陳澤文，陶 輝，周 曉，施 鵬，張家貴，宣海洋，占紅英，石開虎

化學(xué)合成m icroRNA-29a inhibitors和m im ics 對(duì)SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞活化增殖的影響

陳澤文，陶 輝，周 曉，施 鵬，張家貴，宣海洋，占紅英，石開虎

目的 探討微小RNA-29a（miR-29a）inhibitors和mimics對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞活化增殖的影響。方法 取SD大鼠心肌組織，以組織塊酶消化法分離細(xì)胞，通過差速貼壁離心法收集、培養(yǎng)SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞。應(yīng)用LipofectamineTM2000 Reagent分別向大鼠心肌成纖維細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitors和miR-29amimics24 h和48 h后，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)miR-29a、Ⅰ型膠原前膠原A1（Col1A1）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的RNA水平的表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果 與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitors的心肌成纖維細(xì)胞中，miR-29a的表達(dá)水平下調(diào)；而在轉(zhuǎn)染miR-29a m imics的心肌成纖維細(xì)胞中，miR-29a的表達(dá)水平上調(diào)。Col1A1在miR-29a inhibitors組中表達(dá)水平升高，而在miR-29am imics組中則表達(dá)水平降低。α-SMA在miR-29a inhibitors組中表達(dá)水平升高，在miR-29a mimics組中則表達(dá)水平降低。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-29am imics 24、48 h后，與空白對(duì)照組和其陰性對(duì)照組相比較，心肌成纖維細(xì)胞活力明顯下降；而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitors 24、48 h后，心肌成纖維細(xì)胞活力則明顯增強(qiáng)。結(jié)論 miR-29am imics可明顯抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖活性，而miR-29a inhibitors則顯著提高心肌成纖維細(xì)胞的增殖活性，提示心肌纖維化的形成可能與miR-29a表達(dá)下調(diào)有關(guān)，其潛在的分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

microRNA-29a；心肌成纖維細(xì)胞；Col1A1；α-SMA；quantitative real-time PCR

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-8 8：29：01 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.016.htm l

心肌纖維化是心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，可導(dǎo)致心律失常的發(fā)生和持續(xù)［1］。心肌纖維化表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular cellmatrix，ECM）和膠原蛋白的過度沉積，最終導(dǎo)致心肌功能的損害。在此過程中，心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）發(fā)揮著重要的作用，其活化增殖則是心肌纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2-3］。心肌纖維化形成的詳細(xì)機(jī)制目前尚未完全明確，然而現(xiàn)有研究［4］表明已有不少miR涉及心臟疾病的發(fā)生發(fā)展，其被稱為心臟微小RNA。miR是一類短鏈、高度保守的非編碼RNA，在干擾轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)方面起著重要的調(diào)控作用［3］。miR-29a作為miR-29家族中的一員，已被證實(shí)在心肌纖維化中表達(dá)水平有顯著變化［5］。該研究通過觀察miR-29a在大鼠CFs活化中的表達(dá)變化，初步探討miR-29a在心肌纖維化中的作用，為心肌纖維化的預(yù)防和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD乳鼠60只，出生1 ～3 d，平均體重8 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑 HyClone?DMEM/High Glucose培養(yǎng)基、Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清購自英國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國 Wisent公司；miR-29a inhibitors和miR-29a mimics、EzOmicsmiRNA qPCR Detection Primer試劑盒和EzOmics One-Step qPCR試劑盒購自美國Biomic公司；LipofectamineTM2000 Reagent、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM?I（1×）購自美國Life Technologies公司；MTT相關(guān)試劑購自美國Sigma公司；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）購自美國Peprotech公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 主要儀器 NAPCO-6100型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國SHELLAB公司）；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)（蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司）；eppendorf Centrifuge 5417R高速冷凍離心機(jī)（德國eppendorf公司）；StepOne?Real-Time PCR System（美國ABI公司）；NanoPhotometer P-Class分光光度儀（德國Implen GmbH公司）；酶標(biāo)儀MK3（荷蘭雷勃公司）。

