林海祥　徐葛林　吳杰　張守峰　扈榮良　李烈濤　劉芳　張師瑞　張譯

102600, 北京依生興業(yè)科技有限公司(林海祥、李烈濤、劉芳、張師瑞、張譯)；430207,武漢生物制品研究所(徐葛林、吳杰)；長春 130117，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所(張守峰、扈榮良)

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皮卡佐劑狂犬病治療性疫苗對暴露后實驗動物和人體免疫記憶的效果

林海祥徐葛林吳杰張守峰扈榮良李烈濤劉芳張師瑞張譯

102600, 北京依生興業(yè)科技有限公司(林海祥、李烈濤、劉芳、張師瑞、張譯)；430207,武漢生物制品研究所(徐葛林、吳杰)；長春 130117，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所(張守峰、扈榮良)

【摘要】目的檢測皮卡佐劑狂犬病疫苗對暴露后實驗動物免疫治療作用和對人的免疫記憶效果。方法模仿人體暴露后免疫，對小白鼠和Beagle犬進行了先感染狂犬病毒野毒株病毒再用不同狂犬病滅活疫苗免疫，觀察保護效果；對犬咬傷志愿者用皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫2.5年后分離外周血單個核細胞，用流式細胞儀檢測干擾素免疫記憶細胞數(shù)量。結(jié)果在法國巴斯德研究所、武漢生物制品研究所、軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所三次獨立實驗結(jié)果均顯示在沒有聯(lián)合應用抗狂犬病免疫球蛋白的情況下，國內(nèi)外市售人用狂犬病疫苗保護率為0%～30%，皮卡佐劑狂犬病疫苗保護率為70%～100%，統(tǒng)計學分析有極其顯著的差異。暴露后志愿者用皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫，2.5年后外周血單個核細胞仍能檢出顯著高的分泌IFN-γ細胞數(shù)量，顯示對人體免疫特別是細胞免疫記憶反應良好。結(jié)論與市售狂犬病疫苗相比，皮卡佐劑狂犬病疫苗對暴露后實驗動物具有顯著地 治療作用，在人體中用也具有良好的免疫記憶效果。

【主題詞】皮卡佐劑；狂犬病疫苗；免疫記憶；暴露后免疫

Fundprograms:MajorNewDrugDiscoveryProject(PICKCaRabiesVaccineforHumanUse: 2013ZⅩ09102034 )

皮卡佐劑是多種膜式識別受體(PRR)的配體，包括TLR3(Toll樣受體3)、NOD(細胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡核苷酸域)蛋白家族、RIG-Ⅰ(RNA螺旋酶視黃酸誘導基因Ⅰ)、MDA5(黑色瘤分化相關基因5)依賴dsRNA蛋白激酶等。皮卡佐劑疫苗與受體結(jié)合后活化非特異免疫，包括巨噬細胞吞噬功能，促進干擾素、白細胞介素-2、-6、-12、腫瘤壞死因子等細胞因子的產(chǎn)生，促進產(chǎn)生共刺激因子CD40、CD80、CD86，促進抗原呈遞細胞的提呈，活化T淋巴細胞，促進特異性的細胞免疫和體液免疫應答，促進免疫細胞的增殖。皮卡佐劑不僅提高疫苗的免疫原性，更由于促進干擾素、白細胞介素-2、-12的產(chǎn)生，使從主要產(chǎn)生體液免疫的預防性疫苗轉(zhuǎn)變成具有強烈細胞免疫的治療性疫苗[1-7]。本文是在上述研究基礎上模仿人體暴露后免疫對試驗動物先外周皮下或肌肉感染狂犬病毒街毒，再用皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫并與國內(nèi)外市售狂犬病疫苗從機體水平比較保護率。除此之外，我們還對狗咬傷志愿者接種皮卡佐劑狂犬病疫苗，2.5年后的外周血單個核細胞，用流式細胞儀檢測分泌IFN-γ的細胞數(shù)量。這些試驗都取得了明確的顯著的陽性結(jié)果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：OF1小白鼠，4周齡。由法國巴斯德研究所提供。昆明種小白鼠：14～16g，清潔級，由武漢生物制品研究所實驗動物中心提供。Beagle犬：40只，購自北京瑪斯生物技術有限公司。由軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所按篩選無狂犬病免疫史，狂犬病中和抗體檢測陰性犬，試驗前完成犬瘟熱和細小病毒疫苗免疫。

