董婕　董麗波　張燁　薄洪　黃維娟　王大燕　舒躍龍

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家流感中心，衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

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青海湖周邊家禽相關(guān)環(huán)境標(biāo)本中H5N1亞型禽流感病毒特征分析

董婕董麗波張燁薄洪黃維娟王大燕舒躍龍

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家流感中心，衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

【摘要】目的了解我國青海湖周邊家禽中分離到的高致病性H5N1亞型禽流感病毒的抗原性和基因特性。 方法將青海湖周邊野鳥和家禽的環(huán)境標(biāo)本采集處理后，接種SPF雞胚分離病毒，將紅細(xì)胞凝集陽性的標(biāo)本通過real-time RT-PCR進(jìn)行型別鑒定和亞型分析。將H5N1檢測陽性的標(biāo)本選取部分進(jìn)行二代序列分析和抗原性分析。 結(jié)果2013年1-9月間采集的家禽相關(guān)環(huán)境標(biāo)本中共分離到19株高致病性H5N1亞型禽流感病毒，集中在1-3月。對7株病毒進(jìn)行了全基因組序列分析和抗原性分析顯示，血凝素基因進(jìn)化樹顯示其中除A/Environment/Qinghai/XN02032/2013屬于clade7.2 分支病毒以外，其余6株屬于clade2.3.2.1c分支。神經(jīng)氨酸酶基因也顯示該毒株與其他6株分屬于兩個不同的分支；抗原分析顯示該毒株與所有參考血清低反應(yīng)，另外6株病毒是A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010的類似株。 結(jié)論青海湖周邊地區(qū)在2013年1-3月環(huán)境相關(guān)標(biāo)本中檢測到高致病性H5N1亞型禽流感病毒，屬于clade2.3.2.1和clade7.2 分支病毒。這種高致病性H5N1亞型禽流感病毒多個分支共同流行的趨勢提示加強(qiáng)這一地區(qū)野鳥和家禽相關(guān)環(huán)境病原體監(jiān)測的重要性。

【主題詞】高致病性禽流感；H5N1亞型；進(jìn)化分析；抗原分析

Fund programs: National Basis Research Program(973) of China "Replication mechanisms of important influenza viruses in different hosts"(2011CB504704)

高致病性H5N1亞型禽流感病毒中以A/Goose/Guangdong/1/96為進(jìn)化起源的一系列病毒在2003年再發(fā)以來，在全球多個國家感染野鳥、引起禽類的暴發(fā)，并且偶有人類發(fā)病。由于這類病毒血凝素(HA)基因進(jìn)化多樣性突出，世界衛(wèi)生組織(WHO)、世界糧農(nóng)組織、世界動物衛(wèi)生組織聯(lián)合工作委員會統(tǒng)一將高致病性H5N1亞型禽流感病毒的進(jìn)化分支進(jìn)行命名，目前共有10個分支(clade 0-9)[1]，其中clade 0、1、2和7感染過人。截止到2015年11月13日，全球共確診884個病例涉及16個國家，其中449例死亡(病死率51%)[2]。

在我國青海湖地區(qū)，2005年4月末到6月發(fā)生大規(guī)模的野鳥死亡，大約有10 000只。疫情是由野鳥感染高致病性禽流感H5N1亞型病毒引起。該病毒屬于clade 2.2[3]. 這類病毒于2006—2009年間陸續(xù)在蒙古、俄羅斯、德國、埃及、尼日利亞被發(fā)現(xiàn)并且導(dǎo)致野鳥的死亡。盡管這類病毒分布較廣，但是在中國鮮有在家禽中感染造成疫情暴發(fā)的報道。

隨后2009年5、6月間和2010年在青海湖地區(qū)又發(fā)現(xiàn)野鳥死亡，這次是由于高致病性H5N1的clade 2.3.2病毒感染引起。這次引起暴發(fā)的病毒在基因進(jìn)化上與中國香港和日本野鳥中分離的病毒同源性高，但是缺乏直接證據(jù)說明病毒是由野鳥經(jīng)東亞遷徙途徑來到青海湖[4]。

我國高致病性禽流感H5N1病毒在動物間存在著clade 2.3.2、clade 2.3.4和clade 7.2三個優(yōu)勢分支病毒。青海湖地區(qū)野鳥中H5亞型病毒分布和家禽的感染狀況是我們關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。本實(shí)驗(yàn)室在2013在青海湖核心區(qū)和鄰近的地區(qū)開展了全年環(huán)境監(jiān)測，希望了解這一地區(qū)的禽流感H5N1病毒分布及病原學(xué)特征。