1.4 方法

1.4.1 CFs的提取與細(xì)胞培養(yǎng) 取出生3～5 d內(nèi)的SD大鼠于75%乙醇溶液缸中浸泡20 s后，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)。用無菌剪刀取出心臟，置于高壓蒸汽滅菌過的培養(yǎng)皿中。將大鼠心臟全部取出后，盡量完全剔除心臟上的心房、結(jié)締組織、脂肪和血管，預(yù)冷PBS液沖洗3次以去除血污。將心臟轉(zhuǎn)移至離心管后剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入酶消化液3 ml、37℃水浴并振蕩15 min，自然沉降1 min后吸取上清液入新離心管，加入3 ml 37℃的DMEM培養(yǎng)基終止消化，混勻后以900 r/min離心9 min，反復(fù)操作3次，棄上清液，細(xì)胞沉淀加入4 ml、37℃的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹散細(xì)胞后，接種于培養(yǎng)瓶中，2 h后使用差速離心貼壁法分離以保留CFs。在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中放置過夜。培養(yǎng)CFs至80%～90%匯合狀態(tài)時(shí)，采用胰蛋白酶予以消化傳代培養(yǎng)，取2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，經(jīng)倒置顯微鏡、免疫組化方法鑒定為CFs。

1.4.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitors和mimics 取對(duì)數(shù)生長期CFs進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前1 d，將CFs細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于6孔板，用Opti-MEM稀釋待轉(zhuǎn)染。成熟miR-29a inhibitors/mimics由美國Biomic生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列如下：miR-29a mimics上游引物：5′-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3′，下游引物：5′-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3′；miR-29a inhibitors引物序列：5′-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3′。將 miR-29a inhibitors和mimics及其陰性對(duì)照分別與脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 Reagent輕吹混勻，室溫靜置20 min后，加入相應(yīng)各孔細(xì)胞中，37℃、5%CO2保溫箱孵育24 h，更換含血清及雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基并用濃度為10 ng/m l的TGF-β1刺激細(xì)胞生長，轉(zhuǎn)染48 h后提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA。

1.4.3 總RNA提取和一步法qRT-PCR檢測(cè)miR-29a 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CFs中的miR-29a含量，用StepOne?Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。采用TRIzol并根據(jù)操作手冊(cè)一步法抽提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度，通過計(jì)算吸光度（absorbance，A）值，A260/A280的比值了解其純度并選取比值在1.8～2.0的RNA樣品進(jìn)行試驗(yàn)。采用EzOmics miRNA qPCR Detection Primer試劑盒與EzOmics One-Step qPCR試劑盒并參照操作手冊(cè)檢測(cè)miR-29a。反應(yīng)條件如下：42℃、30 min，95℃、10 min，接著95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s共40循環(huán)的擴(kuò)增階段條件；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s的溶解曲線階段條件。以U6作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.4 qRT-PCR法檢測(cè)Col1A1和α-SMA mRNA表達(dá) 總RNA用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒并參照操作手冊(cè)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后應(yīng)用Maxima SYBR Green/ ROX qPCR Master Mix（2×）試劑盒并參照操作手冊(cè)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。從GenBank中查找引物序列并設(shè)計(jì)合成相應(yīng)引物。引物序列如下：鼠源Col1A1上游引物：5′-TAACTTCTGGACTATTTGCGGACTTT TTGG-3′，下游引物：5′-GTCCAGCCCTCATCCTGGCC-3′。鼠源α-SMA上游引物：5′-TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT-3′，下游引物：5′-GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT-3′。鼠源β-actin上游引物：5′-ACGGTCAGGTCATCACTATC-3′，下游引物：5′-ACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3′。反應(yīng)條件如下：50℃、2 min，95℃、10min，接著95℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s共50個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增階段條件；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s的溶解曲線階段條件。以β-actin作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 檢測(cè)前設(shè)計(jì)分組：轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitors組、轉(zhuǎn)染 miR-29a mimics組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。將處于對(duì)數(shù)生長期的各組CFs用胰蛋白酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸形成細(xì)胞懸液。用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以每孔1×104的密度鋪于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔200μl，連續(xù)監(jiān)測(cè)2 d，鋪板過程中要確保每孔加入細(xì)胞數(shù)一致。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第2天開始，每孔加入5 g/LMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取培養(yǎng)上清液，每孔加入200μl DMSO，室溫下?lián)u床振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔波長490 nm處A值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。單變量兩組資料間的比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的比較采用方差分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析重復(fù)至少3次。

2 結(jié)果

2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染m iR-29a m im ics、inhibitors對(duì)m iR-29a的表達(dá)影響 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFsmiR-29amimics、in-hibitors及其陰性對(duì)照48 h后，One-step Real-time qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-29a mimics后，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組miR-29a的表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.56、13.86，P＜0.05），轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitors后，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組miR-29a的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.23、8.65，P＜0.05）。見圖1。

