袁育珺，段惠芳，胡志堅(jiān)，汪 淵

高糖誘導(dǎo)人腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡及其調(diào)控機(jī)制

袁育珺1，段惠芳2，胡志堅(jiān)1，汪 淵3

目的 研究高糖誘導(dǎo)人腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡及其調(diào)控機(jī)制。方法 以人腎近曲小管上皮細(xì)胞株HK-2為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組、高糖組、甘露醇組。MTT、流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞的增殖和凋亡狀況；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase的活性；Western blot法分析B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）及Caspase家族蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果 與對(duì)照組比較，高糖組能抑制HK-2細(xì)胞的體外增殖，下調(diào)抑制凋亡作用的蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)促凋亡作用的蛋白Bax、Bak表達(dá)（P＜0.05）；流式細(xì)胞術(shù)顯示HK-2細(xì)胞周期有明顯的變化，且隨葡萄糖濃度的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明顯上升（P＜0.01），并且Caspase酶原降解及活性表達(dá)也呈上升趨勢(shì)（P＜0.01）。結(jié)論 高糖能抑制HK-2細(xì)胞體外增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)Bcl-2及Caspase家族調(diào)控HK-2細(xì)胞的凋亡。

高糖；HK-2；凋亡；表達(dá)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-8 8：29：01 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.018.htm l

細(xì)胞凋亡是生理性過(guò)程，不同于細(xì)胞壞死；凋亡細(xì)胞能產(chǎn)生吞噬和清除碎片的凋亡小體，避免周圍環(huán)境中細(xì)胞損害，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［1］。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，DN早期，腎臟通過(guò)細(xì)胞凋亡等應(yīng)急反應(yīng)來(lái)清除過(guò)度增殖的內(nèi)皮細(xì)胞，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；DN晚期，隨著腎功能障礙，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞，細(xì)胞凋亡過(guò)度，致使腎損害也加?。?-3］。了解和干預(yù)腎小管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有助于延緩DN進(jìn)展。該研究采用體外培養(yǎng)人腎近曲小管上皮細(xì)胞株HK-2細(xì)胞，分析高糖壞境下HK-2細(xì)胞的增殖和凋亡狀況、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）及Caspase家族蛋白表達(dá)的變化，并進(jìn)一步探討這些作用可能的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 低糖（5.5 mmol/L）DMEM（美國(guó)Gibico公司）；D-glucose、醫(yī)用甘露醇（北京國(guó)藥集團(tuán)公司）；Gibco原裝小牛血清（北京索萊寶科技有限公司）；HK-2由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院贈(zèng)送，液氮保存；Annexin V-FITC（安徽碧云天生物試劑公司）；一抗actin、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Bak、Caspase-7（美國(guó)Santa Cruz公司）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；二抗（美國(guó)Pierce公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 液氮取出HK-2細(xì)胞，37℃水浴解凍，迅速接種于含10%小牛血清低糖DMEM（葡萄糖濃度5.5 mmol/L），37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。胰酶消化傳代，備用。分組：對(duì)照組（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）、高糖組（葡萄糖濃度分別為25、40 mmol/L）和甘露醇組（葡萄糖濃度5.5 mmol/L+甘露醇濃度分別為19.5、34.5 mmol/L）。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)旺盛的HK-2細(xì)胞，胰酶消化，按1.2.1分組，MTT實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照前期報(bào)道［4］操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Annexin V-FITC分析細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HK-2細(xì)胞，胰酶消化傳代，制成細(xì)胞懸液，取合適的量平均接種于6孔板，次日按1.2.1分組，37℃刺激48 h，各組胰酶消化制成約1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液。400μl Annexin V結(jié)合液重懸，加入5μl Annexin V-FITC染色液，2～8℃避光孵育15 min。4℃冷凍離心5 min（10 000 r/min），去除上清液，再用400μl Annexin V結(jié)合液重懸，10μl/孔PI染色液，震動(dòng)器輕輕混勻；錫箔紙包裹置冰上孵育5 min，然后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 Caspase蛋白酶原活性檢測(cè) 原理：依據(jù)ELISA抗原抗體結(jié)合的原理，細(xì)胞內(nèi)活性的Caspase-7、Caspase-3、Caspase-9能在體外與相應(yīng)的酶結(jié)合，催化底物顯色反應(yīng)，通過(guò)吸光度（optical density，OD）值OD405來(lái)間接反應(yīng)Caspase-7、Caspase-3、Caspase-9的活性。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HK-2細(xì)胞，按1.2.3步驟操作，分組后置于培養(yǎng)箱連續(xù)刺激2 d，胰酶消化，冷凍離心5 min（10 000 r/min），按照ELISA法操作，依次加入酶、底物、酶標(biāo)儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot法檢測(cè) 提取總蛋白：按1.2.1分組批量培養(yǎng)，刺激48 h后，棄去原液并用PBS洗去殘留液體，置冰上，每瓶加裂解液150μl充分裂解，細(xì)胞刮子收集細(xì)胞，低溫冷凍離心5 min（10 000 r/min），上清液置于-80℃?zhèn)溆?，BCA測(cè)定蛋白濃度，每組加入濃縮蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸，分裝備用，置于 -20℃保存。配制12.5%SDS-PAGE，微量加樣針上樣，先用40～50 V電泳濃縮膠，100 V電泳分離膠，100 mA冰浴轉(zhuǎn)膜，伊利脫脂牛奶封閉，PBS洗膜，置于一抗為Bcl-2（1∶400），Caspase-7（1 ∶1 000），Bak（1∶1 000），Bax（1∶300），Caspase-3 （1∶2 000），Caspase-9（1∶800），actin（1∶1 000），4℃過(guò)夜。相應(yīng)二抗分別為山羊抗小鼠（1∶1 500），山羊抗鼠（1∶1 500），山羊抗兔（1∶1 000），山羊抗鼠（1∶1 000），山羊抗鼠（1∶1 000），山羊抗兔（1 ∶1 000），山羊抗小鼠（1∶4 000），37℃孵育2 h，PBS洗膜3次，暗室內(nèi)膠片顯影、定影，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Western blot條帶的灰度值用Image Pro 4.5分析軟件測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素方差分析，數(shù)據(jù)用±s表示。組間計(jì)量資料用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)HK-2細(xì)胞的體外增殖的影響 MTT

