徐繼偉，趙雅寧，李建民，付愛(ài)軍，薛承景，趙 旭，劉俊杰

依達(dá)拉奉對(duì)SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響

徐繼偉1，趙雅寧2，李建民3，付愛(ài)軍3，薛承景3，趙 旭3，劉俊杰1

目的 探討依達(dá)拉奉對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響。方法 將72只健康雄性清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)均等分為假手術(shù)組（Sham組）、SAH模型組（SAH組）、SAH結(jié)合依達(dá)拉奉治療組（依達(dá)拉奉）。Sham組只進(jìn)行造模手術(shù)不注血，SAH組利用經(jīng)典枕大池二次注血法制成大鼠SAH動(dòng)物模型，依達(dá)拉奉組在建模成功30 min后給予依達(dá)拉奉（5 mg/kg體重）腹腔注射，每12 h注射1次，用藥至處死的各時(shí)相點(diǎn)。SAH組注射生理鹽水時(shí)間方法同依達(dá)拉奉組（5 mg/kg體重）。Sham組注射生理鹽水（5 mg/kg體重），每次間隔12 h。每組又按6、24、72、144 h時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組（1個(gè)亞組6只SD大鼠）。觀察3組大鼠的行為學(xué)變化，并檢測(cè)細(xì)胞自噬的特異性標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ和Beclin-1在大鼠海馬區(qū)的表達(dá)。結(jié)果 SAH組抓力明顯減弱，海馬區(qū)細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)增高。依達(dá)拉奉組抓力恢復(fù)明顯，海馬區(qū)細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)顯著增高。結(jié)論 依達(dá)拉奉的干預(yù)可顯著激活SAH的SD大鼠海馬區(qū)細(xì)胞自噬表達(dá)。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；依達(dá)拉奉；自噬

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-8 8：29：01 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.032.htm l