圖1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后各組CFs內(nèi)　m iR-29a的表達(dá)變化1：陰性對(duì)照組；2：空白對(duì)照組；3：轉(zhuǎn)染　miR-29a mimics組；4：轉(zhuǎn)染　miR-29a inhibitors組；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05；與陰性對(duì)照組比較：##P＜0.01

2.2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染m iR-29a m im ics、inhibitors對(duì)Col1A1和α-SMA的表達(dá)影響 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFs miR-29a mimics、inhibitors及其陰性對(duì)照48 h后，Real-time qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-29amimics后，與正常對(duì)照組和其陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Col1A1和α-SMA的表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Col1A1：t=7.31、7.22，P＜0.05；α-SMA：t=5.45、5.67，P＜0.05），轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitors后，與正常對(duì)照組和其陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Col1A1和α-SMA的表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Col1A1：t=10.14、10.27，P＜0.05；α-SMA：t= 9.75、9.83，P＜0.05）。見圖2。

圖2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后各組CFs內(nèi)　Col1A1和　α-SMA的表達(dá)變化1：陰性對(duì)照組；2：空白對(duì)照組；3：轉(zhuǎn)染　miR-29a mimics組；4：轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitors組；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05；與陰性對(duì)照組比較：##P＜0.01

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染m iR-29a m im ics、inhibitors對(duì)CFs活化增殖的影響 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFs miR-29a mimics 24、48 h后，與空白對(duì)照組和其陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組CFs活力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 35.46、33.57，P＜0.05），而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFsmiR-29a inhibitors24、48 h后，與空白對(duì)照組和其陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組CFs活力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.23、25.18，P＜0.05）。見圖3。

圖3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后各組　CFs增殖活性變化1：陰性對(duì)照組；2：空白對(duì)照組；3：轉(zhuǎn)染　miR-29a mimics組；4：轉(zhuǎn)染　miR-29a inhibitors組；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05；與陰性對(duì)照組比較：##P＜0.01

3 討論

CFs是心臟中數(shù)量最多的細(xì)胞，在心肌纖維化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在心肌纖維化的過程中，CFs受到TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等因子刺激，分化為以α-SMA為表面標(biāo)志物肌成纖維母細(xì)胞，有較強(qiáng)的膠原分泌能力［6］。因此，心肌纖維化主要是通過CFs活化增殖成肌成纖維母細(xì)胞，促進(jìn)Col1A1和α-SMA等的過度表達(dá)，使得ECM蛋白和膠原過度沉積，導(dǎo)致纖維化發(fā)生。

研究［3］表明，miR在纖維化器官尤其是心臟中起著重要的作用。如心梗大鼠敲除miR-21基因后，心肌纖維化水平降低，表明miR-21高表達(dá)可促進(jìn)CFs的增殖［7］。miR-24可以維持TGF-β表達(dá)水平的穩(wěn)定，以此以減少心肌纖維化的發(fā)生［8］。miR-29大多由成纖維細(xì)胞生成，miR-29家族是纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)膠原和其他ECM基因在mRNA水平上的表達(dá)［9］。一方面，miR-29可以通過下調(diào)抗凋亡基因以促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡；另一方面，miR-29可以抑制膠原生成，從而產(chǎn)生抗纖維化的作用。此外，miR-29a則可以通過上調(diào)RASSF1A表達(dá)水平，降低心肌纖維化水平［10］。miR-29a inhibitors和mimics分別是miR-29a的抑制劑和促進(jìn)劑，可以分別抑制和促進(jìn)miR-29a的表達(dá)，然而miR-29a在CFs活化增殖中具體的調(diào)控模式尚不十分清楚。

本研究用miR-29a inhibitors和mimics轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的新生SD大鼠CFs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CFs的增殖變化以及miR-29a、Col1A1和α-SMA的表達(dá)水平。結(jié)果表明miR-29amimics可明顯抑制CFs的增殖活性，降低Col1A1和α-SMA的表達(dá)水平；而miR-29a inhibitors則表現(xiàn)為促進(jìn)CFs的增殖活性。

綜上所述，miR-29a mimics轉(zhuǎn)染CFs后，miR-29a表達(dá)上升，而CFs中miR-29a的高表達(dá)可以抑制其活化增殖，抑制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，表明miR-29a是CFs活化增殖的潛在的靶向分子，這為預(yù)防和治療心肌纖維化提供新思路。

［1］ Santulli G，Iaccarino G，De Luca N，et al.Atrial fibrillation and microRNAs［J］.Front Physiol，2014，5：15.