結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行主體間效應(yīng)檢測(cè)，顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=112.04，P＜0.01）。組間兩兩比較顯示，與對(duì)照組比較，高糖組（25、40 mmol/ L）的OD值依次降低，且糖濃度為40 mmol/L抑制率達(dá)26.6%（P＜0.05，P＜0.01）；而甘露醇組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明體外高糖能抑制HK-2細(xì)胞的體外增殖，與高晶體滲透壓無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞的增殖的影響（n=5）

圖1 Annexin V-FITC檢測(cè)高濃度葡萄糖對(duì)　HK-2細(xì)胞凋亡的影響A：對(duì)照組；B：25 mmol/L葡萄糖；C：40 mmol/L葡萄糖；D：5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇；E：5.5 mmol/L葡萄糖 +34.5 mmol/甘露醇

2.2 高糖對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行主體間效應(yīng)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=82.54，P＜0.01）。組間兩兩比較顯示：與對(duì)照組（9.9%）比較，高糖組（圖1B、1C）中期凋亡與末期凋亡所占的比例明顯升高，并且末期凋亡所占的比例隨著葡萄糖濃度的升高而升高；從圖1D、1E中可以觀察到甘露醇對(duì)細(xì)胞的凋亡影響不明顯。提示高糖能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，與高晶體滲透壓無(wú)關(guān)。見(jiàn)圖1、表2。

2.3 高糖對(duì)Caspase蛋白酶原活性的影響 單因素方差分析顯示高糖能夠增強(qiáng)Caspase-7、Caspase-3、Caspase-9活性（F=71.43、55.81、74.32，P＜0.01）。組間兩兩比較顯示：與對(duì)照組比較，高糖組Caspase-7、Caspase-3、Caspase-9活性呈上升趨勢(shì)，但甘露醇組活性沒(méi)有明顯變化。見(jiàn)圖2。

2.4 高糖對(duì)Bcl-2及Caspase蛋白酶原家族蛋白表達(dá)的影響 單因素方差分析顯示高糖上調(diào)Bak、bax、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-7蛋白表達(dá)（F=27.41、47.54、37.22、41.77、25.47，P＜0.01）；下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)（F= 33.14）。組間兩兩比較顯示：與對(duì)照組比較，Bcl-2家族Bcl-2蛋白表達(dá)量有所下降，Bak、Bax蛋白表達(dá)量顯著上升，且Bax/Bcl-2的比值也呈上升趨勢(shì)。另外剪切后的Caspase蛋白酶原家族cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-7蛋白表達(dá)明顯增加，見(jiàn)圖3。