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集和處理標(biāo)本采集于2013年1-9月間，標(biāo)本采集場所除青海湖核心區(qū)域外，還包括了西寧市、海晏縣、樂都縣部分活禽市場、養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶[9]。標(biāo)本類型包括禽類糞便，被禽類及其糞便沾染的水和環(huán)境物體表面。標(biāo)本采集液配方參考WHO發(fā)布的《WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance 2006》[5]，采樣前1～2 d配制采樣液冷鏈運(yùn)輸?shù)浆F(xiàn)場，用無菌拭子挑取5 g左右的新鮮的糞便或者10 ml水樣加到采樣管里低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。將環(huán)境樣本離心(3 000 rpm，15 min)，取上清分裝保存，并且編號記錄?；畈《静僮骰顒泳贐SL-3實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 病毒的雞胚分離將處理好的標(biāo)本，接種9～10日齡SPF雞胚，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。冷胚后收獲雞胚尿囊液。血凝實(shí)驗(yàn)測定病毒的滴度。雞胚接種方法及血凝實(shí)驗(yàn)方法參見上述WHO發(fā)布的手冊。

1.3核酸檢測將病毒分離血凝陽性的分離物用TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測，引物和探針為WHO公布的針對甲型流感病毒M基因的通用引物和探針。將Ct值≤30的定義為陽性，對于甲型流感陽性的分離物，用real time RT-PCR方法進(jìn)行H5以及N1，N2亞型鑒定。

1.4二代測序技術(shù)進(jìn)行序列測定利用Ion TorrentTM測序平臺進(jìn)行序列測定。提取病毒基因組RNA，以U12反轉(zhuǎn)錄引物生成單鏈cDNA，酶切作用使單鏈cDNA片段化，然后經(jīng)末端修復(fù)和與特異性接頭連接，變性處理后形成單鏈DNA，經(jīng)過油包水過程實(shí)現(xiàn)每個片段在自己的微環(huán)境內(nèi)PCR擴(kuò)增。純化后文庫定量，然后按照Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit(Cat. No. 4480974)說明書將定量的文庫加入，上機(jī)測序。

1.5進(jìn)化分析用MEGA 5.0軟件的Clustal W方法進(jìn)行序列的比對，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行種系進(jìn)化分析，選擇1000次重復(fù)抽樣檢測。

1.6抗原性分析通過紅細(xì)胞凝集抑制(Hemagg-lutination Inhibition, HI)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行流感病毒的抗原性分析[5]。當(dāng)待檢病毒與參考雪貂抗血清的HI效價低于參考病毒與參考抗血清自身HI效價的8倍(含8倍)或以上時，則認(rèn)為待檢病毒是該參考抗血清檢測到的低反應(yīng)株；反之，當(dāng)相差8倍以內(nèi)時(不含8倍)，則認(rèn)為待檢病毒是參考病毒的類似株。所用標(biāo)準(zhǔn)毒株及其雪貂抗血清是針對中國大陸曾經(jīng)流行的高致病性禽流感H5N1病毒如clade 2,clade 7分支病毒。具體包括：A/Chicken/Viet Nam/NCVD-016/2008(clade 7.1)，A/Turkey/Turkey/1/2005(clade 2.2.1)，A/Bar-nswallow/HongKong/D10-1161/2010(clade 2.3.2.1b)， A/Common magpie/Hong Kong/5052/2007 (clade 2.3.2.1)，A/Hubei/1/2010(clade 2.3.2.1a)，A/Guangxi/1/2009(clade 2.3.2.1b)，A/Guizhou/1/2013 (clade 2.3.4)，A/Guangdong/99170/2014 (clade 2.3.4)。

2結(jié)果

2.1高致病性H5N1亞型禽流感病毒分離情況2013年1-9月共采集野鳥和家禽相關(guān)環(huán)境標(biāo)本6 364份，共分離到19株H5N1禽流感病毒，全部來源于家禽相關(guān)環(huán)境，病毒從2013年1-3月間的標(biāo)本中分離得到，地域分布在西寧活禽市場、樂都活禽市場以及海晏縣家禽養(yǎng)殖戶。按時間和地域代表性選取其中的7株病毒進(jìn)行了抗原性分析和二代測序。

表1　青海湖周邊家禽相關(guān)環(huán)境標(biāo)本分離的H5N1病毒抗原性分析

2.2高致病性H5N1亞型禽流感病毒抗原性分析利用陽性參考血清，對分離的毒株進(jìn)行抗原性分析。結(jié)果顯示，7株高致病性H5N1亞型禽流感病毒除A/Environment/Qinghai/XN02032/2013以外的6株病毒均與clade 2.3.2.1病毒的抗血清有反應(yīng)，是2.3.2.1分支中A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010的類似株，不過與2.3.2.1分支中的其他陽性參考血清幾乎均呈低反應(yīng)。A/Environment/Qinghai/XN02032/2013病毒與所有參考血清都沒有交叉反應(yīng)，通過隨后的基因序列分析提示其屬于clade 7.2(見2.3部分)。

