王薛婷，郭強(qiáng)強(qiáng)，蔡藝欽，陳志福，李健，劉靜雯*

(1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén)361021)

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海洋球石藻(Emiliania huxleyi)通用表達(dá)載體的構(gòu)建與電轉(zhuǎn)化

王薛婷1，郭強(qiáng)強(qiáng)1，蔡藝欽1，陳志福1，李健1，劉靜雯1*

(1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén)361021)

摘要：海洋球石藻Emiliania huxleyi是一種全球廣泛分布的真核浮游植物，該種不僅是海洋碳、硫循環(huán)和全球氣候變化的重要指示物種，而且能夠產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝生物活性物質(zhì)，在生物技術(shù)領(lǐng)域也具有很好的應(yīng)用前景。本文通過(guò)分析氨芐青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、鏈霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7種常用抗生素對(duì)海洋球石藻生長(zhǎng)的影響，確定G418可作為該藻陽(yáng)性轉(zhuǎn)化藻株的抗性篩選試劑，其對(duì)應(yīng)的抗性基因neo則作為該藻表達(dá)載體構(gòu)建中的抗性篩選標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上克隆了綠色熒光蛋白基因gfp、抗性標(biāo)記基因neo及E. huxleyi BOF92內(nèi)源性巖藻黃素-葉綠素a/c結(jié)合蛋白基因的啟動(dòng)子fcp，以pUC18為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建了pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo兩個(gè)重組表達(dá)載體，以電轉(zhuǎn)化方法共轉(zhuǎn)化球石藻細(xì)胞并結(jié)合選擇性固體培養(yǎng)基篩選，成功獲得了被轉(zhuǎn)化的球石藻細(xì)胞。海洋球石藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為進(jìn)一步開(kāi)展該種相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：海洋球石藻；通用表達(dá)載體；neo標(biāo)記基因；電轉(zhuǎn)化

1引言

海洋微藻是海洋生物的重要餌料來(lái)源之一，具有種類多、繁殖快、數(shù)量大等特點(diǎn)，是海洋生物資源的重要組成部分。許多海洋微藻能夠產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝活性物質(zhì)，可用于食品、醫(yī)藥、能源及化工領(lǐng)域，特別是有些海洋微藻細(xì)胞中總脂類的含量可高達(dá)80%(干質(zhì)量)，在脂類生物活性物質(zhì)及能源開(kāi)發(fā)利用中具有很好的前景和優(yōu)勢(shì)[1—4]。微藻遺傳工程是操縱微藻代謝通路的強(qiáng)有力工具，利用基因工程改造微藻生物代謝途徑，可大大提高目標(biāo)活性物質(zhì)的合成和積累[5—8]。

海洋球石藻Emilianiahuxleyi是一種全球廣泛分布且具有重要生態(tài)功能的真核微型浮游植物。其獨(dú)特的生物礦化作用和高產(chǎn)DMSP能力已成為影響全球碳、硫生物地化循環(huán)及氣候變化的一個(gè)關(guān)鍵物種[9]。除此之外，該種還能夠產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝生物活性物質(zhì)，在生物技術(shù)研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。如，能有效合成和累積Ω-3長(zhǎng)鏈多元不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)，具有防止心血管疾病等藥理功能；能夠合成大量聚酮類化合物，具有良好的抗菌、抗蟲(chóng)、抗腫瘤等生物學(xué)活性[10—11]。

自然海域中，某些海洋球石藻E.huxleyi能夠被其特異的dsDNA病毒感染，且病毒感染和裂解被確認(rèn)是終止該藻赤潮的一個(gè)重要因素。海洋球石藻E.huxleyiCCMP1516及其特異性裂解病毒EhV86的全基因組測(cè)序注釋結(jié)果顯示，該藻擁有類似于其他生物完整的鞘脂類物質(zhì)生物合成途徑；而令人驚奇的是，EhV86基因組中存在編碼一系列可能參與宿主鞘脂類合成途徑的多種酶的基因[12—14]。病毒與宿主基因組間可能通過(guò)基因橫向轉(zhuǎn)移而共享這些代謝酶并可能在一定程度上掌控了宿主鞘脂類代謝，大量合成、積累病毒新型鞘脂類物質(zhì)并誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡[15—16]。然而，盡管病毒與宿主具有非常相似的鞘脂類代謝調(diào)控系統(tǒng)，但病毒與宿主基因組中同源基因表達(dá)的酶在鞘脂類代謝途徑中并不具有完全同源的功能[13，16]。病毒基因組中這些酶在宿主鞘脂類代謝途徑中的確切位置及功能目前尚不清楚?；诤Ｑ笄蚴錏.huxleyi及其特異性病毒的全基因組已被全部測(cè)序和注釋，通過(guò)建立該藻的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可從分子水平深入研究病毒與宿主間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，特別是病毒介導(dǎo)的宿主鞘脂類代謝調(diào)控機(jī)制；同時(shí)，在此基礎(chǔ)上可以采用基因工程技術(shù)改造球石藻鞘脂類合成代謝途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以期通過(guò)病毒介導(dǎo)的鞘脂類代謝過(guò)程合成新型的鞘脂類活性物質(zhì)。目前，有關(guān)海洋球石藻E.huxleyi遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以海洋球石藻E.huxleyiBOF92(Eh-BOF92)為材料，通過(guò)抗生素抗性基因篩選、啟動(dòng)子及標(biāo)記基因的克隆，構(gòu)建用于海洋球石藻的通用表達(dá)載體，建立適合該藻的電轉(zhuǎn)化方法及固體培養(yǎng)基篩選方法，構(gòu)建該藻的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為進(jìn)一步開(kāi)展海洋球石藻E.huxleyi相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1海洋球石藻