圖2 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9活性檢測(cè)（n=4，±s）A：Caspase-7；B：Caspase-3；C：Caspase-9；1：對(duì)照組；2：5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇；3：5.5 mmol/L葡萄糖　+34.5 mmol/甘露醇；4：25 mmol/L葡萄糖；5：40 mmol/L葡萄糖；與對(duì)照組比較：**P＜0.01

圖3 高濃度葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的變化A：對(duì)照組；B：25 mmol/L葡萄糖；C：40 mmol/L葡萄糖；與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

表2 不同濃度葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞周期的影響（%）

3 討論

DN是糖尿病重要并發(fā)癥之一，其基本病理特征主要表現(xiàn)為腎小球細(xì)胞外基質(zhì)聚集與降解紊亂，導(dǎo)致腎小球病態(tài)增生、基底膜增厚和動(dòng)脈硬化等，這些改變嚴(yán)重影響腎小管的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，誘發(fā)上皮細(xì)胞程序性凋亡，從而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化［5］。國(guó)外相關(guān)報(bào)道［6］證實(shí)終末期腎病腎小球損傷多數(shù)從腎小球上皮細(xì)胞（足細(xì)胞）損傷開(kāi)始；在糖尿病的早期，長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下的細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致腎小球超過(guò)濾、誘發(fā)氧化應(yīng)激、糖化終產(chǎn)物堆積、蛋白激酶C的激活、多元醇化、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的過(guò)表達(dá)和炎癥等，這些因素致使腎小管基底膜增厚，養(yǎng)分供應(yīng)受阻，引起腎小管上皮細(xì)胞萎縮，導(dǎo)致腎衰竭。因此干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，維持上皮細(xì)胞活性，能有效的減緩腎臟的衰竭［5］。

體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖容易導(dǎo)致上皮、內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙，從而誘發(fā)多種疾病，如2型糖尿病等；因此，控制血糖，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡修復(fù)損傷的細(xì)胞有重要的臨床意義［7-8］。本研究模擬體內(nèi)高糖環(huán)境，選取穩(wěn)定性較好的人腎近曲小管上皮細(xì)胞株HK-2進(jìn)行體外培養(yǎng)。作為維持近曲小管功能的上皮細(xì)胞，HK-2細(xì)胞的功能障礙在DN的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。實(shí)驗(yàn)表明高糖刺激48 h后HK-2細(xì)胞的增殖抑制，且出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

Bcl-2家族和Caspase共同參與調(diào)控細(xì)胞凋亡［9-10］。Bcl-2家族通過(guò)調(diào)控Bcl-2與Bax、Bak之間的比例，改變線粒體膜的通透性釋放細(xì)胞色素C等促凋亡蛋白［11-12］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而Caspase家族分工協(xié)作，Caspase-9感受線粒體發(fā)出的死亡信號(hào)；Caspase-3屬于凋亡效應(yīng)子，能直接引起細(xì)胞凋亡；Caspase-7能促使ROS表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，參與細(xì)胞凋亡［13-15］。本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果表明HK-2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2家族和Caspase家族均被激活，表現(xiàn)為Bcl-2蛋白表達(dá)量下降，Bak、Bax蛋白表達(dá)量上升，且Bax/Bcl-2的比值也呈上升趨勢(shì)。另外Caspase蛋白酶原家族Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7酶原降解及活性表達(dá)也呈上升趨勢(shì)。推測(cè)高糖可能是通過(guò)某種途徑激活Bcl-2家族，釋放細(xì)胞色素C，引起Caspase酶原降解，活化Caspase家族啟動(dòng)級(jí)連反應(yīng)，誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］ Krysko D Y，Vanden Berqhe T，D’Herde K，et al.Apoptosis and necrosis：detection，discrimination and phagocytosis［J］.Methods，2008，44（3）：205-21.

［2］ Verzola D，Gandolfo M T，F(xiàn)errario F，et al.Apoptosis in the kidneys of patientswith type IIdiabetic nephropathy［J］.Kidney Int，2007，72（10）：1262-72.

［3］ KolatiSR，Kasala ER，Bodduluru LN，etal.BAY 11-7082 ameliorates diabetic nephropathy by attenuating hyperglycemia-mediated oxidative stress and renal inflammation via NF-κB pathway ［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2015，39（2）：690-9.