1.1.2外周血單個核細胞：2002年本公司員工白XX、屈XX被犬咬傷后，主動要求自愿用人用皮卡狂犬病純化疫苗(中檢所檢驗合格后的人用皮卡狂犬病純化疫苗，由北京泛華協(xié)和醫(yī)藥生物技術股份有限公司生產(chǎn))全程五針免疫，2.5年后取外周血分離單個核細胞；另有健康者(2人)外周血分離單個核細胞比較，由中山醫(yī)科大學檢測。

1.1.3狂犬病毒野毒株：WRVS9147(RD9147)株：法國巴斯德研究所提供。從瘋狐貍中分離，經(jīng)成神經(jīng)瘤細胞傳代，檢測其核蛋白基因的核苷酸順序與原分離時相同，表明WRVS株的性質(zhì)并沒有因在細胞中傳代而改變。攻毒劑量為腦內(nèi)5×106LD50/只小鼠。CQ92株(批號20050207)武漢生物制品研究所基因工程室提供。該毒株1992年分離于重慶犬，后經(jīng)該室在小鼠腦中傳代制備，作為攻擊用毒株。通過基因序列分析，表明該毒株為我國狂犬病毒流行株，且屬于血清Ⅰ型。本試驗病毒腦內(nèi)滴定為12589/0.03mlLD50，腹股溝皮下毒力為3.3/o.1mlLD50。BD06株：軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所提供。2006年分離自河北保定的犬源街毒，經(jīng)全基因組序列測定為我國狂犬病流行株，為基因Ⅰ型。經(jīng)小鼠腦內(nèi)傳代5代以內(nèi)用于攻毒試驗，攻毒劑量為腦內(nèi)16萬LD50(小鼠腦內(nèi))。

1.1.4用于小白鼠試驗的狂犬病疫苗：滅活純化狂犬病疫苗(InactivatedandPurifiedRabiesVirus：IPRV)，法國巴斯德研究所提供。用PV狂犬病毒株經(jīng)BHK-21細胞傳代，病毒收獲后經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活和純化后的實驗用疫苗。皮卡IPRV：將皮卡佐劑與不同濃度的IPRV復合。市售法國維爾博狂犬病疫苗(批號X0081-1，生產(chǎn)日期20030123，有效期200512)。市售福爾博人用狂犬病純化疫苗福爾博(簡稱國產(chǎn)苗)(批號2004110810，生產(chǎn)日期20041202，效期200512)。人用皮卡狂犬病純化疫苗由北京泛華協(xié)和醫(yī)藥生物技術股份有限公司提供。

用于犬試驗的人用皮卡狂犬病疫苗由遼寧依生生物制藥有限公司提供；市售諾華人用狂犬病疫苗由軍事醫(yī)學學科學院軍事獸醫(yī)研究所直接聯(lián)系長春市疾病預防控制中心購買。

用于人免疫記憶試驗的狂犬病純化疫苗抗原由大連高新生物制藥有限公司提供；皮卡佐劑和皮卡狂犬病疫苗由北京泛華協(xié)和醫(yī)藥生物技術股份有限公司及遼寧依生生物制藥有限公司提供。

1.2方法

1.2.1第一項試驗：在法國巴斯德研究所完成(1992年)。取OF1小鼠，每組小鼠先用野毒W(wǎng)RVS9147腹股溝皮下感染小白鼠，0.1ml/只，攻毒劑量為腦內(nèi)5×106LD50/只小鼠(確保80%以上小白鼠致死的攻擊病毒量)，于感染后0d、3d、7d、10d和14d在相同部位分別注射不同抗原量(140ng和 560ng)的疫苗(狂犬病純化疫苗、皮卡佐劑狂苗及鋁佐劑狂苗)0.1ml/只，同時設PBS、皮卡佐劑、鋁佐劑對照組。連續(xù)28d觀察記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.2第二項試驗：在武漢生物制品研究所完成(2005年)。取清潔級昆明小鼠80只，分為4組，每組20只。用街毒株CQ92(批號20050207)腹股溝皮下感染小白鼠，本試驗病毒腦內(nèi)滴定為12589/0.03mlLD50，腹股溝皮下毒力為3.3/o.1mlLD50。感染后0d、3d、6d、9d，分別用皮卡狂苗、福爾博狂苗、維爾博狂苗同部位免疫0.06ml/只，病毒對照組注射PBS。連續(xù)21d觀察記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，并用統(tǒng)計學方法統(tǒng)計實驗結(jié)果。