實(shí)驗(yàn)用海洋球石藻E.huxleyi為Eh-BOF92株系，分離自挪威海域，由挪威卑爾根大學(xué)生物系Gunnar Bratbak教授贈(zèng)送并保存于本實(shí)驗(yàn)室。

2.1.2菌種和試劑

Top10大腸桿菌(本實(shí)驗(yàn)室保存)，pUC18基礎(chǔ)載體、pMD-19T(TaKaRa公司產(chǎn)品)，pGFP載體(攜帶綠色熒光蛋白gfp基因，由中國(guó)海洋大學(xué)潘克厚教授贈(zèng)送)，pSELECT質(zhì)粒(攜帶抗性基因neo，購(gòu)自廈門(mén)泰京生物科技有限公司)。

氨芐青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、鏈霉素、新生霉素、嘌呤霉素、G418、X-gal(鷺隆生物科技有限公司)，ExTaq○R Hot Start Version試劑盒，限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ、PstⅠ、SacⅠ、EcoR Ⅰ、XbaⅠ)、T4DNA連接酶、rTaq酶、DNA marker(TaKaRa公司產(chǎn)品)；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒；MES(2-N-嗎啉代-乙磺酸)、Hepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)(上海生工BBI分裝)；甜菜堿為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；瓊脂糖為西班牙進(jìn)口分裝；MES-NaOH緩沖液(2-N-嗎啉代-乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液，0.5 mol/L，pH5.5)；Hepes (4-羥乙基哌嗪乙磺酸)電極緩沖液(0.080 mol/L KCl，0.005 mol/L CaCl2，0.2 mol/L甘露醇，0.2 mol/L山梨酸，0.01 mol/L Hepes，pH 7.2)，球石藻固體培養(yǎng)基所用瓊脂糖為Sigma Aldrich產(chǎn)品；PCR引物合成及基因測(cè)序均由英俊捷基(廣州)貿(mào)易有限公司完成。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1微藻生長(zhǎng)及抗生素篩選

液體培養(yǎng)采用70%海水配置的f/2-Si培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)采用70%海水配置的f/50培養(yǎng)基[17]，瓊脂糖濃度為1.5%(Sigma Aldrich)。培養(yǎng)條件為：溫度16℃，光照強(qiáng)度40 μmol/(m2·s)，光周期為14L∶10D(光∶暗)。

將對(duì)數(shù)期的藻種接種于50 mL的三角瓶中，接種量為20 mL，起始細(xì)胞密度約為1×104cell/mL，然后加入不同濃度的抗生素(表1)，抗生素濃度梯度由多次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組，培養(yǎng)條件同上。每24 h取樣一次，每次取樣200 μL，用盧氏碘液固定樣品，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。

2.2.2引物設(shè)計(jì)

基于抗生素篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果，G418作為球石藻適宜抗性篩選標(biāo)記，其對(duì)應(yīng)的抗性基因?yàn)閚eo。分別根據(jù)質(zhì)粒pSELECT和pGFP中的neo和gfp基因序列設(shè)計(jì)特異引物，根據(jù)E.huxleyiCCMP1516全基因組信息(http://genome.jgi-psf.org/Emihu1.home.html)查找球石藻基因組中巖藻黃素-葉綠素a/c結(jié)合蛋白基因的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)特異性引物。利用PLACE 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioniformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)E.huxleyi內(nèi)源性fcp啟動(dòng)子序列中的順式作用元件、增強(qiáng)子和阻遏因子等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。分別以質(zhì)粒pSELECT，pGFP及Eh-BOF92基因組為模板擴(kuò)增抗性基因neo、報(bào)告基因gfp和啟動(dòng)子基因fcp。采用CTAB法提取海洋球石藻基因組DNA[18]。采用GeneDoc軟件和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，本研究所用引物見(jiàn)表2。

表1　液體培養(yǎng)基中7種抗生素的實(shí)驗(yàn)濃度

表2　本實(shí)驗(yàn)所用引物

2.2.3Neo， gfp及fcp基因的擴(kuò)增

所有PCR反應(yīng)均分別在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行。Neo/gfp基因(無(wú)菌ddH2O 17.2 μL，rTaq DNA聚合酶0.3 μL，模板1 μL，引物F和R各1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL)的擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，58℃/52℃ 30 s，72℃ 60 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；啟動(dòng)子fcp基因(無(wú)菌ddH2O 11.05 μL，rTaq DNA聚合酶0.3 μL，模板1 μL，引物F和R各1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，5% DMSO 5 μL，5 mol/L Betaine 1.25 μL)的擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用TIANGEN通用DNA純化試劑盒回收各段PCR產(chǎn)物，連接到載體pMD19-T(16℃，8 h)。采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒小抽、PCR及雙酶切驗(yàn)證、測(cè)序。

2.2.4雙元表達(dá)載體的構(gòu)建

以pUC18為基礎(chǔ)載體，重組表達(dá)載體pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo的構(gòu)建過(guò)程如圖1a、1b所示。用質(zhì)粒PCR和雙酶切方法驗(yàn)證載體構(gòu)建成功后分別提取質(zhì)粒pUC18-fcp-neo和pUC18-fcp-gfp進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。

圖1　雙元表達(dá)載體pUC18-fcp-gfp(a)和pUC18-fcp-neo(b)的構(gòu)建過(guò)程圖Fig.1　Construction of plasmids pUC18-fcp-gfp (a) and pUC18-fcp-neo (b)

