龐立麗　靳淼　王慧敏　王瑩　陳愛(ài)珺　李慧穎　章青　高?！《握熊?/p>

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·論著·

鼠諾如病毒MNV-CW1感染C57BL/6小鼠的特點(diǎn)

龐立麗靳淼王慧敏王瑩陳愛(ài)珺李慧穎章青高福段招軍

100101 北京，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所[龐立麗(博士后)、高福]；102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(龐立麗、靳淼、陳愛(ài)珺、李慧穎、章青、段招軍)；010110 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)(王慧敏、王瑩)

【摘要】目的探討鼠諾如病毒(Murine noroviurs, MNV)感染C57BL/6小鼠后臨床及生物學(xué)特征，了解MNV的感染特點(diǎn)。方法將MNV-CW1毒株以高劑量(104PFU/只)和低劑量(102PFU/只)分別灌胃到C57BL/6小鼠體內(nèi)，建立MNV感染小鼠模型。對(duì)感染小鼠進(jìn)行體征觀察和體溫檢測(cè)，檢測(cè)糞便和血液排毒情況、組織中病毒的分布情況以及十二指腸病理切片檢查。結(jié)果感染的小鼠沒(méi)有明顯的體表變化，沒(méi)有腹瀉、發(fā)熱等臨床癥狀和病理改變。糞便檢測(cè)感染后1～2 d排毒。在感染后第3天部分血液中檢測(cè)到MNV RNA。主要感染部位為消化系統(tǒng)和脾臟。 結(jié)論本研究建立的MNV-CW1感染C57BL/6小鼠模型為MNV感染小鼠致病機(jī)制進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)信息和技術(shù)支撐。

【主題詞】鼠諾如病毒；小鼠；實(shí)驗(yàn)感染

Fund programs: China Postdoctoral Science Foundation (2015M580142)

諾如病毒(Noroviruses, NoVs)屬于杯狀病毒科(Caliciviridae family),是全球急性胃腸炎散發(fā)病例和暴發(fā)疫情的主要致病原[1]。NoV變異快，環(huán)境抵抗力強(qiáng)，傳播途徑多樣，全人群普遍易感，疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重。NoV很難在體外復(fù)制分離，僅有文獻(xiàn)報(bào)道在細(xì)菌感染的幫助下成功用B細(xì)胞培養(yǎng)成功[2]。缺少成熟的體外復(fù)制體系和合適的小動(dòng)物感染模型，嚴(yán)重阻礙了NoV致病機(jī)理等方面的研究。

根據(jù)基因特征，諾如病毒可分為6個(gè)基因群(Genogroup，GI-GVI)，GI 和GII 是引起人類急性胃腸炎的兩個(gè)主要基因群，GIV 也可感染人，但很少被檢出。GIII、GV 和GVI 分別感染牛、鼠和狗。2003年Karst等人首次從免疫缺陷小鼠(RAG/STAT-/-)體內(nèi)分離得到鼠諾如病毒(Murine norovirus，MNV)[3]。MNV與NoV在生物學(xué)及遺傳特性方面都非常相似，可以在傳代細(xì)胞如小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞上生長(zhǎng)并產(chǎn)生細(xì)胞病變，可以感染鼠樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。MNV是NoV理想的研究模型，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有很重要的作用。NoV許多生物學(xué)特性和感染機(jī)制都是利用MNV進(jìn)行研究的。最近利用MNV，對(duì)腸道共生菌和腸道病毒在腸道免疫中起到的影響和相互作用有了全新的認(rèn)識(shí)[4]。本研究采用灌胃方式感染C57BL/6實(shí)驗(yàn)小鼠，研究C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)感染MNV的情況，了解MNV感染特點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7只7周齡SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠和7只8周齡雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。并通過(guò)了中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審查(批準(zhǔn)號(hào)：201511040031)。

圖1　小鼠糞便檢測(cè)MNV-CW1 RNA水平dpi: days post infectionFig.1　RNA levels of MNV-CW1 in feces of C57 BL/6 mice