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是各種因素所導(dǎo)致的對(duì)人類生命有嚴(yán)重威脅的一種破壞性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在急性腦血管病中大概占10%，發(fā)病率和死亡率超過(guò)50%以上［1］。研究［2］表明，SAH后逐漸增加的氧自由基在早期繼發(fā)性的腦損害中起著比較重要的作用。研究［3］顯示，適當(dāng)活化的自噬可能衰減大鼠SAH模型的早期腦損害的發(fā)展。臨床上依達(dá)拉奉能夠有效的清除氧自由基、防止氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡以減少神經(jīng)元損傷從而提供保護(hù)作用。依達(dá)拉奉在SAH中已經(jīng)逐漸應(yīng)用，但潛在的保護(hù)作用機(jī)制尚不完全清楚。該研究擬探討依達(dá)拉奉對(duì)涉及細(xì)胞凋亡過(guò)程中自噬表達(dá)的影響，為臨床提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠72只，320～420 g（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫維持在25℃，濕度控制在（50±10）%，正常光照，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 藥物和試劑 依達(dá)拉奉注射液（5 mg/kg），購(gòu)自先聲藥業(yè)公司；一抗兔抗Beclin-1、LC3-Ⅱ購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 820-Ⅱ型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；OLYMPUS攝像顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；圖像采集及分析系統(tǒng)（北京航空航天大學(xué)）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1周適應(yīng)環(huán)境。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham組）、SAH模型（SAH組）、SAH結(jié)合依達(dá)拉奉治療（依達(dá)拉奉組），每組24只。通過(guò)經(jīng)典的枕大池二次注血的方法制備大鼠模型組，大鼠成功麻醉后經(jīng)手術(shù)區(qū)（頭部及單側(cè)股動(dòng)脈區(qū)）備皮、常規(guī)消毒鋪巾，常規(guī)消毒鋪巾采取俯臥位姿勢(shì)，采用顱腦定位儀定位枕骨環(huán)椎以及環(huán)枕筋膜。隨后采取仰臥位于手術(shù)臺(tái)，用1 m l注射器（提前用肝素鈉鹽水沖洗）抽取非抗凝約0.3 ml新鮮股動(dòng)脈血，在3 min內(nèi)緩緩將血液注入枕大池，使用骨蠟和少量醫(yī)用明膠海綿密封穿刺點(diǎn)。取頭低30°俯臥位30 min，有助于血液均勻分散于蛛網(wǎng)膜下腔，大鼠呼吸平穩(wěn)后放回籠中正常飼養(yǎng)，48 h后重復(fù)上述操作。治療組在建模成功30 min后給予依達(dá)拉奉（5 mg/kg體重）腹腔注射，每次注射間隔12 h，用藥至處死的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。模型組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予等量注射生理鹽水。以具備確定在無(wú)腦實(shí)質(zhì)損害的SAH或有血凝塊而作為模型制備成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 抓力實(shí)驗(yàn) 抓力實(shí)驗(yàn)是將大鼠自由放置于抓力測(cè)試儀上恰當(dāng)位置，用腳踩下踏板將顯示器讀數(shù)歸零，用手拉住鼠尾向后下方輕微施加力量，待大鼠握緊抓力桿時(shí)，繼續(xù)增加力道，直至大鼠肢體無(wú)法抵抗外力且聽(tīng)到“滴”的響聲時(shí)，記錄數(shù)值為本次拉力值。在正式實(shí)驗(yàn)前每只大鼠需行2～3次預(yù)實(shí)驗(yàn)。然后每只大鼠行3次測(cè)試，每次間隔5 min，取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.3 HE染色 切片常規(guī)脫蠟入水：二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ 5 min，入100%Ⅰ，100%Ⅱ，95%、90%、80%酒精各5 min；流水沖洗5 min；蘇木精染液1 min后，清潔水水化30 s，1%鹽酸酒精分化5～8 s，潔凈水沖洗30 min以上，直至細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰之后，0.5%的伊紅染色2 min；然后依次在80%、90%、95%、100%酒精中各5 min常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明（2次，每次2 min）；用濾紙吸去組織周圍多余二甲苯，滴加中性樹膠，加蓋玻片封固，在光學(xué)顯微鏡（400倍）下觀察，應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化并計(jì)數(shù)單位高位視野下的存活的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)準(zhǔn)SABC法。一抗分別為L(zhǎng)C3-Ⅱ、Beclin-1多克隆抗體（均1∶200稀釋）。用高壓熱修復(fù)2min，用PBS緩沖液（pH=7.2 ～7.4）。前期脫蠟脫水，分別滴加LC3-Ⅱ、Beclin-1（均1∶200稀釋），在濕盒中溫育4℃過(guò)夜，然后洗滌在PBS中，二抗是山羊抗兔IgG（稀釋1∶200）。37℃溫箱30 min，DAB顯色，脫水、透明、封片。采用PBS代替一抗進(jìn)行陰性對(duì)照。每個(gè)步驟之間切片均置于PBS中。自噬標(biāo)記物陽(yáng)性表達(dá)率的定量分析：每個(gè)標(biāo)本取4張切片，200倍光鏡下每張切片在海馬隨機(jī)選取4個(gè)視野，在顯微鏡（× 400）中觀察海馬CA1區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞的變化，并計(jì)數(shù)（×400）倍視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示。采用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，各組間比較采用方差分析進(jìn)行均數(shù)的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 抓力實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與Sham組比較，SAH組在各時(shí)間點(diǎn)（6、24、72、144 h）抓力測(cè)定分值顯著降低，其中6 h拉力值最低，呈現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能損傷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與 SAH組比較，依達(dá)拉奉組各時(shí)間點(diǎn)分值有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。從SAH疾病的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，拉力測(cè)定數(shù)值在SAH組、依達(dá)拉奉組均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，隨時(shí)間延長(zhǎng)，呈逐漸增高的趨勢(shì)，神經(jīng)功能損傷癥狀逐漸恢復(fù)。見(jiàn)表1。

