楊振亞，盧曉丹，高彥征①

(1.江蘇省環(huán)境科學(xué)研究院/ 江蘇省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京　210036；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所，江蘇 南京　210095)

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植物多酚氧化酶對(duì)多環(huán)芳烴污染的體外誘導(dǎo)響應(yīng)

楊振亞1,2，盧曉丹2，高彥征2①

(1.江蘇省環(huán)境科學(xué)研究院/ 江蘇省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210036；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所，江蘇 南京210095)

摘要：文獻(xiàn)中多采用生物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法來(lái)研究污染物對(duì)植物酶的誘導(dǎo)作用，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，亟需采用一種快速、簡(jiǎn)便的體外實(shí)驗(yàn)方法來(lái)研究多環(huán)芳烴(PAHs)等對(duì)植物酶的影響。采用植物體外實(shí)驗(yàn)方法，以三葉草(Trifolium repens)為供試植物，研究了三葉草莖葉中多酚氧化酶(PPO)對(duì)二環(huán)PAHs苊和四環(huán)PAHs芘的體外誘導(dǎo)響應(yīng)。結(jié)果表明，ρ(苊)為0～39.68 mg·L-1時(shí)，三葉草莖葉PPO活性隨苊污染濃度增大而升高，表現(xiàn)為誘導(dǎo)效應(yīng)；ρ(芘)為0～0.16 mg·L-1時(shí)，PPO活性隨芘污染濃度增大呈先升高后降低趨勢(shì)，表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制效應(yīng)。三葉草莖葉PPO對(duì)苊和芘的體外污染的敏感性響應(yīng)順序?yàn)檐?<芘，與其自身毒性順序一致。采用體外實(shí)驗(yàn)方法可快速、有效、簡(jiǎn)單地評(píng)價(jià)PAHs對(duì)植物PPO的誘導(dǎo)效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：植物；多酚氧化酶；多環(huán)芳烴；體外誘導(dǎo)

多環(huán)芳烴(PAHs)是污染土壤中常見的一類高風(fēng)險(xiǎn)有機(jī)污染物,具有“三致”效應(yīng)，對(duì)生物體親和力強(qiáng)。國(guó)際癌癥研究中心(IARC)列出的94種對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致癌的化合物中,15種為PAHs。2014年4月,環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部聯(lián)合發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》中指出,我國(guó)土壤中PAHs點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)1.4%。土壤污染后,PAHs可通過(guò)多種途徑進(jìn)入植物體內(nèi),影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量,并可通過(guò)食物鏈危害人類健康。研究PAHs脅迫下植物體內(nèi)酶響應(yīng)及代謝行為對(duì)于評(píng)價(jià)土壤污染風(fēng)險(xiǎn)、減低植物PAHs污染風(fēng)險(xiǎn)、保障農(nóng)產(chǎn)品安全等有重要意義[1]。

生物代謝中酶活性的變化是一種能反映環(huán)境物理和化學(xué)變化的生物標(biāo)記物,它可以對(duì)環(huán)境的變化提供早期預(yù)報(bào)。因此,越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注植株體內(nèi)酶在逆境中的變化,試圖用酶的變化來(lái)診斷環(huán)境污染狀況[2]。關(guān)于重金屬對(duì)植物酶影響的研究已較深入[3-4],一些學(xué)者研究了病菌[5-6]以及農(nóng)藥[7]等對(duì)植物酶活性的影響,但有關(guān)PAHs類有機(jī)污染物對(duì)植物酶影響的報(bào)道卻鮮見。另一方面,多酚氧化酶(PPO)能作用于PAHs等有機(jī)污染物,將其轉(zhuǎn)化為易于降解的物質(zhì)從而加速其降解,減輕污染毒性[8]。PPO作為PAHs降解途徑中一類關(guān)鍵酶,能催化PAHs開環(huán),生成較易降解的中間產(chǎn)物,在PAHs降解過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[1],搞清PAHs對(duì)PPO的誘導(dǎo)作用有助于進(jìn)一步揭示植物代謝PAHs的機(jī)理。