1.2病毒MNV-CW1病毒由美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院Herbert W. Virgin IV教授饋贈(zèng)。并在RAW264.7細(xì)胞中傳代增殖，細(xì)胞病變顯著，病毒經(jīng)反復(fù)凍融3次，低速離心后取上清，病毒滴度為104TCID50/ml。

1.3動(dòng)物分組和感染途徑將12只C57BL/6小鼠(包括6只雄性小鼠和6只雌性小鼠)分成兩組：高劑量組和低劑量組。將MNV-CW1毒株以高劑量(104PFU/只)和低劑量(102PFU/只)分別灌胃到小鼠體內(nèi)；另外同等體積的PBS灌胃到一只雄性和一只雌性小鼠體內(nèi)作為正常對(duì)照。

1.4樣本處理高劑量組和低劑量組小鼠感染后每天測(cè)量體溫觀察體表變化，收集糞便。感染后0 d、3 d、7 d和30 d采集血液，分離血清。感染后3 d、7 d和30 d，分別處死高劑量組和低劑量組雌性和雄性小鼠各一只，取心臟、肝臟、脾臟、胃、腎臟、食管、小腸、大腸和腸系膜淋巴結(jié)等器官凍存于液氮中，研究MNV-CW1的主要感染部位。解剖小鼠十二指腸放入4%多聚甲醛中，用于病理切片研究。對(duì)照組小鼠于感染后30 d處死。

1.5病毒RNA檢測(cè)使用病毒核酸提取試劑盒(Viral Nucleic Acid Extraction Kit II, Geneaid)提取糞便和血清中的病毒RNA。利用勻漿機(jī)破碎組織，使用試劑盒(RNeasy Mini Kit，QIAGEN)提取組織中的RNA，并及時(shí)分裝凍存于-80 ℃，使用Real-time PCR試劑盒(QuantiTect Probe RT-PCR Kit，QIAGEN)檢測(cè)提取的RNA中病毒RNA含量。引物和探針序列參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[5]。

2結(jié)果

2.1臨床觀察感染病毒后，對(duì)小鼠進(jìn)行了體溫測(cè)量、體表和糞便形態(tài)觀察。高劑量組和低劑量組小鼠一直保持正常情形，主要表現(xiàn)為無(wú)腹瀉、體毛平順。感染病毒后無(wú)明顯體溫升高現(xiàn)象。

2.2小鼠糞便中病毒含量測(cè)定Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，高劑量組感染率達(dá)100%，在感染后第1天和第2天糞便中檢測(cè)到MNV-CW1病毒RNA(圖1)。低劑量組感染率為66.67%，其中兩只小鼠在感染后第1天和第2天糞便中檢測(cè)到病毒RNA，另外2只小鼠在感染后第2天在糞便中檢測(cè)到病毒RNA。其他收集的糞便標(biāo)本檢測(cè)MNV-CW1病毒RNA均為陰性。

2.3小鼠血液中病毒含量測(cè)定提取0 d、3 d、7 d、30 d小鼠血清中的核酸，利用Real-time PCR檢測(cè)MNV-CW1病毒RNA，只有在第3天檢測(cè)到一只雌性小鼠血清中MNV-CW1陽(yáng)性，含量為1.04×104拷貝。

2.4小鼠組織中病毒分布情況感染后3 d、7 d和30 d，分別處死高劑量組和低劑量組雌性和雄性小鼠各一只，取心臟、肝臟、脾臟、胃、腎臟、食管、小腸、大腸和腸系膜淋巴結(jié)等器官，提取RNA，檢測(cè)MNV-CW1病毒RNA，研究MNV-CW1的主要感染部位。結(jié)果表明MNV-CW1主要感染部位為肝臟、脾臟、胃、食管、小腸和腸系膜淋巴結(jié)等器官。

2.5小鼠十二指腸病理分析感染后3 d處死的小鼠，解剖十二指腸，用于病理切片分析。結(jié)果分析與正常小鼠十二指腸組織切片相比，感染小鼠十二指腸組織切片沒(méi)有明顯的病理改變。