2.2.5重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性藻株的篩選

采用電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行共轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)儀為美國(guó)BTX，ECM830)。離心收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液100 mL(1 500×g，4℃，5 min)，將收集的細(xì)胞沉淀重懸于5 mL MES-NaOH緩沖液中，置于16℃培養(yǎng)箱反應(yīng)2 h，離心，棄廢液，用Hepes電極緩沖液洗滌細(xì)胞1次，離心，棄廢液。將細(xì)胞重新懸于Hepe緩沖液中，調(diào)整藻細(xì)胞密度為5×107cells/mL，再加入上述兩種重組質(zhì)粒充分混勻(重組質(zhì)粒的終濃度均分別為10 μg/mL)，用1 mL寬口吸頭充分混勻，冰浴15 min，以備電擊。吸取100 μL混合液，加入到0.2 cm冰浴的點(diǎn)擊杯中。根據(jù)臨界電場(chǎng)強(qiáng)度計(jì)算海洋球石藻細(xì)胞的臨界電場(chǎng)強(qiáng)度[19]，結(jié)果得出：球石藻理論臨界電場(chǎng)強(qiáng)度約為1 333～4 444 V/cm，因此電場(chǎng)強(qiáng)度范圍設(shè)置為1 600～4 000 V/cm，變化梯度為200 V/cm；電擊時(shí)間范圍為1.0～4.0 ms，變化梯度為1.0 ms，最終確定最佳電場(chǎng)強(qiáng)度和電擊時(shí)間，提高轉(zhuǎn)化效率。電擊后的樣品冰浴10 min，然后轉(zhuǎn)移到10 mL不含G418抗生素的培養(yǎng)基中，靜止恢復(fù)培養(yǎng)24 h(連續(xù)光照)，再向培養(yǎng)基中加入抗生素G418(終濃度為100 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況(日本Olympus，BX51)。低速離心濃縮細(xì)胞，涂布于含有G418(終濃度為100 μg/mL)抗性的f/50固體選擇性培養(yǎng)基中(設(shè)置野生型對(duì)照組)，倒置平板進(jìn)行培養(yǎng)，觀察微藻克隆的生長(zhǎng)情況。

3結(jié)果

3.1海洋球石藻Eh-BOF92對(duì)各種抗生素的敏感性

綜合分析本研究所用的7種抗生素對(duì)海洋球石藻Eh-BOF92生長(zhǎng)影響結(jié)果如圖2所示。不同濃度的氨芐青霉素、卡那霉素及鏈霉素對(duì)海洋球石藻生長(zhǎng)均無(wú)明顯抑制作用，表明該藻對(duì)上述3種抗生素不敏感；而不同濃度的氯霉素和新生霉素對(duì)海洋球石藻生長(zhǎng)均有一定程度的抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)濃度大于等于100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞停止生長(zhǎng)，可見(jiàn)球石藻Eh-BOF92對(duì)氯霉素和新生霉素有一定的敏感性；不同濃度的嘌呤霉素和G418對(duì)球石藻Eh-BOF92生長(zhǎng)均具有顯著的抑制作用，但抑制程度不同，當(dāng)濃度大于等于25 μg/mL時(shí)，在含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第10天致使細(xì)胞徹底死亡，而在含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)至第3天即可導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡，可見(jiàn)球石藻Eh-BOF92對(duì)G418的抑制作用非常敏感，因此G418可作為該藻陽(yáng)性轉(zhuǎn)化藻株的抗性篩選試劑，其對(duì)應(yīng)的抗性基因neo則作為該藻表達(dá)載體構(gòu)建中的抗性篩選標(biāo)記。

圖2　7種抗生素對(duì)海洋球石藻E. huxleyi BOF92生長(zhǎng)的影響Fig.2　Effects of seven antibiotics on the growth of E. huxleyi BOF92

3.23種功能元件的PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以pSELECT質(zhì)粒、pGFP質(zhì)粒和海洋球石藻E.huxleyiBOF92基因組為模板，PCR擴(kuò)增及測(cè)序驗(yàn)證獲得的目的基因片段大小分別為：neo/797 bp、gfp/717 bp和fcp/483 bp(圖3)，測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確。

圖3　3種功能元件neo， fcp和gfp基因克隆的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3　Agarose gel electrophoresis of neo， fcp and gfp genes cloninga. M 為 100 bp DNA 分子量標(biāo)記，泳道1為 neo (797 bp) 基因的PCR產(chǎn)物；b. M 為 100 bp DNA 分子量標(biāo)記，泳道1為 gfp(717 bp) 基因的PCR產(chǎn)物； c. M 為100 bp DNA分子量標(biāo)記， 泳道1為 fcp(483 bp) 基因的PCR產(chǎn)物a. M represents 100 bp DNA Ladder Marker， line 1 PCR product of neo(797 bp)； b. M represents 100 bp DNA Ladder Marker， line 1 PCR product of gfp(717 bp)； c. M represents 100 bp DNA Ladder Marker， line 1 PCR product of fcp(483 bp)

圖4　海洋球石藻E. huxleyi BOF92 fcp啟動(dòng)子基因預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4　Prediction results of the promoter fcp gene in E. huxleyi BOF92

3.3海洋球石藻Eh-BOF92內(nèi)源性fcp啟動(dòng)子序列的分析

利用在線生物信息學(xué)軟件對(duì)Eh-BOF92內(nèi)源性fcp啟動(dòng)子483 bp序列中的順式作用元件、增強(qiáng)子和阻遏因子等進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析(圖4)。該啟動(dòng)子序列含有豐富的順式作用元件，除含有基本的順式作用元件TATA-box和CAAT-box外，還包含有光響應(yīng)順式作用元件MNF1、Sp1以及MeJA響應(yīng)能力相關(guān)的順式作用元件CGTCA-motif和TGACG-motif[20—21]，胚乳表達(dá)需要的順式作用元件Skn-1-motif[20]，胚乳表達(dá)相關(guān)的順式作用元件GCN4-motif[22]，分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件CAT-box[23]，生理節(jié)奏控制相關(guān)的順式作用元件Circadian[24]，此外還存一些未命名的順式作用元件如CCCCGG和CTCC等。大量啟動(dòng)子順式作用元件的存在，說(shuō)明本研究所選擇的Eh-BOF92內(nèi)源性fcp啟動(dòng)子序列具有潛在的強(qiáng)啟動(dòng)子活性，可用于調(diào)控內(nèi)源或外源基因的表達(dá)。

