孫曉曼　郭妮君　徐子乾　李丹地　段招軍

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·技術方法·

P[14]型輪狀病毒VP8*蛋白特異結(jié)合A型組織血型抗原

孫曉曼郭妮君徐子乾李丹地段招軍

102206 北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(孫曉曼、李丹地、徐子乾、段招軍); 410005 長沙, 湖南師范大學第一附屬醫(yī)院湖南省人民醫(yī)院檢驗科(郭妮君)

【摘要】目的研究輪狀病毒與組織血型抗原之間的關系。方法以直接從人糞便標本中檢測到的比較少見的G8P[14]型輪狀病毒為研究對象，表達純化得到P[14] VP8*蛋白，通過寡糖結(jié)合和唾液結(jié)合實驗，研究其與組織血型抗原的結(jié)合。結(jié)果P[14] VP8*蛋白可以與A型寡糖和A型唾液特異結(jié)合，而沒有檢測到與其他型別的組織血型抗原結(jié)合。 結(jié)論A型組織血型抗原可能是P[14]型輪狀病毒的潛在受體，這為進一步研究其他型別輪狀病毒受體結(jié)合特征及輪狀病毒監(jiān)測提供了一定的基礎和依據(jù)。

【主題詞】P[14]型輪狀病毒；VP8*蛋白；組織血型抗原

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (81472003;31500139)

輪狀病毒(rotaviruses，RVs)是引起嬰幼兒及動物病毒性胃腸炎的重要病原體，每年引起大約50萬例嬰幼兒死亡[1]。輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是分節(jié)段的雙鏈RNA病毒，基因組包含11個雙鏈RNA片段，編碼12種蛋白，包括6個結(jié)構(gòu)蛋白和6個非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。輪狀病毒顆粒包含有三個殼層，分別由不同的結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，其中最外層由VP4 和VP7蛋白構(gòu)成。VP7 是一種糖蛋白，大量存在于感染細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，與病毒裝配有關；VP4 蛋白形成主要的刺突蛋白，介導病毒吸附和進入宿主細胞。病毒感染宿主過程中，VP4 蛋白經(jīng)蛋白酶作用可裂解為VP5*和VP8*蛋白[3]。VP8*主要參與受體識別，介導病毒吸附于宿主細胞；VP5*主要參與膜融合，幫助病毒顆粒進入細胞質(zhì)。根據(jù)VP7 和VP4 蛋白，可以將輪狀病毒分為不同的G 型和P 型[4]，目前鑒定到的有27 個G型和35 個P型，其中流行較多的毒株的G型為G1～G4，P 型為P[4]和P[8]。

有些動物輪狀病毒對唾液酸酶(sialidase，SA)敏感，可能結(jié)合宿主細胞表面含有末端唾液酸的受體，如GD1a。進一步研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)動物輪狀病毒和人輪狀病毒對唾液酸酶都不敏感[5]，對于這些唾液酸不敏感的輪狀病毒受體結(jié)合特征還不是很明確，有研究表明它們可能結(jié)合具有支鏈唾液酸的神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)[6]，如GM1。近來研究發(fā)現(xiàn)組織血型抗原(histo-blood group antigens，HBGAs)可以與VP8*蛋白相互作用，可能是輪狀病毒的潛在受體[7-10]。HBGAs具有豐富的多態(tài)性，包含ABO、分泌型及Lewis抗原[11]。研究表明，不同P型的輪狀病毒與HBGAs的結(jié)合具有型別特異性[7, 12]，人群中主要流行的P[4]和P[8]型輪狀病毒結(jié)合H1和Leb,而P[6]只與H1結(jié)合。此外，不同人群對各種輪狀病毒易感性也存在差異[13]，輪狀病毒疫苗(P[8]型輪狀病毒)在非洲地區(qū)的保護效力相對較低，研究發(fā)現(xiàn)可能是因為人群中Lewis抗原陰性和非分泌型個體比例較高，而這些個體對P[8]輪狀病毒不易感[14]。因而，研究輪狀病毒與HBGAs的相互作用對于闡明輪狀病毒的感染機制以及對輪狀病毒疫苗的研究具有重要意義。

本課題組在我國輪狀病毒監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)了一株比較少見的G8P[14] 輪狀病毒。P[14]型輪狀病毒雖然沒有P[4]和P[8]型輪狀病毒那樣流行廣泛，但近來P[14]感染人的報導也越來越多。P[14]型輪狀病毒也被認為可以跨種傳播，從動物傳播到人[15]。本研究表達和純化了P[14] 輪狀病毒 VP8*蛋白，并對其與HBGAs的結(jié)合特征進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P[14] 輪狀病毒 VP8*蛋白與A型HBGA特異結(jié)合，對深入研究輪狀病毒的跨種傳播提供了依據(jù)。