［4］ 袁育珺，朱華慶，周 青，等.高濃度葡萄糖誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡及其調(diào)控的相關(guān)機(jī)制［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46 （12）：1223-6.

［5］ Zhao X，Liu G，Shen H，et al.Liraglutide inhibits autophagy and apoptosis induced by high glucose through GLP-1R in renal tubular epithelial cells［J］.Int JMol Med，2015，35（3）：684-92.

［6］ Asanuma K.The role of podocyte injury in chronic kidney disease ［J］.Nihon Rinsho MenekiGakkaiKaishi，2015，38（1）：26-36.

［7］ Song H，Wu F，Zhong Y，et al.Irisin promotes human umbilical vein endothelial cell proliferation through the ERK signaling pathway and partly suppresses high glucose-induced apoptosis［J］. PLoSOne，2014，9（10）：e110273.

［8］ Triqqle C R，Samuel SM，Ravishabkar S，et al.The endothelium：influencing vascular smoothmuscle inmany way［J］.Can JPhysiol Pharmacol，2012，90（6）：713-8.

［9］ Liu J，Yao Y，Qing H，Chen R.Oxymatrine triggers apoptosis by regulating Bcl-2 family proteins and activating caspase-3/caspase -9 pathway in human leukemia HL-60 cells［J］.Tumour Biol，2014，35（6）：5409-15.

［10］Galluzzi I，Vitale I，Abrams JM，et al.Molecular definitions of cell death subroutines：recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012［J］.Cell Death Differ，2012，19（1）：107 -20.

［11］Han C R，Jun do Y，Lee JY，et al.Prometaphase arrest-dependent phosphorylation of Bcl-2 and Bim reduces the association of Bcl-2 with Bak or Bim，provoking Bak activation and mitochondrial apoptosis in nocodazole-treated Jurkat T cells［J］.Apoptosis，2014，19（1）：224-40.

［12］曹軍軍，楊茂偉，郭寶磊，等.高糖通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2012，28（12）：1109-14.

［13］Chen X，Wang J，Qin Q，et al.Mono-2-ethylhexyl phthalate induced loss of mitochondrial membrane potential and activation of Caspase3 in HepG2 cells［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2012，33（3）：421-30.

［14］Wu C Y，Tang ZH，Jiang L，etal.PCSK9 siRNA inhibits HUVEC apoptosis induced by ox-LDL via Bcl/Bax-caspase9-caspase3 pathway［J］.Mol Cell Biochem，2012，359（1-2）：347-58.

［15］Liu J，Yao Y，Dinq H，et al.Oxymatrine triggers apoptosis by regulating Bcl-2 family proteins and activating caspase-3/caspase-9 pathway in human leukemia HL-60 cells［J］.Tumour Biol，2014，35（6）：5409-15.

High glucose can inhibit the proliferation of HK-2 cells in vitro and induce its apoptosis，and itsmechanism may regulate the apoptosis of HK-2 cells through Bcl-2 and Caspase families.

Apoptosis of HK-2 cells induced by high glucose and its regulation mechanism

Yuan Yujun1，Duan Huifang2，Hu Zhijian1，et al （1Clinical Laboratory，2Medicare Office，The Affiliated Hospital of Jiujiang University，Jiujiang 332000）

Objective To investigate high glucose-induced apoptosis in HK-2 cells and its possible regulation mechanism.Methods HK-2 cells were divided into three groups and treated as follows：normal group，high glucose groups，mannitol groups.The cell proliferation and apoptosis of HK-2 cellwas analyzed by MTT，flow cytometry.The expression of Bcl-2 and Caspase family proteins were studied by Western blot，and the activity of Caspase family was analyzed by ELISA.Resu lts High glucose could inhibit growth of HK-2 cells.Moreover，high concentrations of glucose could also induce apoptosis with the concentration increased more obviously（P＜0.01）.Western blot showed that high glucose down-regulated Bcl-2，increased Bak，Bax expression（P＜0.05）.Conclusion

high glucose；HK-2；apoptosis；expression

R 735.7

A

1000-1492（2016）04-0497-05

2016-01-08接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81272399）

九江學(xué)院附屬醫(yī)院1檢驗(yàn)科、2醫(yī)保辦，九江 332000
3安徽省/省部共建教育部重要遺傳病基因資源利用重點(diǎn)
實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

袁育珺，男，碩士；
汪 淵，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangyuan@ahmu.edu.cn