fā)現(xiàn)飼喂含16%脆稈全株水稻日糧補飼大豆油替代玉米，對豬的生長性能沒有顯著影響，并且可顯著提高胴體中不飽和脂肪酸含量和促進豬腸道中乳酸菌的增生。呂宗友等[34]通過比較脆稈全株水稻和中花11在瘤胃內(nèi)的降解特性，認為全株脆稈水稻可作為優(yōu)質(zhì)飼料稻的選育中間材料。生物能源是利用生物質(zhì)為原料生產(chǎn)的能源，包括生物乙醇、生物柴油、生物氫氣、生物沼氣等能源產(chǎn)品[35]。木質(zhì)纖維素是潛在的低成本、可再生的生物質(zhì)原料，可以經(jīng)水解發(fā)酵產(chǎn)生生物乙醇[36]。木質(zhì)纖維素是經(jīng)過人工處理獲得的有機絮狀纖維物質(zhì)，主要由纖維素(約占1/3～1/2)、半纖維素(1/4～1/3)和木質(zhì)素(1/5～1/4)組成，其中纖維素和半纖維素可經(jīng)過糖化和發(fā)酵生成乙醇，而木質(zhì)素則不能[37]。我國木質(zhì)纖維素資源非常豐富，其原料來源廣泛，如農(nóng)作物秸稈、木本植物、芒草等，但多數(shù)沒有被很好的利用。我國每年農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可產(chǎn)生大約7億t秸稈，利用秸稈生產(chǎn)纖維乙醇不僅有利于環(huán)境的保護，而且對于能源安全具有重要的戰(zhàn)略意義[38]。楊濤等[39]利用二級串聯(lián)式生物反應(yīng)器，使水稻纖維素發(fā)酵40 h，可獲得乙醇濃度達到25.5g/L，纖維素轉(zhuǎn)對乙醇的轉(zhuǎn)化率達到43%。脆性水稻秸稈由于具有易粉碎、纖維素含量少、容易厭氧降解等特點，在生物乙醇生產(chǎn)上具有一定的優(yōu)勢。黃峰等[40]利用脆稈水稻生產(chǎn)乙醇，經(jīng)過葡萄糖、酸處理后，每1 g脆性秸稈總還原糖含量[(541.2±8.0)mg]比普通水稻秸稈高41.9 mg，采用EscherichiacoliSZ470處理72 h，脆性秸稈乙醇產(chǎn)量為(10.9±0.4) g/L，是普通秸稈的1.1倍。劉晨娟[41]利用白腐菌6號預(yù)處理的材料進行同步糖化發(fā)酵，在接種量為5%，發(fā)酵溫度為40℃，纖維素酶添加量為20 FPU/g的條件下發(fā)酵48h，結(jié)果使處理后的脆性秸稈發(fā)酵乙醇產(chǎn)量比未處理的脆性秸稈提高了1.51倍，而傳統(tǒng)水稻秸稈產(chǎn)量僅提高0.81倍。洪解放等[42]認為，充分利用木質(zhì)纖維素中半纖維素，有望使纖維乙醇在原有基礎(chǔ)上產(chǎn)量提高25%。Wen等[43]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系WSD-5對半纖維素具有高效的酶解能力，其酶解轉(zhuǎn)化率與半纖維素含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。這表明，利用脆性水稻秸稈生產(chǎn)生物乙醇具有較大的研究價值和利用情景。本研究發(fā)現(xiàn)的脆稈突變體bc16是來源于粳稻日本晴的突變體，纖維素含量降低，半纖維素含量顯著升高，可應(yīng)用于水稻秸稈轉(zhuǎn)化生物乙醇研究。

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收稿日期:2015-12-14； 修改稿收到日期: 2016-02-26。

基金項目:國家科技支撐計劃資助項目(2011BAD35B02)；浙江省科技廳水稻產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新服務(wù)平臺；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃資助項目(Grant B14027)；浙江省重大科技攻關(guān)專項(2012C12901-2)；教育部創(chuàng)新團隊資助項目(IRT1185)。

中圖分類號:Q343.5; Q754

文獻標識碼:A

文章編號:1001-7216(2016)04-0345-11

Identification and Gene Fine Mapping of aBrittleCulm16 (bc16) Mutant in Rice

SHU Ya-zhou, ZENG Dong-dong, QIN Ran, JIN Xiao-li, ZHENG Xi, SHI Chun-hai*

(CollegeofAgricultureandBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China;*Corresponding author, E-mail: chhshi@zju.edu.cn)

Abstract:Brittle culm mutants are one of the important materials to study plant mechanical strength. A brittle culm mutant named as bc16 (brittle culm 16) was isolated from Nipponbare through EMS (Ethyl Methane Sulphonate) treatment. Compared with wild type, bc16 featured fragile and easily broken stems,leaves,roots, lower plant height and filled grains per panicle, shorter panicle length and main root length. The components analysis of stem cell wall showed that the cellulose content in bc16 mutant was sharply decreased, while hemi-cellulose content was evidently increased and no significant difference had been found in the lignin content between bc16 mutant and wild type. The cell shape and arrangement of parenchyma cells in bc16mutant became irregular and disordered. Moreover, the parenchyma cell walls and the secondary cell walls of sclerenchyma cells in bc16 mutant under the epidermis layer were thinner than those in wild type. The results of genetic analysis revealed that the mutant trait was controlled by a single recessive gene, which was mapped in a 66.6-kb region between InDel (insertion-deletion) markers 2-F and 2-H on chromosome 2 with 7 candidate genes. Among these genes, Os02g0738900, which is allelic to BC3 gene, was specially focused on. There was a T to A substitution at the very end of the 13th intron of Os02g0738900 which was at the 5113thbase location from initiation codon by sequencing, which led an splicing forward mutation in the process of transcription, and six nucleotides were cut into mRNA as a result, which finally cause the stop of translation. Additionally, in the mutant, there were significant decrease in the expression of bc16 gene in roots, culms and leaves by real-time PCR method. The bc16 might affect the synthesis of sclerenchyma secondary cell wall and parenchyma primary cells wall, which could affect the mechanical strength of rice stem.

Key words:rice; brittle culm; gene mapping; cell wall synthesis