魯宇青　韓進(jìn)超　叢旭　魏來(lái)　潘孝本

100044 北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京大學(xué)肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

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應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向切割細(xì)胞內(nèi)乙型肝炎病毒基因組的研究

魯宇青韓進(jìn)超叢旭魏來(lái)潘孝本

100044 北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京大學(xué)肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

【摘要】目的應(yīng)用近年發(fā)展的基因編輯技術(shù)成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)引導(dǎo)的Cas9核酸酶特異性靶向切割HBV DNA基因。方法基于慢病毒載體的lentiCRISPRv2系統(tǒng)，我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)特異靶向HBV基因組的向?qū)NA序列(guide RNA, gRNA)。質(zhì)粒pUC18-HBV1.2和lentiCRISPR-gRNAs共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，或lentiCRISPR-gRNAs與相關(guān)慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后產(chǎn)生相應(yīng)慢病毒。用慢病毒處理整合了HBV DNA的HepG2.2.15細(xì)胞或者HepDE19細(xì)胞系；并用慢病毒處理基于C57BL/6小鼠腺相關(guān)病毒HBV復(fù)制模型。結(jié)果單靶向CRISPR/Cas9切割可以抑制30%～50%病毒蛋白產(chǎn)生。兩個(gè)或三個(gè)靶向切割則顯著提高抑制效率，可達(dá)70%～90%。以慢病毒體系處理HepG2.2.15或HepDES19細(xì)胞時(shí)，HepDES19細(xì)胞中HBeAg下降幅度約為HepG2.2.15細(xì)胞中的3倍。HBV復(fù)制小鼠模型在CRISPR/Cas9慢病毒處理后，血清中HBsAg和HBeAg可轉(zhuǎn)為陰性。結(jié)論CRISPR/Cas9系統(tǒng)多位點(diǎn)靶向切割可高效清除細(xì)胞內(nèi)基因組，相對(duì)于整合于染色體的基因組，游離于細(xì)胞核的HBV基因組對(duì)此靶向切割系統(tǒng)更加敏感。

【主題詞】肝炎,乙型；共價(jià)閉合環(huán)狀DNA；CRISPR/Cas9；基因；抗病毒

Fundprogram:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81170386)

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)是雙鏈?zhǔn)雀蜠NA病毒，其感染肝細(xì)胞后，病毒基因組在HBV核心蛋白介導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞核，可形成非整合型的微染色體，作為病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制模板長(zhǎng)期存在，是當(dāng)前抗病毒治療停藥后復(fù)發(fā)及耐藥發(fā)生的關(guān)鍵原因[1,2]。因此，徹底清除肝細(xì)胞內(nèi)的HBV基因組也是達(dá)到慢乙肝治療徹底治愈的根本措施。此外，HBVDNA可整合入肝細(xì)胞，這可能是肝癌發(fā)生的早期事件[3]。過(guò)去十余年來(lái)，基因編輯技術(shù)的發(fā)展為靶向基因功能的失活提供了技術(shù)上的可能。如鋅指核酶技術(shù)、TALEN等基因編輯技術(shù)均曾嘗試用于細(xì)胞模型或動(dòng)物模型中靶向HBVDNA的切割[4,5]。但這類(lèi)技術(shù)為基于蛋白多肽模板對(duì)特定基因序列的識(shí)別，在識(shí)別設(shè)計(jì)方面有較大難度，極大限制了其研究與應(yīng)用。新近發(fā)展的基因編輯技術(shù)成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat) 引導(dǎo)的Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因編輯手段由于其設(shè)計(jì)和應(yīng)用簡(jiǎn)便而成為最新的研究熱點(diǎn)。此系統(tǒng)的工作原理為通過(guò)堿基配對(duì)與引導(dǎo)核酸酶Cas9 對(duì)配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，通過(guò)人工設(shè)計(jì)具有引導(dǎo)作用的sgRNA(shortguideRNA)，即可引導(dǎo)核酸酶Cas9 對(duì)DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割[6,7]。由于sgRNA設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，因此CRISPR/Cas9在基因編輯方面得到廣泛的應(yīng)用。在本研究中，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和多種細(xì)胞模型，我們?cè)u(píng)估了其對(duì)不同形式細(xì)胞內(nèi)HBV基因組的切割效應(yīng)。

圖1　靶向HBV基因的LentiCRISPR載體的設(shè)計(jì)及靶向序列Fig.1　The design and sequences of LentiCRISPR plasmids targeting at HBVgenome