2.3高致病性H5N1亞型禽流感病毒HA基因進(jìn)化樹分析選取GenBank公共數(shù)據(jù)庫內(nèi)H5N1亞型clade 2.3.2.1、clade 2.3.4、clade 7.1和clade 7.2的HA序列43條與本研究分離毒株的序列共同構(gòu)建進(jìn)化樹。進(jìn)化樹中標(biāo)注黑色三角符號的病毒也用于抗原分析。HA基因進(jìn)化劃分10個分支(clade 0-9),分支下面有亞支，用四個層級的數(shù)字和字母組合。如clade 2.3.2.1之下分為clade 2.3.2.1a,b,c。本研究中的6個病毒(藍(lán)色斜體西文)屬于clade 2.3.2.1c亞支，與2009年青海湖地區(qū)野鳥中分離的病毒屬于同一進(jìn)化分支，同時與來自中國香港、日本、韓國、越南、保加利亞和蒙古國的病毒在同一分支上。而A/Environment/Qinghai/XN02032/2013(圖中以綠色斜體西文表示)在進(jìn)化上屬于clade 7.2分支。近期我國2009年廣西和2010年湖北人感染病例分離的H5N1病毒分屬于clade 2.3.2.1b和clade 2.3.2.1a，本研究分離的毒株與其均不在同一分支。

黑色三角型為世界衛(wèi)生組織推薦的疫苗候選株圖1　高致病性H5N1亞型禽流感病毒血凝素基因進(jìn)化分析Black triangles represent candidate influenza vaccine viruses recommended by WHO Fig.1　Phylogenic analysis of HA gene of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses

2.4高致病性H5N1亞型禽流感病毒NA基因進(jìn)化樹分析選取GenBank內(nèi)HA基因分屬于clade 2.3.2.1、clade 2.3.4、clade 7.1和clade 7.2毒株的神經(jīng)氨酸酶(NA)基因序列40條與7條分離毒株的序列進(jìn)行比較。NA基因進(jìn)化沒有像HA基因進(jìn)化那樣劃分10個分支(clade 0-9)，這種針對HA基因進(jìn)化的分類方式不適用于NA基因。在NA基因進(jìn)化上本研究中的7個毒株也明顯地分成兩個分支，其中6個毒株和clade 2.3.2.1病毒在一起。而A/Environment/Qinghai/XN02032/2013與clade 7.2病毒在一起。

圖2　高致病性H5N1亞型禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因進(jìn)化分析Fig.2　Phylogenic analysis of NA gene of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses

3討論

2005年以來在中國大陸能夠感染人的高致病性H5N1亞型禽流感病毒包括clade 2.3.4, clade 2.3.2和clade 7病毒株。2005年青海湖地區(qū)野鳥感染并引起大量死亡的病毒是clade 2.2 分支的病毒，這類病毒在中國大陸沒有造成人感染，但是它卻傳到了亞洲、歐洲、非洲等國家并且進(jìn)一步進(jìn)化。目前在西亞的以色列，約旦河西岸、加沙地帶的禽類中流行，引起埃及人間的感染[5]。本研究在青海湖周邊野鳥及家禽環(huán)境相關(guān)標(biāo)本中仍然未發(fā)現(xiàn)此分支病毒。

禽流感監(jiān)測通常通過病毒的抗原性和基因特性分析來了解病毒的進(jìn)化和變異情況。而病毒的抗原性分析有賴于參考病毒和參考血清。高致病性禽流感H5N1進(jìn)化復(fù)雜，多個分支病毒出現(xiàn)，使病毒的抗原性發(fā)生變化。及時更新參考毒株和參考血清對病毒病原學(xué)監(jiān)測意義重大。本研究中，6株病毒與2.3.2.1分支中A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010有最高的血凝抑制效價，提示是clade 2.3.2.1類似株。但是由于沒有特異的抗clade 2.3.2.1c血清因此無法進(jìn)一步細(xì)分。而A/Environment/Qinghai/XN02032/2013病毒與所有參考血清都沒有交叉反應(yīng)，無提示作用，只能依賴基因序列分析的結(jié)果。