2.2 形態(tài)學(xué)結(jié)果Sham組海馬神經(jīng)元進(jìn)行密集排列，神經(jīng)元的細(xì)胞體較大，細(xì)胞核大而圓，核清晰和胞質(zhì)色淺且均勻。SAH組海馬區(qū)細(xì)胞輪廓模糊，排列紊亂，胞體收縮呈多邊形或呈不規(guī)則改變，部分胞質(zhì)出現(xiàn)自溶；各時(shí)間點(diǎn)存活神經(jīng)元密度均明顯減少（P＜0.01）；依達(dá)拉奉組中海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對(duì)SAH組損傷減輕，胞質(zhì)自溶現(xiàn)象減輕，每個(gè)時(shí)間相神經(jīng)元細(xì)胞存活密度得到提高（P＜0.01），存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增多（P＜0.01）。見(jiàn)圖1、表2。

2.3 LC3免疫組化染色結(jié)果 Sham組可見(jiàn)少量LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)；與Sham組比較，SAH組和依達(dá)拉奉組LC3-Ⅱ表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與Sham組比較，SAH組LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增多（P＜0.01），且在24 h時(shí)表達(dá)達(dá)高峰；與SAH組比較，依達(dá)拉奉組LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增多（P＜0.01），各時(shí)間點(diǎn)呈遞減趨勢(shì)。見(jiàn)表3、圖2。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)24 h神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 HE×400 A：Sham組；B：SAH組；C：依達(dá)拉奉組

2.4 Beclin-1免疫組化染色結(jié)果 Sham組可見(jiàn)少量Beclin-1陽(yáng)性表達(dá)；與Sham組比較，SAH組和依達(dá)拉奉組Beclin-1表達(dá)均不同程度增多（P＜0.01）；與Sham組比較，SAH組Beclin-1表達(dá)顯著增多（P ＜0.01），于24 h時(shí)表達(dá)達(dá)高峰；與SAH組比較，依達(dá)拉奉組Beclin-1表達(dá)顯著增多（P＜0.01），各時(shí)間點(diǎn)呈遞減趨勢(shì)。見(jiàn)表4、圖3。

圖2 各組大鼠海馬區(qū)LC3-Ⅱ的24 h表達(dá)情況 免疫組化×400 A：Sham組；B：SAH組；C：依達(dá)拉奉組

圖3 各組大鼠海馬區(qū)　Beclin-1的24 h表達(dá)情況 免疫組化×400 A：Sham組；B：SAH組；C：依達(dá)拉奉組

表1 各組大鼠抓力實(shí)驗(yàn)拉力值比較（n=24，±s）

表1 各組大鼠抓力實(shí)驗(yàn)拉力值比較（n=24，±s）

與Sham組比較：**P＜0.01；與SAH組比較：##P＜0.01

時(shí)間　Sham組　SAH組　依達(dá)拉奉組　F值　P值6 h　2 000.58±0.27　917.07±15.29**　1 077.09±30.85##735.408　0.000 5 193.496　0.000 24 h　2 000.50±0.22　1 225.02±20.19**　1 439.01±13.42##　4 912.198　0.000 72 h　2 000.53±0.27　1 421.46±11.51**　1 612.45±13.66##　4 910.615　0.000 144 h　2 000.48±0.22　1 511.05±36.11**　1 717.96±13.17##

表2 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量比較（個(gè)/高倍視野，n=24，±s）

表2 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量比較（個(gè)/高倍視野，n=24，±s）

與Sham組比較：**P＜0.01；與SAH組比較：##P＜0.01

時(shí)間　Sham組　SAH組　依達(dá)拉奉組　F值　P值6 h　132.05±1.91　75.18±1.95**　87.01±2.82##268.615　0.000 1 052.278　0.000 24 h　132.51±1.38　87.53±2.58**　103.18±1.46##　877.737　0.000 72 h　132.85±2.25　96.01±2.18**　109.82±2.32##　410.260　0.000 144 h　132.85±2.13　103.18±1.95**　114.35±2.59##