3.4海洋球石藻雙元真核表達(dá)載體成功構(gòu)建確認(rèn)

分別將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp(圖1a)和pUC18-fcp-neo(圖1b)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果表明雙元重組表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖5a，5b)。

圖5　重組質(zhì)粒pUC18-gfp-fcp(a)和pUC18-fcp-neo(b)雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5　Agarose gel electrophoresis of the digest products of the recombinant plasmids pUC18-fcp-gfp (a) and pUC18-fcp-neo (b)M1為λ-Hind Ⅲ 酶切片段分子量標(biāo)記；M2為100 bp DNA 分子量標(biāo)記. 泳道1分別為重組質(zhì)粒pUC18-gfp (a) 和pUC18-fcp (b) ；泳道2分別為Sal Ⅰ+Pst Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pUC18-gfp后的產(chǎn)物(a) 和Sac Ⅰ+EcoR Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pUC18-fcp后的產(chǎn)物 (b)；泳道3分別為以重組質(zhì)粒pUC18-gfp為模板(a) 和的以重組質(zhì)粒pUC18-fcp為模板(b)的PCR產(chǎn)物；泳道4分別為重組質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp (a) 和重組質(zhì)粒pUC18-fcp-neo (b)；泳道5分別為Sac Ⅰ+EcoR Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp和BamH Ⅰ+Xba Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pUC18-fcp-neo后的產(chǎn)物；泳道6分別為以重組質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp為模板(a)和重組質(zhì)粒pUC18-fcp-neo為模板(b)的PCR產(chǎn)物M1 representsλ-Hind Ⅲ digest DNA Marker; M2 represents 100 bp DNA Ladder Marker. line 1 pUC18-gfp (a) and pUC18-fcp recombinant plasmids; line 2 pUC18-gfp/Sal Ⅰ+Pst Ⅰ and pUC18-fcp/Sac Ⅰ+EcoR Ⅰ; line 3 PCR product of the pUC18-gfp (a) and pUC18-fcp (b) recombinant plasmids; line 4 pUC18-fcp-gfp (a) and pUC18-fcp-neo(b) recombinant plasmids; line 5 pUC18-fcp-gfp / Sac Ⅰ+EcoR Ⅰ (a) and pUC18-fcp-neo / BamH Ⅰ+Xba Ⅰ (b) ; line 6 PCR products of the pUC18-fcp-gfp (a) and pUC18-fcp-neo (b) recombinant plasmids

圖6　海洋球石藻E. huxleyi BOF92電擊轉(zhuǎn)化培養(yǎng)1周后于光學(xué)顯微鏡下的觀察結(jié)果Fig.6　The microscopical photographs of E. huxleyi BOF92 by electroporation and culturing for one weeka.光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果；b.熒光顯微鏡觀察結(jié)果(480 nm) a. Light microscopical photograph; b. fluorescent microscopical photograph(480 nm)

圖7　野生型(a)和轉(zhuǎn)化的海洋球石藻E. huxleyi BOF92(b)在含有G418(100 g/mL)選擇性固體培養(yǎng)基上的篩選生長(zhǎng)結(jié)果Fig.7　The cultures of wild-type (a) and transgenic E.huxleyi BFO92 cells (b) streaked on the G418 (100 g/mL) containing medium after electroporation 20 days (f/50 medium)

3.5電擊法成功轉(zhuǎn)化海洋球石藻BOF92

本文參考Muto等的方法[19]，對(duì)海洋球石藻的電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行摸索。將構(gòu)建好的含有抗性基因neo的質(zhì)粒pUC18-fcp-neo和含有報(bào)告基因gfp的質(zhì)粒pUC18-fcp-gfp共轉(zhuǎn)化海洋球石藻細(xì)胞，將電擊后的E.huxleyi細(xì)胞置于不含抗生素G418的液體培養(yǎng)基中，在連續(xù)光照條件下培養(yǎng)24 h，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間恢復(fù)后再向培養(yǎng)液中加入G418(終濃度為100 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)1周，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化情況。結(jié)果顯示E.huxleyi培養(yǎng)液中存在發(fā)綠色熒光的藻細(xì)胞(圖6)，說(shuō)明轉(zhuǎn)化組的藻細(xì)胞中同時(shí)含有g(shù)fp基因和neo基因并實(shí)現(xiàn)了瞬時(shí)表達(dá)。將在選擇性液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的藻細(xì)胞離心(1 300×g，4℃，2 min)濃縮后(8×107cells/mL)，取1 mL涂布到固體選擇性培養(yǎng)基上(G418終濃度為100 μg/mL)，于16℃培養(yǎng)，1周后可見(jiàn)白色陽(yáng)性藻克隆的形式，3周后形成具有色素的藻克隆(圖7)。