從已有的文獻(xiàn)來(lái)看,有關(guān)PAHs對(duì)酶的誘導(dǎo)研究所采用的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法多為生物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[2,8-9]，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。因此,亟需建立一種快速、簡(jiǎn)便的體外實(shí)驗(yàn)方法來(lái)研究PAHs等有機(jī)污染物對(duì)植物酶的影響。筆者以苊和芘作為PAHs代表物,以三葉草(Trifoliumrepens)為供試植物,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)方法研究PAHs對(duì)三葉草PPO的誘導(dǎo)效應(yīng)。

1材料與方法

1.1試劑

苊、芘購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司,純度w>98%;二甲基亞砜(DMSO)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、鄰苯二酚、配制pH值為7.8的磷酸緩沖溶液以及營(yíng)養(yǎng)液用的各種試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

供試植物為三葉草,根據(jù)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配方[6]于溫室中采用砂培方式進(jìn)行培養(yǎng)。三葉草種子經(jīng)去離子水浸泡后,直接播種于盛有石英砂的底部有孔的花盆中,遮光催芽,將花盆浸于盛有營(yíng)養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中,保持液面高度為石英砂高度的2/3。溫室中白天溫度為25～35 ℃,夜間為15～25 ℃,自然光照。待株高20 cm左右收獲植物,植物樣品經(jīng)蒸餾水充分淋洗后,用濾紙吸干表面水分,于-65 ℃條件下保存待用。

PPO的提取參考盧曉丹等[8]的方法:準(zhǔn)確稱取三葉草莖葉0.200 g,加0.1 g PVP、0.2 g石英砂和16 mL預(yù)冷的pH值為6.0的磷酸緩沖液(PBS),冰浴研磨,10 000 r·min-1冷凍離心(離心半徑10 cm)15 min,取上清液為PPO提取液,保存于冰箱中待用,以上操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。

三葉草PPO的體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)參考王詠等[2]和吳偉等[10]的方法:將受試化合物苊和芘用DMSO溶解,配成一個(gè)濃度系列,每個(gè)濃度取50 μL,然后和100 μL上述酶液、2 000 μL pH值為6.0的 PBS緩沖液、1 000 μL 0.1 mol·L-1鄰苯二酚在試管中混勻,并在25 ℃條件下保溫5 min,用分光光度計(jì)比色法測(cè)定酶活性。對(duì)照為50 μL DMSO 溶液,每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.3分析方法

采用鄰苯二酚比色法測(cè)定PPO活性[8]:依次向比色管中迅速加入2 mL 0.01 mol·L-1、pH 值為6.0的磷酸緩沖液、1.0 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二酚、0.2 mL酶液。反應(yīng)介質(zhì)搖勻,在420 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。酶液加入后開始計(jì)時(shí),每20 s記錄1次吸光度(D420),共記錄5次。重復(fù)3次,酶活性以每分鐘D420值每增加0.01為1個(gè)活力單位(△D420·min-1·mg-1)。

植物PPO活性的誘導(dǎo)率/抑制率(I)計(jì)算公式如下:

I=(E-E0)/E0×100%。

(1)

式(1)中,E為PAHs誘導(dǎo)下植物酶活性;E0為無(wú)污染對(duì)照植物酶活性。I為正值表示誘導(dǎo)率,I為負(fù)值表示抑制率。

參照盧曉丹等[8]的方法,計(jì)算PPO對(duì)苊和芘污染的敏感性指數(shù)(R),公式如下:

R=(E-E0)/Cw×100%。

(2)

式(2)中,R為酶敏感性響應(yīng)指數(shù),即單位濃度PAHs所導(dǎo)致的酶活性增量;E為污染條件下植物酶活性;E0為無(wú)污染對(duì)照的植物酶活性;Cw為PAHs質(zhì)量濃度,mg·L-1。