表3 各組大鼠海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ表達(dá)（個(gè)/高倍視野，n=24，±s）

表3 各組大鼠海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ表達(dá)（個(gè)/高倍視野，n=24，±s）

與Sham組比較：**P＜0.01；與SAH組比較：##P＜0.01

時(shí)間　Sham組　SAH組　依達(dá)拉奉組　F值　P值6 h　13.11±0.97　28.02±1.65**　31.86±1.17##191.704　0.000 350.903　0.000 24 h　13.65±0.82　34.52±1.07**　42.05±1.66##　852.075　0.000 72 h　13.51±0.86　30.32±2.36**　35.16±2.27##　202.770　0.000 144 h　13.03±0.89　22.68±1.23**　26.28±1.45##

表4 各組大鼠海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)　Beclin-1蛋白表達(dá)（個(gè)/高倍視野，n=24，±s）

表4 各組大鼠海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)　Beclin-1蛋白表達(dá)（個(gè)/高倍視野，n=24，±s）

與Sham組比較：**P＜0.01；與SAH組比較：##P＜0.01

時(shí)間　Sham組　SAH組　依達(dá)拉奉組　F值　P值6 h　23.84±1.35　31.01±1.42**　42.18±1.95##71.748　0.000 201.220　0.000 24 h　24.35±1.05　45.35±2.33**　58.01±0.65##　748.186　0.000 72 h　23.67±1.38　37.18±2.15**　49.51±2.18##　266.574　0.000 144 h　23.51±1.06　30.35±2.60**　37.16±1.95##

3 討論

SAH帶來(lái)許多生理紊亂如顱內(nèi)壓增高、腦血液流動(dòng)下降、全腦缺血。這些事件引發(fā)二次傷害，如血腦屏障破壞、炎癥和氧化級(jí)聯(lián)［4］、早期的腦血管痙攣［5］以及大量生成的氧自由基［6］最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。據(jù)文獻(xiàn)［7］統(tǒng)計(jì)，SAH后24 h并持續(xù)至48 h氧自由基水平開(kāi)始升高，致使神經(jīng)細(xì)胞損傷和腦水腫加重。隨著對(duì)SAH的逐步認(rèn)識(shí)和有效的早期干預(yù)，大多數(shù)入院的患者未出現(xiàn)再次出血，但是目前卻尚未找到一種可以有效預(yù)防或減輕腦組織細(xì)胞的早期損傷，研究［8］表明SAH后隨著腦損傷的發(fā)生自噬被激活，而氧自由基的及時(shí)清除可顯著減輕SAH后的進(jìn)一步腦損害。海馬細(xì)胞由于對(duì)腦組織缺血、低氧最為敏感，因此依達(dá)拉奉系一種能夠清除羥自由基（·OH）的抗氧化藥物［9］，在體內(nèi)以陰離子的形式存在，一個(gè)電子轉(zhuǎn)移到氧自由基和自由基，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞［10］。以往主要用于治療缺血性腦病，療效得到肯定［11］。近年來(lái)，其已逐漸用于SAH的早期治療。研究［12］表明依達(dá)拉奉具有對(duì)氧自由基的清除以及對(duì)毒性有較強(qiáng)的抑制作用，可減輕由于氧自由基導(dǎo)致的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。缺血、低氧是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要原因。SAH后由于血液積聚在顱內(nèi)造成缺血低氧，進(jìn)而氧自由基逐漸增加從而導(dǎo)致大量神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。本實(shí)驗(yàn)從自噬層面上證實(shí)了依達(dá)拉奉早期及時(shí)有效的干預(yù)能夠激活自噬從而弱化SAH后早期腦損傷，從而發(fā)揮對(duì)腦的保護(hù)作用。