4討論

選擇標(biāo)記是微藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的關(guān)鍵元素之一。常用于微藻篩選轉(zhuǎn)化子的選擇壓力試劑有氯霉素、G418、卡那霉素、潮霉素等，但不同的海洋真核微藻對(duì)各種抗生素的敏感性不同。例如杜氏鹽藻對(duì)鏈霉素、卡那霉素、潮霉素和G418不敏感，而對(duì)氯霉素高度敏感[25]；橢圓小球藻對(duì)氯霉素、鏈霉素、卡那霉素不敏感，對(duì)潮霉素較敏感，而對(duì)G418表現(xiàn)出高度敏感性[26]；金藻對(duì)潮霉素、G418和氯霉素有點(diǎn)敏感，對(duì)腐草霉素家族的Zeocin最為敏感[27]。目前人們已在許多模式藻株中進(jìn)行抗生素敏感性研究，建立了一些模式藻株的選擇標(biāo)記基因。其中適用于萊茵衣藻的有氨基葡萄糖苷腺苷轉(zhuǎn)移酶基因addA、乙酰乳酸合成酶基因Als、核糖體蛋白S14基因及氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因aphVⅢ等[28—31]；適用于三角褐指藻的有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat、諾爾絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因nat、鏈絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因Sat-I、shble蛋白基因及草銨膦基因bar等[32—35]。目前，有關(guān)海洋球石藻E.huxleyi基因工程選擇標(biāo)記篩選的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，基于上述已有的研究報(bào)道，本研究選擇了常見(jiàn)的7種抗生素用于海洋球石藻生長(zhǎng)抗性的篩選。G418是一種氨基糖苷類抗生素，其通過(guò)影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)的合成，對(duì)原核和真核等生物細(xì)胞都有毒性。在真核微藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，攜帶有抗性基因neo的轉(zhuǎn)基因藻株具有G418抗性[36]。本研究結(jié)果顯示，海洋球石藻對(duì)G418和嘌呤霉素均高度敏感，但嘌呤霉素價(jià)格昂貴、毒性較強(qiáng)且目前尚未報(bào)道其作為基因工程藻株的選擇標(biāo)記使用。因此，從抗生素對(duì)細(xì)胞的敏感程度、所使用抗生素的劑量、經(jīng)濟(jì)效益以及細(xì)胞對(duì)抗生素的耐受程度等方面綜合考慮，我們選擇G418作為海洋球石藻基因工程藻株的選擇標(biāo)記，其抗性基因neo可以作為構(gòu)建海洋球石藻真核表達(dá)載體的選擇標(biāo)記基因。綠色熒光蛋白gfp基因作為報(bào)告基因已廣泛用于各種海藻遺傳工程及亞細(xì)胞定位研究[37—38]，與其他報(bào)告基因相比，gfp結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞的生理毒害小且保留時(shí)間較長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)化的球石藻細(xì)胞中g(shù)fp基因至少在培養(yǎng)的7 d左右仍能有效表達(dá)，因此gfp基因可作為球石藻基因工程藻株構(gòu)建中一種良好的報(bào)告基因。

一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子是真核微藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的必要元件，以確保外源基因高效轉(zhuǎn)錄。硅藻的內(nèi)源性巖藻黃素-葉綠素a/c結(jié)合蛋白與高等植物和綠藻類的葉綠素a/b結(jié)合蛋白(CAB)的功能相同，主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)。三角褐指藻內(nèi)源性巖藻黃素-葉綠素a/c結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子fcp在硅藻及其他幾種海洋微藻中都能有效促使基因高效表達(dá)，如在三角褐指藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，采用內(nèi)源性fcp強(qiáng)啟動(dòng)子能夠融合sat-I、nptⅡ、uidA和gfp等蛋白并穩(wěn)定表達(dá)外源基因[3，33，39—40]。fcp啟動(dòng)子序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同真核微藻來(lái)源的fcp序列具有較高的同源性和保守性，說(shuō)明來(lái)源于不同真核微藻的fcp啟動(dòng)子序列具有類似的功能。Eh-BOF92內(nèi)源性啟動(dòng)子fcp序列含有豐富的順式作用元件如TATA-box和CAAT-box，說(shuō)明該內(nèi)源性fcp啟動(dòng)子序列具有潛在的強(qiáng)啟動(dòng)子活性，可用于調(diào)控內(nèi)源或外源基因的表達(dá)(圖4)。通過(guò)電擊法對(duì)Eh-BOF92細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，控制光照周期14L∶10D(光∶暗)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在外界選擇壓力G418的作用下，Eh-BOF92轉(zhuǎn)化組細(xì)胞內(nèi)源性fcp啟動(dòng)子調(diào)控neo基因的表達(dá)從而確保陽(yáng)性細(xì)胞株正常生長(zhǎng)。在G418選擇性液體和固體培養(yǎng)基上可以篩選到陽(yáng)性藻株的生長(zhǎng)，表明neo及gfp基因在球石藻細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了瞬時(shí)的穩(wěn)定表達(dá)，Eh-BOF92內(nèi)源性fcp啟動(dòng)子能夠高效轉(zhuǎn)錄外源基因。