1材料與方法

1.1質(zhì)粒構(gòu)建我們應(yīng)用可表達(dá)hSpCas9 并轉(zhuǎn)錄sgRNA單載體表達(dá)系統(tǒng)lentiCRISPRv2(AddGene, 美國(guó))構(gòu)建靶向HBVDNA的CRISPR/Cas9慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)。據(jù)設(shè)計(jì)靶向位點(diǎn)所需的HBV基因組上的NGG模序、不同HBV基因型(B、C及D)中的該序列保守性及與宿主細(xì)胞染色體序列的差異性。如下圖1所示，我們挑選了靶向HBV的C基因區(qū)靶序列合成相應(yīng)的寡核苷酸(方框內(nèi)序列，賽百盛，北京)。以無(wú)關(guān)序列CATCGATCGATCCTAGCTAG作為對(duì)照。質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BsmBI酶切后插入帶有酶切位點(diǎn)的寡核苷酸。lentiCRISPRv2載體結(jié)構(gòu)、HBV基因組上的靶向區(qū)域及序列如下圖1，所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性由測(cè)序鑒定(諾賽基因，北京)，分別命名為L(zhǎng)entiCRISPR-2004、LentiCRISRP-2144、LentiCRISPR-2414及LentiCRISPR-Con。所有質(zhì)粒應(yīng)用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取(Qiagen，德國(guó))。

1.2細(xì)胞系及慢病毒包裝HEK293T細(xì)胞系及人肝癌細(xì)胞系HepG2在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，整合了HBVDNA的HepG2.2.15及HepDES19細(xì)胞使用添加了380μg/mlG418 (Sigma，美國(guó))的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))。包裝慢病毒時(shí)，各lentiCRISPR穿梭質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒pVSVg、psPAX2按2∶1∶1比例混合，使用TurboFec轉(zhuǎn)染試劑(Thermoscientific，美國(guó))共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后第2、3天收取培養(yǎng)上清，采用PEG-8000沉淀方法濃縮沉淀病毒。病毒滴度采用Quicktiter慢病毒試劑盒(Cellbiolab，美國(guó))檢測(cè)。病毒收集后并存于-80度。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及慢病毒感染HepG2細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)密度約50%時(shí)采用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染pUC18-HBV1.2(我所構(gòu)建保存)及單個(gè)或者多個(gè)LentiCRISPR質(zhì)粒(LentiCRISPR質(zhì)粒總量和pUC18-HBV1.2相同)。HepG2.2.15細(xì)胞及HepDES19細(xì)胞(美國(guó)Drexel大學(xué)郭巨濤教授惠贈(zèng))接種于24孔板，生長(zhǎng)至密度約50%時(shí)以CRISPR/Cas9慢病毒(MOI=10)感染培養(yǎng)細(xì)胞。次日換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)至第3天取上清檢測(cè)。

1.4HBVDNA及蛋白定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBVDNA提取采用TIANamp病毒DNA提取試劑盒(天根生化，中國(guó))。HBVDNA定量檢測(cè)采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Qiagen，德國(guó))方法，引物序列見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV相關(guān)抗原及抗體采用電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)(Abbott，美國(guó))。

圖3　CRISPR/Cas9慢病毒處理HepDES19及HepG2.2.15細(xì)胞后培養(yǎng)上清中HBeAg檢測(cè)(A)及HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA檢測(cè)(B).細(xì)胞以各CRISPR/Cas9慢病毒處理(MOI=10)，3 d后取上清檢測(cè)(n=3)。兩組之間數(shù)據(jù)配對(duì)t檢驗(yàn)，* P<0.05 (n=3)Fig.3　Detection of HBeAg (A) and/or HBV DNA (B) in supernatant of HepDES19 and HepG2.2.15 cells treated with lentivirus CRISPR/Cas9. Cells were treated with the lentivirus at MOI of 10, and supernatant were collected on day 3. t-test was used for comparing of HBeAg between groups of HepDES19 and HepG2.2.15. * P<0.01 (n=3)

1.5慢乙肝動(dòng)物模型6周齡的C57BL/6小鼠(維通利華公司，北京)通過(guò)尾靜脈注射1×1010拷貝AAV-HBV1.3病毒(五加和分子醫(yī)學(xué)研究所，北京)，以建立慢性HBV復(fù)制模型[9]。一個(gè)月后HBV穩(wěn)定復(fù)制，通過(guò)尾靜脈注射LentiCRISPR/Cas9nt2004,nt2144及nt2414慢病毒混合(各1×1011拷貝)。注射后0、4、8周小鼠面靜脈叢取血樣檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(SPSS，美國(guó))，據(jù)數(shù)據(jù)特征采用t檢驗(yàn)；P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1多位點(diǎn)CRISPR/Cas9切割顯著提高抗HBV效率我們首先初步評(píng)估了CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)HBV蛋白表達(dá)抑制效應(yīng)?；贖epG2細(xì)胞的LentiCRISPR和pUC18-HBV1.2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：?jiǎn)挝稽c(diǎn)的LentiCRISPR轉(zhuǎn)染抑制了約10%～50%的病毒蛋白HBsAg和HBeAg的產(chǎn)生，但是多位點(diǎn)共轉(zhuǎn)染顯著提高了其抑制效應(yīng)，尤其3個(gè)位點(diǎn)共轉(zhuǎn)染組，其抑制效率可達(dá)到90%以上。