2結(jié)果與討論

2.1苊和芘對(duì)三葉草PPO活性的影響

圖1為體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中苊對(duì)三葉草莖葉中PPO活性的影響。

圖1　不同濃度苊對(duì)三葉草莖葉PPO活性的影響

供試苊濃度范圍內(nèi),隨苊污染濃度增加PPO活性總體上呈增加趨勢(shì)。無(wú)苊污染時(shí),三葉草莖葉中PPO活性為4 092.54 △D420·min-1·mg-1;ρ(苊)為39.68 mg·L-1時(shí)PPO活性則增大到6 842.62 △D420·min-1·mg-1,比對(duì)照增加67.20%。ρ(苊)<20 mg·L-1時(shí),苊對(duì)三葉草莖葉中PPO活性的影響不顯著,但當(dāng)ρ(苊)>25 mg·L-1時(shí),隨苊污染濃度增加PPO活性快速增加。

芘對(duì)三葉草莖葉PPO活性的影響見圖2。ρ(芘)為0～0.159 mg·L-1時(shí),三葉草莖葉中PPO活性隨芘污染濃度升高呈先升高后降低趨勢(shì)。低濃度(0.119 mg·L-1)下芘促進(jìn)了莖葉中PPO活性提高,其中ρ(芘)為0.04 mg·L-1時(shí)莖葉中PPO活性最高(4 431.90 △D420·min-1·mg-1),比對(duì)照提高56.41%。但當(dāng)ρ(芘)>0.143 mg·L-1時(shí)則抑制三葉草莖葉PPO活性。有研究表明壬基酚對(duì)魚肝EROD的體外誘導(dǎo)表現(xiàn)出同樣趨勢(shì)[10]。

圖2　不同濃度芘對(duì)三葉草莖葉PPO活性的影響

有學(xué)者采用體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法研究了PAHs對(duì)動(dòng)物體內(nèi)酶活性的影響,得出相似規(guī)律。王詠等[2]研究了苯并[a]芘、菲、1-羥基芘、芘和9,10-萘醌對(duì)鯉魚肝微粒體EROD酶系的體外誘導(dǎo),結(jié)果表明毒性較小的菲和1-羥基芘處理主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)酶活性升高,而毒性最強(qiáng)的苯并[a]芘則表現(xiàn)為先誘導(dǎo)酶活性升高,當(dāng)苯并[a]芘濃度繼續(xù)升高時(shí)EROD活性下降,筆者的研究結(jié)果與之一致。

也有學(xué)者采用植物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法,研究了不同PAHs對(duì)植物體內(nèi)幾種酶活性的影響。盧曉丹等[8]研究發(fā)現(xiàn),隨著二環(huán)PAHs的ρ(萘)從0升至35 mg·L-1,黑麥草(Loliummultiflorum)根和莖葉中PPO呈增大趨勢(shì);而隨著四環(huán)PAHs的ρ(芘)從0升至0.15 mg·L-1,黑麥草根和莖葉中PPO呈先升高后降低趨勢(shì)。這些結(jié)果與體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中二環(huán)苊和四環(huán)芘影響植物莖葉中PPO活性的規(guī)律具有很好的一致性,表明體外實(shí)驗(yàn)方法可快速、有效、簡(jiǎn)單地研究和評(píng)價(jià)PAHs對(duì)植物PPO的誘導(dǎo)效應(yīng)。

2.2苊和芘對(duì)三葉草莖葉中PPO活性的體外誘導(dǎo)率或抑制率

由表1可以看出,苊脅迫下對(duì)PPO主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)效應(yīng),且誘導(dǎo)率隨脅迫增加而增大;而芘脅迫下PPO活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制趨勢(shì),其中,當(dāng)ρ(芘)<0.119 mg·L-1時(shí),主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)效應(yīng),大于該濃度時(shí)主要表現(xiàn)為抑制作用,當(dāng)ρ(芘)最大(0.159 mg·L-1)時(shí),抑制作用最明顯,這與盧曉丹等[8]開展的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中菲對(duì)黑麥草PPO的影響結(jié)果較一致。另外,阮長(zhǎng)青等[11]研究了有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)小麥酯酶的體外抑制作用,并繪制了抑制曲線,其中辛硫磷、敵敵畏等10種有機(jī)磷農(nóng)藥均對(duì)小麥酯酶有抑制作用,且抑制曲線存在明顯的單調(diào)遞減區(qū)間,即隨農(nóng)藥濃度增大抑制作用增強(qiáng),這一規(guī)律與上述結(jié)果相似。