合適的轉(zhuǎn)化方法也是外源基因能否在真核微藻細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。目前已經(jīng)建立了許多轉(zhuǎn)化真核微藻細(xì)胞的方法，主要有玻璃珠法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法、基因槍法、超聲波轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法等。電擊轉(zhuǎn)化法作為真核微藻遺傳轉(zhuǎn)化常用方法之一，已成功運(yùn)用于多種微藻，如萊茵衣藻、小球藻、普通小球藻、紅藻和雨生紅球藻等[3]。一般情況下，電擊轉(zhuǎn)化微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞時(shí)使用環(huán)狀或超螺旋質(zhì)粒能夠獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，而使用線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化能夠提高外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中的幾率，更易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子，但線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率極低且更易被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶消化。真核微藻電擊轉(zhuǎn)化時(shí)高純度質(zhì)粒有利于獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，外源基因能夠在細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)，也存在整合到基因組中的幾率，但大部分?jǐn)y帶外源基因的環(huán)狀質(zhì)粒會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而稀釋，導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。本研究采用高純度的環(huán)狀質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后第7天在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)綠色熒光的藻細(xì)胞，并在選擇性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周左右長(zhǎng)出具色素的藻克隆(圖7)，說(shuō)明該環(huán)狀質(zhì)粒至少能在該藻細(xì)胞內(nèi)存在近一個(gè)月以上，或也有少量質(zhì)粒整合到了基因組上。另外，如何將外源基因和篩選標(biāo)記基因同時(shí)導(dǎo)入微藻細(xì)胞，在操作上有兩種策略可以選擇：一是外源基因與篩選標(biāo)記基因一起構(gòu)建在同一個(gè)載體上[41]；另一個(gè)策略是將外源基因和篩選標(biāo)記基因分別構(gòu)建在不同載體上，然后兩種質(zhì)粒以共轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化微藻[34]。我們比較了單轉(zhuǎn)化和共轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)兩者之間的轉(zhuǎn)化效率沒(méi)有明顯差別，同時(shí)考慮到將來(lái)在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因藻株時(shí)，如果將將眾多元件同時(shí)克隆在一個(gè)啟動(dòng)子下游，可能會(huì)影響外源基因的整合與表達(dá)，因此本研究選擇了雙元載體共轉(zhuǎn)化方法。

電場(chǎng)強(qiáng)度是影響電擊轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一。電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)高或過(guò)低都未能獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，原因是在單位電擊距離內(nèi)，電壓過(guò)高對(duì)細(xì)胞傷害較大，影響細(xì)胞存活率；電壓過(guò)低則不易在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生短暫的可恢復(fù)小孔，外源基因很難進(jìn)入細(xì)胞。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)材料Eh-BOF92優(yōu)化或的電轉(zhuǎn)化條件為：電場(chǎng)強(qiáng)度為2 000 V/cm、電擊時(shí)間為2 ms/次、共電擊2次時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到0.07%。在1 000 V/cm，2 ms的電擊條件下轉(zhuǎn)化萊茵衣藻細(xì)胞壁缺失的突變體細(xì)胞，獲得了1 000個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)細(xì)胞的高轉(zhuǎn)化效率[42]。相比之下，球石藻轉(zhuǎn)化效率比萊茵衣藻低很多，原因可能是由于本實(shí)驗(yàn)用的球石藻Eh-BOF92細(xì)胞表面覆含豐富的球石粒而導(dǎo)致細(xì)胞膜未能與質(zhì)粒DNA充分接觸。盡管在電擊轉(zhuǎn)化之前采用MES-NaOH緩沖液處理細(xì)胞表面，但反應(yīng)時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都將影響轉(zhuǎn)化效率高低。反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，球石藻表面的球石粒處理不徹底導(dǎo)致外源基因很難與細(xì)胞膜接觸而難于穿過(guò)細(xì)胞膜；反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則影響細(xì)胞活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡而使轉(zhuǎn)化效率較低。此外，由于球石藻E.huxleyi生活史中具有二倍體和單倍體世代，兩個(gè)不同時(shí)期的細(xì)胞大小存在差異也可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率較低的原因。細(xì)胞大小存在差異將導(dǎo)致理論電場(chǎng)強(qiáng)度不同，最終將影響轉(zhuǎn)化效率較低。本文雖然是一個(gè)初步的研究，但作為具有重要生態(tài)學(xué)意義和生物技術(shù)應(yīng)用前景的一種重要的海洋微藻，建立并進(jìn)一步優(yōu)化該海洋球石藻的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將為后續(xù)一系列科學(xué)研究提供了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bellou S， Baeshen M N， Elazzazy A M， et al. Microalgal lipids biochemistry and biotechnological perspectives[J]. Biotechnol Adv， 2014， 32(8): 1476-1493.

[2]De Morais M G， Vaz Bda S， de Morais E G， et al. Biologically active metabolites synthesized by microalgae[J]. Biomed Res Int， 2015， 2015:835761.

[3]Qin S， Jiang P， Tseng C K. Molecular biotechnology of marine algae in China[J]. Hydrobiologia， 2004， 512(1/3): 21-26.

[4]Niu Y F， Yang Z K， Zhang M H， et al. Transformation of diatomPhaeodactylumtricornutumby electroporation and establishment of inducible selection marker[J]. BioTech Rap Dis， 2012， doi: 10.2144/000113881.

[5]Radakovits R， Eduafo P M， Posewitz M C. Genetic engineering of fatty acid chain length inPhaeodactylumtricornutum[J]. Metab Eng， 2011， 13(1): 89-95.

[6]Qin S， Lin H Z， Jiang P. Advances in genetic engineering of marine algae[J]. Biotechnol Adv， 2012， 30(6): 1602-1613.

[7]Hlavova M， Turoczy Z， Bisova K. Improving microalgae for biotechnology-from genetics to synthetic biology[J]. Biotechnol Adv， 2015， 33(6): 1194-1203.

[8]Xue J， Niu Y F， Huang T， et al. Genetic improvement of the microalgaPhaeodactylumtricornutumfor boosting neutral lipid accumulation[J]. Metab Eng， 2015， 27: 1-9.

[9]Joassin P， Delille B， Soetaert K， et al. Carbon and nitrogen flows during a bloom of the coccolithophoreEmilianiahuxleyi: modelling a mesocosm experiment[J]. J Marine Syst， 2011， 85(3/4): 71-85.

[10]Sayanova O， Haslam R P， Calerón M V， et al. Identification and functional characterisation of genes encoding the omega-3 polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathway from the coccolithophoreEmilianiahuxleyi[J]. Phytochemistry， 2011， 72(7): 594-600.

[11]Read B A， Kegel J， Klute M J， et al. Pan genome of the phytoplanktonEmilianiaunderpins its global distribution[J]. Nature， 2013， 499(7457): 209-213.