自噬是一個(gè)自我降解過(guò)程，能夠去除錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，以及受損的細(xì)胞器，消除細(xì)胞內(nèi)病原體，有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、保護(hù)細(xì)胞生存的作用，與人體生理過(guò)程和疾病有著密切聯(lián)系。自噬特異性標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ是定位在自噬體膜上的蛋白質(zhì)，主要用于反映細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量［13］；作為酵母自噬基因Atg6同系物的Beclin1，是調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬體形成的關(guān)鍵因子［14］。本研究通過(guò)檢測(cè)各組大鼠大腦海馬區(qū)特異性自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ和Beclin1的表達(dá)，以反映自噬在各組之間的表達(dá)差異。本研究表明，Sham組自噬表達(dá)維持在較低水平，而SAH組較Sham組的自噬標(biāo)記物表達(dá)明顯，經(jīng)過(guò)依達(dá)拉奉的干預(yù)后相比SAH組的自噬標(biāo)記物表達(dá)水平又有所提高。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自噬活性增強(qiáng)對(duì)SD大鼠神經(jīng)元具有保護(hù)作用，依達(dá)拉奉治療可顯著增加自噬活性，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，依達(dá)拉奉對(duì)SAH大鼠海馬區(qū)腦保護(hù)作用可能與激活自噬并上調(diào)LC3-Ⅱ和Beclin1等自噬基因的表達(dá)有關(guān)。在細(xì)胞中，自噬無(wú)論是有害還是保護(hù)作用，取決于在病理過(guò)程中的具體情況和階段［15］。依達(dá)拉奉對(duì)SAH的療效，涉及相當(dāng)復(fù)雜的分子機(jī)制和信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，有待于進(jìn)一步研究。

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M ain effect of edaravone on autophagy in hippocampal neurons of SAH rats

Xu Jiwei1，Zhao Yaning2，Li Jianmin3，et al
（1College of Post-graduate，2College of Rehabilitation and Nursing，North China University
of Science and Technology，Tangshan 063000；3Dept of Neurosurgery，Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan 063000）

Objective To investigate the effect of edaravone on autophagy in hippocampal neurons of SAH rats. Methods All of 72 healthy clean-grade male SD rats were randomly devided into three groups，namely the false operation group（sham group，n=24），the subarachnoid hemorrhage group（edaravone group，n=24）combined with edaravone，and hemorrhagic SAHmodel group（SAH group，n=24）.Sham group：only the blood of themodel was performed.SAH group：the SAH animalmodelwasmade by using the two injection of the classic pillow.Edaravone group was given intraperitoneal injection of edaravone（5 mg/kg）in 30 minutes aftermodeling operation had been succeeded，and the injection was performed once every 12 hours so as to makemedicated group be killed at each time point.SAH group was injected with normal saline ateach time interval of12 h（5 mg/kg body weight）. The whole group were divided into four subgroups（a subgroup of6 SD rats）according to time points of6，24，72，and 144 h.The behavioral changes of the 3 groups were observed，and the expression of Beclin-1 and LC3-Ⅱ in the hippocampus of rats was detected by the specific markers of autophagy.Results The scratching forces of SAH group was significantly decreased，and the expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in the hippocampus was increased. Edaravone group scratching force was significantly increased，the expression of LC3-Ⅱand Beclin-1 in the hippocampus cellswas significantly increased.Conclusion Edaravone intervention can significantly activate the expression of autophagy in hippocampus of SD rats after subarachnoid hemorrhage.

subarachnoid hemorrhage；edaravone；autophagy

R 651.1

A

1000-1492（2016）04-0531-05

2016-01-18接收

河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：ZD20131007）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：ZH2012046）；唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：14130220B）

華北理工大學(xué)1研究生學(xué)院、2康復(fù)與護(hù)理學(xué)院，唐山063000
3華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，唐山 063000

徐繼偉，男，碩士研究生；
李建民，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：Lijianmints@sina.com