近年來，高致病性禽流感H5病毒在中國的流行呈現(xiàn)三個優(yōu)勢毒株分支，分別為clade 2.3.2、clade 2.3.4和clade 7.2。在各自的分支下面抗原性和基因特性也是多樣的。各分支間，高致病性與低致病性病毒間，以及與不同NA亞型之間的重配時有發(fā)生。如H5N6病毒在中國導(dǎo)致家禽間暴發(fā)并且有致死性人感染病例報道[7]。H5N8病毒由韓國日本傳到歐洲和北美。這種H5亞型與不同NA亞型間的重配大多發(fā)生在clade 2.3.4的病毒。2012-2014年間在我國免疫過的家禽中分離到了免疫逃逸的重配的高致病性的H5N2病毒。這類病毒分屬于clade 7.2和clade 2.3.4與低致病性禽流感H9N2的重配病毒[8]。這種復(fù)雜的流行情況給包括中國在內(nèi)的全球公共衛(wèi)生帶來巨大考驗(yàn)。使疫情應(yīng)對和防控策略的制定變得更為復(fù)雜。為了應(yīng)對可能由此引起的流感大流行，一系列疫苗儲備株被研制成功，隨著該類病毒抗原性的變化儲備疫苗組分被實(shí)時更新。同時為了滿足監(jiān)測的要求，還應(yīng)及時更新各亞系的代表病毒及其參考血清。

青海湖因其獨(dú)特的地理位置以及曾經(jīng)暴發(fā)過野鳥的高致病性禽流感疫情使這一地區(qū)成為公共衛(wèi)生關(guān)注的區(qū)域。加強(qiáng)這一地區(qū)野鳥及家禽相關(guān)環(huán)境的監(jiān)測可以了解高致病性禽流感毒株的起源、進(jìn)化、傳播以及對可能產(chǎn)生的流感大流行毒株的潛在性加以評估。

4參考文獻(xiàn)

[1]WHO/OIE/FAO H5N1 EvolutionWorkingGroup.Continuedevo-lution of highly pathogenic avianinfluenza A (H5N1):updated nomenclature.Influenza OtherRespir Viruses. 2012,6:1-5.doi: 10.1111/j.1750-2659.2011.00298.x. Epub 2011 Oct 29.

[2]http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/Influenza_Summary_IRA_HA_interface_13November_2015.pdf?ua=1

[3]Chen H, Li Y, Li Z. et al. Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in western China. J Virol, 2006,80:5976-5983. doi: 10.1128/JVI.00110-06.

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[5]http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/resources/guidance_documents/en/

[6]董婕，楊靜，薄洪,等. 青海湖地區(qū)禽流感病毒分布情況調(diào)查. 疾病監(jiān)測，2015,30：5613. doi:10.3784/j.issn.1003-9961.2015.07.009.

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[8]Pan M, Gao R, Lv Q, et al. Human infection with a novel highly pathogenic avian influenza A (H5N6) virus: Virological and clinical findings. J Infect, 2015,pii: S0163-4453(15)00220-0. doi: 10.1016/j.jinf.2015.06.009. [Epub ahead of print]

[9]Ma QX, Jiang WM, Liu S, et al. Subclinical highly pathogenic avian influenza virus infection among vaccinated chickens, China. Emerg Infect Dis, 2014,20:2152-2154. doi: 10.3201/eid2012.140733.

通信作者：舒躍龍， Email：yshu@cnic.org.cn

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.002

基金項(xiàng)目：973課題“重要病毒在不同宿主中的復(fù)制機(jī)制”(2011CB504704)

(收稿日期：2015-10-02)

Characteristics of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses isolated from poultry related environments of surrounding areas of Qinghai Lake

DongJie,DongLibo,ZhangYe,BoHong,HuangWeijuan,WangDayan,ShuYuelong

KeyLaboratoryforMedicalVirology，ChineseNationalInfluenzaCenter，NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention，Beijing102206，ChinaCorrespondingauthor:ShuYuelong，Email：yshu@cnic.org.cn

【Abstract】ObjectiveTo understand the antigenic and genetic characteristics of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses isolated from poultry related environments of surrounding areas of Qinghai Lake.MethodsPoultry and wild birds related environments from surrounding areas of Qinghai lake were collected and handled. Viruses were isolated with embryonated chicken eggs. The virus subtyping was performed by real-time RT-PCR. The highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses were chosen to conduct next generation sequencing and hemagglutination inhibition (HI) assay.ResultsIn total of 19 H5N1 virus strains were isolated, they were all from poultry related environments and collected in January-March of year 2013. Seven representative highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses were sequenced and analyzed for antigenicity. According to phylogenetic analysis of HA gene, 6 viruses were belong to clade 2.3.2.1c except A/Environment/Qinghai/XN02032/2013 which belongs to clade 7.2. Antigenic analysis showed that 6 viruses were antigenically similar to A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010, while A/Environment/Qinghai/XN02032/2013 presented low reaction with all reference antisera.ConclusionsThe existence of highly pathogenic avian influenza H5N1viruses in poultry related environments of surrounding areas of Qinghai Lake was confirmed. The status of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses with evolution diversity emphasized the necessary of strengthening the avian influenza surveillance in these areas.

【Key words】Highly pathogenic avian influenza; H5N1 subtype; Phylogenetic analysis; Antigenic analysis