[12]Evans C， Pond D W， Wilson W H. Changes inEmilianiahuxleyifatty acid profiles during infection withE.huxleyivirus 86: physiological and ecological implications[J]. Aquat Microb Ecol， 2009， 55(3): 219-228.

[13]Michaelson L V， Dunn T M， Napier J A. Viraltrans-dominant manipulation of algal sphingolipids[J]. Trends Plant Sci， 2010， 15(12): 651-655.

[14]Wilson W H， Schroeder D C， Allen M J， et al. Complete genome sequence and lytic phase transcription profile of aCoccolithovirus[J]. Science， 2005， 309(5737): 1090-1092.

[15]Liu X H， Zheng T L， Cai Y X， et al. Cloning， expression and characterization of serine palmitoyltransferase (SPT)-like gene subunit (LCB2) from marineEmilianiahuxleyivirus (Coccolithovirus) [J]. Acta Oceanologica Sinica， 2012， 31(6): 127-138.

[16]Vardi A， Van Mooy B A S， Fredricks H F， et al. Viral glycosphingolipids induce lytic infection and cell death in marine phytoplankton[J]. Science， 2009， 326(5954): 861-865.

[17]Laguna R， Romo J， Read B A， et al. Induction of phase variation events in the life cycle of the marine coccolithophoridEmilianiahuxleyi[J]. Appl Environ Microbiol， 2001， 67(9): 3824-3831.

[18]Sambrook J， Russell D W. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 3版. 黃培堂， 譯. 北京: 科學(xué)出版社， 2002.

Sambrook J， Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual[M]. 3rd ed. Huang Peitang,Trans. Beijing: Science Press， 2002.

[19]Muto M， Fukuda Y， Nemoto M， et al. Establishment of a genetic transformation system for the marine pennate diatomFistuliferasp. strain JPCC DA0580-a high triglyceride producer[J]. Mar Biotechnol， 2013， 15(1): 48-55.

[20]余愛(ài)麗， 趙晉鋒， 王高鴻， 等. 兩個(gè)谷子CIPK基因在非生物逆境脅迫下的表達(dá)分析[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2016， 42(2): 295-302.

Yu Aili， Zhao Jinfeng， Wang Gaohong， et al. Expression analysis of twoCIPKgenes under abiotic stress in foxtail millet[J]. Acta Agronomica Sinica， 2016， 42(2): 295-302.

[21]鄭曉瑜， 郭晉艷， 張毅， 等. 植物非生物脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子順式作用元件的研究方法[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2011， 47(2): 129-135.

Zheng Xiaoyu， Guo Jinyan， Zhang Yi， et al. Research methods of cis-acting elements in plant abiotic stress inducible promoters[J]. Plant Physiology Journal， 2011， 47(2): 129-135.

[22]Cheng S J， Wang Z Y， Hong M M. Rice bZIP protein， REB， interacts with GCN4 motif in promoter ofWaxygene[J]. Science in China Series C: Life Sciences， 2002， 45(4): 352-360.

[23]張積森， 林清凡， 方靜平， 等. 甘蔗SPSⅢ啟動(dòng)子區(qū)ATCT-motif和CAT-box元件的酵母單雜交報(bào)告載體構(gòu)建[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2013， 29(1): 86-89.

Zhang Jisen， Lin Qingfan， Fang Jingping， et al. Construction of yeast one-hybrid reporter vector for screening the binding proteins of ATCT-motif and CAT-box inSPSⅢ promoter[J]. Journal of Fujian Normal University (Natural Science Edition)， 2013， 29(1): 86-89.

[24]許家輝， 朱娜， 溫超， 等. 龍眼LEAFY同源基因啟動(dòng)子的克隆與序列分析[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2011， 28(4): 689-693.

Xu Jiahui， Zhu Na， Wen Chao， et al. Cloning and sequence analysis ofLEAFYgene promoter from longan (Dimocarpuslongan)[J]. Journal of Fruit Science， 2011， 28(4): 689-693.

[25]耿德貴， 王義琴， 李文彬， 等. 杜氏鹽藻基因工程選擇標(biāo)記的研究[J]. 生物技術(shù)， 2001， 11(5): 1-3.

Geng Degui， Wang Yiqin， Li Wenbin， et al. Study on selective marker ofDunaliellasalinagenetic engineering[J]. Biotechnology， 2001， 11(5): 1-3.

[26]陳穎， 李文彬， 張利明， 等. 小球藻對(duì)5種常用基因工程抗生素的敏感性研究[J]. 海洋與湖沼， 1999， 30(5): 500-505.

Chen Ying， Li Wenbing， Zhang Liming， et al. Study on sensitivities ofChlorellaEllipsoideato 5 antibiotics in genetic engineering[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica， 1999， 30(5): 500-505.

[27]曹軍平， 費(fèi)志清， 劉必謙， 等. 金藻基因工程選擇標(biāo)記的研究[J]. 海洋科學(xué)， 2001， 25(7): 6-8.

Cao Junping， Fei Zhiqing， Liu Biqian， et al. Study on the selectable marker forDicrateriainornatagene engineering[J]. Marine Sciences， 2001， 25(7): 6-8.

[28]Cerutti H， Johnson A M， Gillham N W， et al. A eubacterial gene conferring spectinomycin resistance onChlamydomonasreinhardtii: integration into the nuclear genome and gene expression[J]. Genetics， 1997， 145(1): 97-110.

[29]Kovar J L， Zhang J， Funke R P， et al. Molecular analysis of the acetolactate synthase gene ofChlamydomonasreinhardtiiand development of a genetically engineered gene as a dominant selectable marker for genetic transformation[J]. Plant J， 2002， 29(1): 109-117.