1材料與方法

1.1VP8*蛋白表達和純化利用Geneaid試劑盒從糞便標本中提取病毒RNA，RT-PCR擴增得到VP8*片段。將VP8*全長基因克隆到表達載體pGEX4T-1，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞(天根生物公司)，挑單克隆37 ℃培養(yǎng)至OD600值0.6～1.0之間，加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)(終濃度為0.4 mmol/L)，20 ℃誘導表達過夜。

離心收集菌體經(jīng)PBS重懸，冰水浴超聲破碎(超聲2s，間隔2s)，高速離心(15 000 rpm，1 h)收集上清并用0.22 mm濾膜過濾，結(jié)合谷胱甘肽瓊脂糖磁珠(Glutathione Sepharose 4B)，先用50～100 ml PBS洗去非特異結(jié)合蛋白，用30～50 ml洗脫液(50 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mmol/L還原性谷胱甘肽)洗脫，得到VP8*-GST融合蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢測純化后的蛋白。

1.2寡糖結(jié)合試驗將純化得到的VP8*-GST融合蛋白用PBS稀釋成20 μg/ml的濃度，包被到96孔酶標板中，每孔100 μl，4 ℃過夜。用5%的脫脂奶粉封閉，每孔200 μl，37 ℃ 封閉1 h。用2%脫脂奶粉將人工合成的生物素標記的寡糖Lea、Lex、Leb、Ley、H1、H2、H3、A、B、SiaLex、N-acetylneuraminicacid(Neu5Ac)、N-glycolylneuraminicacid(Neu5Gc)及type I前體(preI)和type II前體(preII)(GlycoTech)稀釋成2 mg/ml，每孔加100 μl，4 ℃過夜。用2%脫脂奶粉將辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的streptavidin(Abcam)以1∶1 500稀釋后每孔加入100 μl，37 ℃溫育1 h。此實驗過程中每一步反應之后均以PBST洗液洗板5次、拍干。每孔加入100 μl四甲基聯(lián)苯氨(3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine, TMB)底物緩沖液(BD Biosciences)，避光顯色10 min；加入100 μl 1 M磷酸終止反應，酶標儀檢測OD450吸收值。

1.3唾液結(jié)合試驗使用中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所腹瀉室保存的已經(jīng)測定表型的唾液樣本，將A、AB、B和O各種表型的唾液樣本用PBS以1∶1 000稀釋，每孔100 μl包被96孔酶標板，4 ℃過夜。用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。每孔加入100 μl濃度為20 μg/ml的VP8*-GST融合蛋白，37 ℃孵育1 h。然后加入100 μl鼠抗GST標簽抗體(TransGen，1∶1 000稀釋)，37 ℃孵育1 h；最后加入100 μl HRP-羊抗鼠IgG(Abgent，1∶1500)，37 ℃孵育1 h。實驗過程中每一步反應之后均以PBST洗液洗板5次后拍干。同上用TMB底物緩沖液顯色，檢測OD450吸收值。

2結(jié)果

2.1P[14] VP8*-GST融合蛋白表達和純化通過大腸埃希菌表達系統(tǒng)，得到可溶形式的P[14] VP8*-GST融合蛋白，利用親和層析純化得到較純的目的蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)結(jié)果顯示有大約50 kDa條帶和大約26 kDa蛋白(圖1)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定26 kDa條帶為單獨表達的GST蛋白，50 kDa條帶為GST-VP8*融合蛋白，與目的蛋白預期的相對分子質(zhì)量也相符合。

M：蛋白分子量標準；1：純化后蛋白圖1　P[14] VP8*-GST融合蛋白SDS-PAGE M, Protein ladder; 1, Purified proteinFig.1　SDS-PAGE of purified VP8*-GST protein

2.2P[14] VP8*-GST融合蛋白結(jié)合A型HBGA通過寡糖結(jié)合實驗，研究P[14] VP8*-GST融合蛋白與各種組織血型抗原之間的結(jié)合特征，結(jié)果顯示，與Lewis型寡糖(Lea、Lex、Leb和Ley)、H型寡糖(H1、H2、H3)、唾液酸(Neu5Ac、Neu5Gc)以及唾液酸化的Lewis寡糖(SiaLex)都沒有檢測到明顯的結(jié)合，與B型HBGA也未檢測到結(jié)合，而與A型HBGA有較明顯的結(jié)合(圖2)。為了排除單獨GST蛋白的影響，單獨的GST蛋白與各寡糖也進行了結(jié)合實驗，結(jié)果顯示單獨的GST與各寡糖都沒有檢測到結(jié)合，表明GST對VP8*蛋白結(jié)合活性沒有影響。