［2］ Santulli G，D＇ascia SL，D＇ascia C.Development of atrial fibrillation in recipients of cardiac resynchronization therapy：the role of atrial reverse remodelling［J］.Can JCardiol，2012，28（2）：245.e17-8.

［3］ 張 猛，陶 輝，陳澤文，等.化學(xué)合成microRNA-21 inhibitors對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞活化增殖的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（5）：577-81.

［4］ Kotoh M.Cardio-miRNAs and onco-miRNAs：circulatingmiRNA-based diagnostics for non-cancerous and cancerous diseases［J］. Front Cell Dev Biol，2014，2：61.

［5］ 郝 嘉，游 凱，肖穎彬.心肌成纖維細(xì)胞的特性和調(diào)節(jié)［J］.心血管病學(xué)進(jìn)展，2011，32（3）：405-8.

［6］ Chen P Y，Qin L，Zhuang Z W，et al.The docking protein FRS2αis a critical regulator of VEGF receptors signaling［J］. Proc Natl Acad Sci U SA，2014，111（15）：5514-9.

［7］ Cardin S，Guasch E，Luo X，et al.Role formicroRNA-21 in atrial profibrillatory fibrotic remodeling associated withexperimental postinfarction heart failure［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2012，5（5）：1027-35.

［8］ Wang J，Huang W，Xu R，et al.MicroRNA-24 regulates cardiac fibrosis aftermyocardial infarction［J］.JCell Mol Med，2012，16 （9）：2150-60.

［9］ Tan J，Tong B D，Wu Y J，et al.MicroRNA-29 mediates TGFβ1-induced extracellular matrix synthesis by targeting wnt/β-catenin pathway in human orbital fibroblasts［J］.Int JClin Exp Pathol，2014，7（11）：7571-7.

［10］Tao H，Yang J J，Chen ZW，et al.DNMT3A silencing RASSF1A promotes cardiac fibrosis through upregulation of ERK1/2［J］. Toxicology，2014，323：42-50.

Effect ofm icroRNA-29a inhibitors and m im ics on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats

Chen Zewen，Tao Hui，Zhou Xiao，et al
（Dept of Cardio-Thoracic Surgery，The Second Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Dept of Cardiovascular Disease Research Center，AnhuiMedical University，Hefei 230601）

Objective To explore the effection ofmiR-29a inhibitors and mimics on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats.Methods Cardiac fibroblasts were isolated from newly born male SD rats.miR-29a inhibitors or mimics was transfected respectively into cardiac fibroblasts through LipofectamineTM2000 Reagent. Twenty-four and Forty-eight hours after transfection，the expressions ofmiR-29a andmRNA of Col1A1 andα-SMA were analyzed by qRT-PCR.MTT assay was used to detect the proliferation activity of the transfected cardiac fibroblasts.Results Compared with normal group and negative group，expression ofmiR-29a was down-regulated in miR-29a inhibitors group while up-regulated inmiR-29amimics group.Col1A1mRNA expression was up-regulated in miR-29a inhibitors group while down-regulated inmiR-29amimics group.α-SMAmRNA expression was up-regulated in miR-29a inhibitors group while down-regulated inmiR-29amimics group.The cardiac fibroblasts proliferation activity decreased significantly after transfectedmiR-29amimicswhile increased in miR-29a inhibitors groups. Conclusion miR-29amimics can suppress the proliferation activity of cardiac fibroblasts significantly，implicating miR-29a as a potential target for cardiac fibroblasts activation and proliferation and pointing to this result can provide new way of thinking of interventions designed to prevent the cardiac fibrosis occurrence and development.

microRNA-29a；cardiac fibroblasts；Col1A1；α-SMA；qRT-PCR

R 542.2

A

1000-1492（2016）04-0493-04

2015-12-21接收

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81570295）；安徽省自然基金（編號(hào)：1308085MH117、1408085MH175）

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科、安徽醫(yī)科大學(xué)心血
管病研究中心，合肥 230601

陳澤文，男，碩士研究生；
石開虎，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shikaihu@gmail.com