圖2　HepG2細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pUC18-HBV1.2和LentiCRISPR-gRNAs質(zhì)粒后培養(yǎng)上清中HBsAg檢測(cè)。轉(zhuǎn)染后第3天檢測(cè)(n=3)。橫坐標(biāo)數(shù)字代表LentiCRISPR-gRNAs靶向的HBV基因組位置Fig.2　Detection of supernatant HBsAg in HepG2 cells co-transfected with plasmids pUC18-HBV1.2 and LentiCRISPR-gRNAs. Samples were collected on day 3 post transfection (n=3). The number in x-axis indicates the sites of HBV genome targeted by LentiCRISPR-gRNAs

圖4　CRISPR/Cas9慢病毒處理HBV復(fù)制小鼠后血清中病毒蛋白檢測(cè).圖A示C57BL/6小鼠在注射AAV-HBV1.3后可建立穩(wěn)定的蛋白表達(dá)。圖B示該小鼠模型建立后第4周為起點(diǎn)注射CRISPR/Cas9慢病毒(nt2004+nt2144+nt2414)后血清中HBsAg和HBeAg的變化Fig.4　Detection of serum HBV proteins in mice with HBV replication. C57BL/6 mice were injected with AAV-HBV1.3 virus to persistently yield viral proteins (A). The AAV-HBV1.3 mice (on weeks 4) were treated with CRISPR/Cas9 Lentivirus mixture(nt2004+nt2144+nt2414) detected for HBsAg and HBeAg

2.2CRISPR/Cas9對(duì)細(xì)胞核內(nèi)HBVcccDNA切割效率高于染色體 為評(píng)估CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞核內(nèi)cccDNA的切割效應(yīng)，我們應(yīng)用了HepDES19細(xì)胞模型，該細(xì)胞系由于缺少包膜蛋白HBs，病毒核心顆粒無(wú)法分泌而使HBVcccDNA在細(xì)胞核內(nèi)富集；此外，由于對(duì)插入HBV基因組的第一個(gè)“e”抗原起始密碼子進(jìn)行了突變，HBeAg只能由成環(huán)后的HBVcccDNA基因組的“e”抗原起始密碼止開(kāi)始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。因此檢測(cè)HBeAg水平可反應(yīng)cccDNA水平和功能狀況[10]。在HepG2.2.15細(xì)胞中，病毒蛋白的產(chǎn)生則主要來(lái)源于整合形式的HBV基因組。CRISPR/Cas9慢病毒處理HepG2.2.15細(xì)胞結(jié)果顯示，單靶點(diǎn)切割僅約抑制了10%～30%的HBeAg水平，但對(duì)HepDES19的抑制可達(dá)50%～60%。顯示相比于整合形式的HBV基因組，CRISPR/Cas9對(duì)cccDNA的抑制更高。

2.3CRISPR/Cas9可清除小鼠內(nèi)HBV病毒蛋白表達(dá)注射AAV-HBV1.3的C57BL/6小鼠至第4周體內(nèi)病毒蛋白表達(dá)穩(wěn)定水平后，我們通過(guò)尾靜脈注射CRISPR/Cas9慢病毒，結(jié)果顯示注射后一周病毒蛋白水平可顯著下降，一個(gè)月后可低至檢測(cè)水平下限。但跟蹤至兩個(gè)月，未見(jiàn)HBsAb和HBeAb抗體的產(chǎn)生。

3討論

雖然乙肝肝炎疫苗可有效的預(yù)防HBV感染，但目前對(duì)慢性HBV感染仍缺乏有效的治療方案。只有約1/3的感染者對(duì)干擾素及核苷類(lèi)似物有長(zhǎng)期的病毒學(xué)應(yīng)答，而HBV基因組在細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期存在是抗病毒治療的主要難點(diǎn)。在本研究中我們嘗試用新近發(fā)展的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)靶向HBV基因組進(jìn)行切割。特別是應(yīng)用了富集HBVcccDNA的HepDES19細(xì)胞系，證實(shí)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可通過(guò)基因編輯有效抑制cccDNA的功能和水平。