1.2.3第三項試驗：軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所(2013年)?？袢≈泻涂贵w陰性的Beagle犬30只，均分為三組，每組10只。試驗前右側(cè)腮部剃毛，以顯露皮膚及咬肌輪廓。16萬icLD50狂犬病病毒(1ml)注射于Beagle犬右側(cè)腮部肌肉；攻毒后2h、3d、7d、14d、21d后于注射部位分別注射PBS、人用諾華狂犬病疫苗、皮卡狂犬病疫苗。

上述各組動物觀察45d，3d內(nèi)死亡為非特異性死亡，第4天以后逐天記錄各組狗發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)，發(fā)病和死亡時間，第45天記錄各組狗總死亡數(shù)和存活數(shù)。試驗前后測量狗的體重。對死亡和存活動物進行腦組織狂犬病免疫熒光檢測，確定是否感染狂犬病毒。

1.2.4第四項試驗：在北京泛華協(xié)和醫(yī)藥生物技術股份有限公司，志愿者用皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫，取用皮卡狂犬病純化疫苗免疫2.5年后志愿者和未經(jīng)皮卡狂犬病疫苗健康者外周血分離單個核細胞(PBMCs)。分別用1.45和14.5μɡ狂犬病純化疫苗抗原刺激24h，以流式細胞儀檢測分泌IFN-γ的細胞數(shù)量.。

2結(jié)果

2.1第一項試驗如表1所示，在病毒對照小白鼠95%死亡下，單純IPRV保護率很差，死亡率達70%～95%；單純皮卡佐劑就使死亡率降至30%，隨著IPRV與皮卡復合的IPRV量的增加死亡率可降至0；IPRV加鋁佐劑沒有任何效果。

2.2第二項試驗兩次皮卡狂犬病疫苗和不同市售狂犬病疫苗對暴露后小白鼠的保護率的比較結(jié)果見表2。統(tǒng)計學測定表明皮卡狂犬病疫苗和不同市售狂犬病疫苗比較具有極其顯著的治療效果(P<0.01-0.001)。

2.3第三項試驗在病毒對照組犬100%死亡情況下，皮卡狂犬病滅活疫苗產(chǎn)生70%保護作用，經(jīng)統(tǒng)計學測定，與病毒對照組比較具有極其顯著差異，而諾華制藥的狂犬病疫苗僅提供30%的保護作用，與病毒對照組比較差異不顯著(表3)。

表1　皮卡和鋁佐劑對感染狂犬病毒野毒株WRVS 9147小白鼠的治療效果

* 死亡小鼠數(shù)/注射小鼠數(shù)

Numbersdiedmice/Numbersinjectedmice

表2　不同疫苗對暴露狂犬病街毒后小白鼠的保護試驗

x2皮卡苗與PBS對照=14.44P<0.001 x2皮卡苗與法國維爾博苗=16.9P<0.001 x2皮卡苗與國產(chǎn)狂犬病鋁苗=10.23P<0.01

Note:Numbersdiedmice/Numbersinjectedmiceandthenumbersweremeansofmicein2experiments,PICKCavaccinevscontrolFrendvaccine,ChineseFurbovaccine

2.4第四項試驗皮卡狂犬病疫苗免疫志愿者2.5年后用流式細胞儀檢測分泌IFN-γ的細胞數(shù)量。與未注射狂犬病疫苗正常人比較經(jīng)相應抗原刺激后分泌IFN-γ細胞數(shù)顯著增加。表明皮卡狂犬病疫苗對人體也有很好的免疫反應(圖1)。

3討論

3.1關于NIH狂犬病疫苗效力測定方法當前通用的狂犬病疫苗效力測定方法是1953年由美國國立衛(wèi)生研究所(NIH)建立的，該方法以不同稀釋度疫苗0、7d腹腔免疫小白鼠兩次，第14天用5～50腦內(nèi)LD50CVS病毒腦內(nèi)攻擊，再觀察14d，以死亡率與疫苗參考品比較，≥2.5IU/每劑為合格。該方法存在明顯不合理處：(1)攻擊病毒CVS是腦內(nèi)固定毒，不是流行區(qū)的野毒或街毒。(2)腦內(nèi)攻擊途徑非自然感染途徑(3)更重要的是NIH狂犬病疫苗效力測定方法是暴露前免疫，而人是暴露后免疫，這是兩種性質(zhì)完全不同的免疫，這是預防性疫苗檢測方法，不適合用于暴露后免疫。當前批簽發(fā)檢定合格的疫苗不是一定有效的疫苗[8]。