注：結(jié)果為三次平行實驗的均值圖2　P[14] VP8*-GST融合蛋白與各寡糖的結(jié)合Note：The result shows the average of three parallel experimentsFig.2　Oligosaccharides binding assay of P[14] VP8*-GST fusion protein and free GST protein

2.3P[14] VP8*-GST融合蛋白結(jié)合A型唾液樣本利用本實驗室保存的ABO表型明確的94份唾液樣本，進行了P[14] VP8*-GST蛋白唾液樣本的結(jié)合實驗，結(jié)果顯示其與A型和AB型唾液樣本具有較明顯的結(jié)合，與B型和O型唾液樣本沒有結(jié)合(圖3)。

注：O-指非分泌型個體圖3　P[14] VP8*-GST融合蛋白與A、B、O型唾液樣本的結(jié)合Note： O- represents the non-secretorsFig.3　Binding of P[14] VP8*-GST fusion protein to the A, B and O saliva samples.

注：受體結(jié)合的關鍵位點以星狀標記圖4　P[14] VP8*氨基酸序列比對Note：The key amino acids are labeled with stars Fig.4　The amino acids alignment of P[14] and HAL1166 VP8*

3討論

識別宿主受體并與受體結(jié)合是大多數(shù)病原引起感染至關重要的一步。關于輪狀病毒受體的研究也較多，但其受體及潛在受體結(jié)合機制尚不明確。近期的研究發(fā)現(xiàn)，組織血型抗原有可能是輪狀病毒的受體[7]。本研究以輪狀病毒監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)的P[14]型輪狀病毒為對象，研究其與HBGAs之間的相互關系。以pGEX4T-1為載體，表達純化了VP8*-GST融合蛋白，通過唾液結(jié)合和寡糖結(jié)合實驗，發(fā)現(xiàn)P[14]型輪狀病毒特異性地與A型HBGA結(jié)合。已有研究通過糖點陣實驗和細胞結(jié)合實驗，發(fā)現(xiàn)HAL1166株P[14] VP8*蛋白與A型HBGA結(jié)合[16]。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)本實驗中的P[14] VP8*蛋白與HAL1166 VP8*蛋白相似度為97%，其中預期的關鍵結(jié)合位點氨基酸(101Arg, 144Ile, 146Leu, l55Tyr和187-191 SerTyrTyrLeuThr)也相對保守(圖4)，這也與它們都結(jié)合A型HBGA的結(jié)果相一致。

本研究中VP8*-GST融合蛋白表達的同時也有一些單獨GST蛋白的表達，但通過實驗發(fā)現(xiàn)GST蛋白與寡糖和唾液都是沒有結(jié)合的，表明是P[14] VP8*蛋白特異性與A型寡糖和唾液結(jié)合。P[14]型輪狀病毒可以感染偶蹄類動物，進而跨種傳播到人[15]，而A型HBGA不僅在人中存在，在某些動物中也存在，P[14] VP8*蛋白特異性與A型HBGA結(jié)合也從一方面揭示了其跨種傳播的潛在機制。

綜上所述，通過寡糖結(jié)合和唾液結(jié)合研究表明輪狀病毒P[14] VP8*蛋白與A型寡糖有較明顯的結(jié)合，為其他型別輪狀病毒與HBGAs的結(jié)合研究做了基礎，也為輪狀病毒跨種傳播和防控提供了一定的理論依據(jù)。

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通信作者：李丹地, Email:dandili@163.com；段招軍,Email: zhaojund@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.015

基金項目：國家自然科學基金(81472003；31500139)

(收稿日期:2015-12-10)

P[14] Rotavirus VP8*protein specifically binds to a type histo-blood group antigen

SunXiaoman,GuoNijun,XuZiqian,LiDandi,DuanZhaojun

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(SunXM,LiDD,XuZQ,DuanZJ);ClinicalLaboratoryofHunanProvincialPeople’sHospital,ThefirstAffiliatedHospitalofHunanNormalUniversity,Changsha410005,China(GuoNJ)Correspondingauthor:LiDandi,Email:dandili@163.com;DuanZhaojun,Email:zhaojund@126.com

【Abstract】ObjectiveTo explore the binding specificity of the P[14] RV detected directly from the stool samples. MethodsThe P[14] VP8* protein was expressed and purified and then the binding pattern to synthetic oligosaccharides and saliva samples was carried out. ResultsThe P[14] VP8* protein showed significant binding to A type HBGA while almost no binding was detected to other HBGAs. ConclusionsA-HBGA may be the attachment factor for the P[14] rotavirus. Therefore, the research of the interaction between P[14] RV and HBGAs provides the basis for further characterization of binding patterns of other RV genotypes and the RV surveillance.

【Key words】P[14] rotavirus;VP8* protein;Histo-blood group antigens