我們選擇了HBV的C基因區(qū)作為CRISPR/Cas9的靶向切割位點(diǎn)，該區(qū)轉(zhuǎn)錄HBV的前基因組及核蛋白及e抗原。從切割效率來(lái)看，CRISPR/Cas9對(duì)質(zhì)粒和HBVcccDNA的抑制效果較好，而對(duì)染色體DNA稍差，這可能是由于細(xì)胞核染色體外的游離DNA可能更容易sgRNA捕獲所致。三個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)切割可極大提高抑制效率，這與既往的類(lèi)似研究一致[11-14]。有意思的是，雖然我們切割的靶向位點(diǎn)為C基因區(qū)，但HBsAg表達(dá)也可同樣受到抑制。這可能是因?yàn)榇藚^(qū)域所起始轉(zhuǎn)錄的3.5kb的RNA除了作為核心抗原及HBeAg的翻譯模板，同時(shí)也是HBV前基因組RNA和聚合酶的翻譯模板，這顯然直接影響了HBV的復(fù)制和新cccDNA的形成，進(jìn)而對(duì)所有病毒蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。

本研究采用了8型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HBV到C57BL/6小鼠是近年發(fā)展的慢性HBV復(fù)制模型。相比于水動(dòng)力高壓注射HBVDNA質(zhì)粒模型或HBV轉(zhuǎn)基因模型，其對(duì)小鼠損傷小，基因組不整合，且表達(dá)病毒蛋白水平高；但目前多認(rèn)為在小鼠中cccDNA并不能被檢測(cè)到，HBV復(fù)制可能來(lái)源于所輸入的病毒基因組[15,16]。在本研究中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也能有效的抑制病毒復(fù)制及蛋白表達(dá)，很顯然sgRNA不能區(qū)分HBV或腺相關(guān)病毒的基因組。但有意思的是雖然病毒抗原在處理后一個(gè)月左右即可低于檢測(cè)水平，但持續(xù)跟蹤了兩個(gè)月，小鼠體內(nèi)并未檢測(cè)到針對(duì)抗體。這與既往結(jié)果一致[17]。提示可能C57BL/6小鼠對(duì)HBV有天然免疫耐受，這也可能也是該小鼠模型能容許AAV導(dǎo)入的HBV建立持續(xù)HBV復(fù)制的原因?？傊?，隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展，直接靶向清除細(xì)胞內(nèi)的HBV基因組逐漸走向可能，CRISPR/Cas9技術(shù)顯示了其在直接清除細(xì)胞內(nèi)HBV基因組的巨大潛力。發(fā)展肝臟特異靶向和高效的CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)遞系統(tǒng)，以及對(duì)脫靶效應(yīng)的評(píng)估，是該技術(shù)走向應(yīng)用的前提。

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通信作者：潘孝本， Email: panxiaoben@pkuph.edu.cn

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.014

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81370540)

(收稿日期：2015-10-17)

CleavageofintracellularhepatitisBvirusgenomebyusingofCRISPR/Cas9

Lu Yuqin, Han Jinchao, Cong Xu,Wei Lai, Pan Xiaoben

Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases; Beijing100044,China Corresponding author: PanXiaoben,Email: panxiaoben@pkuph.edu.cn

【Abstract】ObjectiveTo specifically cleave the intracellular HBV DNA using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9 genome editing technology. MethodsUsing of Lenti CRISPRv2 system, we designed 3 highly conserved guide RNAs (gRNAs) to specifically cleave HBV genome. The cleavage efficacy of CRISPR/Cas9 targeting at HBV DNA in plasmids, the episomal HBV DNA or integrated HBV DNA in chromosome was evaluated in the cell cultures of HepG2.2.15 and HepDES19, and in a model of C57BL/6 mouse infected with AAV-HBV1.3. ResultsViral proteins were inhibited by 30%-50% by a single site CRISPR/Cas9 cleavagein the HepG2 cells transiently co-transfected with HBV DNA, multiple sites of cleavage significantly elevated the efficiency to 70%-90%. Compared with that of HepG2.2.15 cells, HBeAg in HepDES19 cells was inhibitedby at least three-fold higher. ConclusionMultiple sites cleavage significantly improve the efficacy of CRISPR/Cas9 systems,and this system is more efficient to cleave the extra-chromosome HBV DNA than the integrated HBV DNA in chromosomes.

【Key words】Hepatitis B; cccDNA; CRISP/Cas9;Genes; Antivirus