表3　皮卡苗和諾華狂犬病純化疫苗對暴露狂犬病街毒后的比格犬保護效果

圖1　皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫志愿者2.5年查外周血單個核細胞產(chǎn)生IFN-γ SPF數(shù)量Fig.1　IFN-γSPF in PBMCs of volunteers immunized with rabies vaccine using PICKCa adjvant

3.2關于WHO和國家藥典對暴露后狂犬病防治方案正是由于當前通用狂犬病疫苗效力測定方法不合理以及大量狂犬病疫苗免疫失敗病例，WHO和國家藥典[9]都明確規(guī)定對3度咬傷即被咬出血患者除清洗傷口外應聯(lián)合應用抗狂犬病毒免疫球蛋白和疫苗，而不能僅注射疫苗。然而由于馬抗狂犬病免疫球蛋白過敏反應嚴重，人抗狂犬病免疫球蛋白價格昂貴，供不應求，只有7%～10%的患者使用抗狂犬病免疫球蛋白[10]，至今使我國每年仍有上千狂犬病死亡病例！

3.3關于皮卡狂犬病疫苗的意義我們經(jīng)過30年的研究積累了大量試驗資料，明確了皮卡佐劑及其疫苗作用機理，皮卡狂犬病疫苗不僅促進體液免疫也能誘發(fā)強烈的細胞免疫而具有治療作用。對小白鼠和狗先行皮下或肌肉感染狂犬病野毒株病毒，再用狂犬病疫苗免疫治療結(jié)果是法國維爾博狂犬病疫苗和國產(chǎn)鋁佐劑狂犬病純化疫苗對暴露后小白鼠的保護率為0，人用皮卡狂犬病純化疫苗的保護率為75%。表明皮卡狂犬病純化疫苗能顯著地降低感染狂犬病野毒株小白鼠死亡率，明顯地優(yōu)于法國維爾博狂犬病疫苗和國產(chǎn)鋁佐劑狂犬病純化疫苗(P<0.001)，特別應引起注意的是在人體檢測中皮卡狂犬病純化疫苗也有良好的免疫記憶反應，使分泌IFN-γ細胞數(shù)顯著增多。同時，皮卡狂犬病疫苗也是安全的[11]，用于暴露后3度咬傷患者較現(xiàn)行國內(nèi)外無佐劑狂犬病疫苗有著根本的優(yōu)越性。

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通信作者：林海祥，Email: haixianglin510@sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.010

基金項目：重大新藥創(chuàng)制項目(人用皮卡狂犬病疫苗：2013ZⅩ09102034)

(收稿日期：2016-01-08)

TheeffectstreatedwithPICKCarabiesvaccinetomiceandbeagledogsinfectedrabieswildvirusesandvolunteersimmunizedwithPICKCarabiesvaccine

Lin Haixiang，Xu Gelin，Wu Jie，Zhang Shoufeng，Hu Rongliang，Li Lietao，Liu Fang，Zhang Shirui，Zhang Yi

Beijing Yisheng Xingye Bio-tech Co.,Ltd, Beijing 102600,China(Lin HX, Li LT,Liu F,Zhang SR, Zhang Y); Wuhan Institute of biological products, Wuhan 430207China(Xu GL, Wu J); Institute of Military Veterinary, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130117, China(Zhang SF, Hu RL).Corresponding author:Lin Haixiang, Email:haixianglin510@sina.com

【Abstract】ObjectiveTo test the immune therapeutic effects of PICKCa adjuvant rabies vaccine for the post-exposure mice and beagle dogs and immune memory effect for human. MethodsFor the mice and beagle dogs first to infect with rabies wild virus and then immunize with PICKCa rabies vaccine.For volunteers, first to immunize with PICKCa rabies vaccine after 2.5 years to take peripheral blood mononuclear cell and then to check cells secreted interferon-? with flow cytometry. ResultsIn 3 independent assays of post-explosure immunization of mice and beagle dogs PICKCa rabies vaccine were much better then commercial adjuvant-free rabies vaccines, the protective rate from 20%-30% to 70%-100% Also, in the assay of cells secreted IFN-γ by peripheral blood mononuclear cells from volunteers immunized by PICKCa rabies vaccine the IFN-γ cell levels were much higher than control. ConclusionsCompared with commercial adjuvant-free rabies vaccines the PICKCa rabies vaccine had significant immune therapeutic effects in the mice and dogs. Also PICKCa rabies vaccine had good immune memory effect in human.

【Key words】PICKCa adjuvant; Rabies vaccines; Immune memory; Post exposure immunity