3討論

NoVs是嚴(yán)重危害人類健康的重要食源性病毒，可導(dǎo)致不同年齡段人群的急性病毒性腹瀉。對(duì)NoVs的致病機(jī)制尚不是很明確。但是NoVs在體外不能增值，而MNV卻可以在傳代細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞上生長(zhǎng)并產(chǎn)生細(xì)胞病變，因此MNV成為了NoVs的替代病毒進(jìn)行研究。MNV在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中廣泛傳播，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)此病毒易感[6]。本研究利用MNV-CW1感染C57 BL/6小鼠，對(duì)小鼠糞便的排毒情況和病毒血癥以及組織病毒分布等做了分析。

MNV-CW1是2003年Karst等[3]首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)的MNV病毒株。自然感染MNV-1的免疫缺陷小鼠STAT1-/-,STAT1-/-/PKR-/-,RAG-/-/STAT1-/-可以發(fā)生致死性感染，而野生型小鼠感染MNV后卻沒(méi)有發(fā)病癥狀。在MNV-1報(bào)道發(fā)現(xiàn)之后，陸續(xù)又有MNV-2、MNV-3、MNV-4等毒株被發(fā)現(xiàn)[7]。其中有的毒株是持續(xù)性感染，感染后8周還能在腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、空腸和糞便中檢測(cè)到病毒RNA。我們研究中用到的毒株是MNV-CW1可以造成小鼠急性感染，文獻(xiàn)報(bào)道129和CD1小鼠感染MNV-1 1 d后肝臟、脾臟和小腸中檢測(cè)到病毒RNA，2～7 d被清除[7,8]。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。NoVs病毒一般也是造成急性自限性感染，以輕癥為主，最常見(jiàn)的癥狀是腹瀉和嘔吐，癥狀持續(xù)時(shí)間平均為2～3 d，但高齡人群和基礎(chǔ)性疾病患者恢復(fù)較慢[9]。NoVs病毒復(fù)制主要在小腸。我們的研究表明主要在消化道和脾臟檢測(cè)到MNV-CW1。下一步研究還需要在小鼠感染MNV-CW1病毒后第1天和第2天進(jìn)行解剖，檢測(cè)病毒基因組負(fù)鏈RNA在組織中的分布，以確定病毒復(fù)制部位。

本研究選用的小鼠品系是C57 BL/6。C57 BL/6小鼠基因敲除后，廣泛用于病原體致病機(jī)制研究。對(duì)人類傳染性疾病的研究經(jīng)常借助于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。對(duì)鼠諾如病毒MNV-CW1感染C57BL/6小鼠的研究有利于對(duì)MNV-CW1致病機(jī)制進(jìn)行深入研究。

4參考文獻(xiàn)

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通信作者：高福，Email:gaof@im.ac.cn;段招軍，Email: zhaojund@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.002

基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后科學(xué)基金(2015M580142)

(收稿日期：2016-03-30)

Experimental infection of C57BL/6 mice with strain CW1 of murine norovirus

PangLili,JinMiao,WangHuimin,WangYing,ChenAijun,LiHuiying,ZhangQing,GaoGeorgeF.,DuanZhaojun

InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China[PangLL(postdoctor),GaoGF];NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(PangLL,JinM,ChenAJ,LiHY,ZhangQ,DuanZJ);BasicMedicalCollege,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010110,China(WangHM,WangY)Correspondingauthor:GaoGeorgeF.,Email:gaof@im.ac.cn;DuanZhaojun,Email:zhaojund@126.com

【Abstract】ObjectiveTo establish the animal model of infection of C57BL/6 mice by a murine norovirus (MNV) strain MNV-CW1. MethodsC57BL/6 mice were orally administrated with MNV-CW1 of 104 PFU or 102 PFU per mouse. After establishment of mice model, we observed the clinical signs of disease and detected the virus RNA in feces, serum and organs. ResultsMNV-CW1 cannot induce obvious clinical syndrome in C57BL/6 mice, such as fever, diarrhea and histophathological changes. MNV RNA was detected in fecal on day 1 or 2 after infection and the main infection sites were spleen and digestive system of mice. ConclusionsAn animal model of MNV-CW1 was established and it will provide a basis for the further study of molecular pathogenesis of MNV infection.

【Key words】Murine norovirus,MNV; mouse; experimental infection