[30]Nelson J A， Savereide P B， Lefebvre P A. TheCRY1 gene inChlamydomonasreinhardtii: structure and use as a dominant selectable marker for nuclear transformation[J]. Mol Cell Biol， 1994， 14(6): 4011-4019.

[31]Sizova I， Fuhrmann M， Hegemann P. A streptomyces rimosus aph VⅢ gene coding for a new type phosphotransferase provides stable antibiotic resistance toChlamydomonasreinhardtii[J]. Gene， 2001， 277(1/2): 221-229.

[32]Hallmann A， Rappel A. Genetic engineering of the multicellular green algaVolvox: a modified and multiplied bacterial antibiotic resistance gene as a dominant selectable marker[J]. Plant J， 1999， 17(1): 99-109.

[33]Slavskaia L A， Lippmerier J C， Kroth P G， et al. Transformation of the diatomPhaeodactylumtricornutum(bacillariophyceae) with a variety of selectable marker and reporter genes[J]. J Phycol， 2000， 36(2): 379-386.

[34]Apt K E， Kroth-Pancic P G， Grossman A R. Stable nuclear transformation of the diatomPhaeodactylumtriconutum[J]. Mol Gen Genet， 1996， 252(5): 572-579.

[35]鄭國(guó)庭， 姜鵬， 秦松， 等. 三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)通用轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建[J]. 生物學(xué)雜志， 2012， 29(4): 8-11.

Zheng Guoting， Jiang Peng， Qin Song， et al. Construction of a transformation vector for diatomPhaeodactylumtricornutum[J]. Journal of Biology， 2012， 29(4): 8-11.

[36]Paludan K， Duch M， J?rgensen P， et al. Graduated resistance to G418 leads to differential selection of cultured mammalian cells expressing theneogene[J]. Gene， 1989， 85(2): 421-426.

[37]Miyagawa A， Okami T， Kira N， et al. Research note: high efficiency transformation of the diatomPhaeodactylumtricornutumwith a promoter from the diatomCylindrothecafusiformis[J]. Phycol Res， 2009， 57(2): 142-146.

[38]Watanabe S， Ohnuma M， Sato J， et al. Utility of a GFP reporter system in the red algaCyanidioschyzonmerolae[J]. J Gen Appl Microbiol， 2011， 57(1): 69-72.

[39]Li F C， Qin S， Jiang P， et al. The integrative expression ofGUSgene driven by FCP promoter in the seaweedLaminariajaponica(Phaeophyta) [J]. J Appl Phycol， 2009， 21(3): 287-293.

[40]Miyagawa-Yamaguchi A， Okami T， Kira N， et al. Stable nuclear transformation of the diatomChaetocerossp.[J]. Phycol Res， 2011， 59(2): 113-119.

[41]Ladygin V G. Efficient transformation of mutant cells ofChlamydomonasreinhardtiiby electroporation[J]. Process Biochem， 2004， 39(11): 1685-1691.

[42]Falciatore A， Casotti R， Leblanc C， et al. Transformation of nonselectable reporter genes in marine diatoms[J]. Mar Biotechnol， 1999， 1(3): 239-251.

收稿日期：2015-12-11；

修訂日期：2016-03-03。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(41576166)；福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2015Y0039)；廈門(mén)市南方海洋研究中心項(xiàng)目(14GZP71NF35)。

作者簡(jiǎn)介：王薛婷(1991—)，女，山西省臨汾市人，主要從事海洋微生物分子生物學(xué)研究。E-mail:xuetingw1991@163.com *通信作者：劉靜雯(1965—)，女，山西省太原市人，教授，主要從事海洋微生物資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：ljwsbch@163.com, jwliu@jmu.edu.cn

中圖分類號(hào):Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0253-4193(2016)08-0103-12

Construction of expression vector and transformation via electroporation in coccolithophore Emiliania huxleyi

Wang Xueting1， Guo Qiangqiang1， Cai Yiqin1， Chen Zhifu1， Li Jian1， Liu Jingwen1

(1.CollegeofFoodandBioengineering，JiMeiUniversity，Xiamen361021，China)

Abstract:The marine coccolithophore Emiliania huxleyi is a eukaryotic microalga species crucial to the study of global biogeochemical cycles and climate modeling and also much of interest to those in biotechnology due to the capable of abundant bioactive metabolites production. Here， seven different kinds of antibiotics including ampicillin， kanamycin， G418， chloramphenicol， streptomycin， novobiocin and puromycin were used for the screening of antibiotic resistance. G418 was chosen most suitable selective antibiotics and the corresponding resistance gene “neo” as the marker for E. huxleyi genetic system. The promoter of the endogenic fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein gene “fcp” was cloned from E. huxleyi BOF92 strain. A construct was made containing the green fluorescent protein reporter gene “gfp” and screened G418 resistance gene “neo”. The resultant recombinant transformation vectors pUC18-fcp-gfp and pUC18-fcp-neo were co-transferred into E. huxleyi by electroporation. Transformants were obtained upon G418 selection. The results presented the new genetic transformation system for E. huxleyi， providing additional genetic resource with potential for exploring basic biological questions and biotechnological applications.

Key words:Emiliania huxleyi; vector construction; neo marker gene; electroporation

王薛婷，郭強(qiáng)強(qiáng)，蔡藝欽，等. 海洋球石藻(Emilianiahuxleyi)通用表達(dá)載體的構(gòu)建與電轉(zhuǎn)化[J].海洋學(xué)報(bào)，2016，38(8)：103—114， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.08.011

Wang Xueting， Guo Qiangqiang， Cai Yiqin， et al. Construction of expression vector and transformation via electroporation in coccolithophoreEmilianiahuxleyi[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(8)：103—114， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.08.011