表1不同濃度下苊和芘對(duì)三葉草莖葉PPO活性的誘導(dǎo)率或抑制率

Table 1PPO activity induction and inhibition rates of acenaphthene and pyrene in clover shoots relative to concentration of the pollutant

苊芘ρ/(mg·L-1)誘導(dǎo)率或抑制率/%ρ/(mg·L-1)誘導(dǎo)率或抑制率/%3.21.30.8×10-2-0.56.34.51.3×10-20.59.55.11.9×10-2-1.012.70.64.0×10-25.615.92.56.3×10-23.119.0-1.99.5×10-22.625.421.711.9×10-20.531.713.414.3×10-2-1.539.767.215.9×10-2-2.0

正值表示誘導(dǎo)率，負(fù)值表示抑制率。

在研究PAHs、重金屬等外源化合物對(duì)酶的體內(nèi)、體外誘導(dǎo)中,低濃度處理誘導(dǎo)酶活性上升、高濃度處理酶活性下降的現(xiàn)象很普遍。有些觀點(diǎn)認(rèn)為,這是由于高濃度外源化合物對(duì)細(xì)胞整體功能的負(fù)面影響而造成酶活性降低;也有學(xué)者認(rèn)為,這是由于外源化合物對(duì)酶本身的毒害作用導(dǎo)致酶活性降低[2,8],而產(chǎn)生這一現(xiàn)象的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

2.3PPO對(duì)苊和芘污染的敏感性

參照盧曉丹等[8]的方法,計(jì)算了PPO對(duì)苊和芘污染的敏感性指數(shù),比較了三葉草莖葉PPO對(duì)供試PAHs的響應(yīng)差異。酶活性對(duì)2種PAHs的敏感性指數(shù)大小為苊(0.005 5)<<芘(0.45),PPO對(duì)苊的敏感性響應(yīng)指數(shù)比對(duì)芘的小2個(gè)數(shù)量級(jí),這與PAHs本身性質(zhì)有關(guān)。苊為二環(huán)PAHs,而芘為四環(huán)PAHs,毒理學(xué)試驗(yàn)表明,PAHs毒性一般隨苯環(huán)數(shù)增加而遞增,因此植物酶對(duì)其敏感程度也隨之增大。

3結(jié)論

(1)三葉草莖葉PPO對(duì)PAHs污染的體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ρ(苊)為0～39.68 mg·L-1時(shí),隨苊污染濃度增大三葉草莖葉PPO活性升高,表現(xiàn)為誘導(dǎo)效應(yīng);ρ(芘)為0～0.16 mg·L-1時(shí),PPO活性隨芘污染濃度增大先升高后降低,表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制效應(yīng)。

(2)三葉草莖葉PPO對(duì)苊和芘體外污染的敏感性響應(yīng)順序?yàn)檐?<芘,與其自身毒性順序一致。

(3)體外實(shí)驗(yàn)方法可快速、有效、簡(jiǎn)單地研究和評(píng)價(jià)PAHs對(duì)植物PPO的誘導(dǎo)效應(yīng)。

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(責(zé)任編輯： 陳昕)

收稿日期：2015-11-03

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201503107)；江蘇省杰出青年基金(BK20130030)

通信作者①E-mail: gaoyanzheng@njau.edu.cn

中圖分類號(hào)：X83

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-4831(2016)04-0687-04

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.04.027

作者簡(jiǎn)介：楊振亞(1981—),男,江蘇金湖人,工程師,碩士,主要研究方向?yàn)榄h(huán)境污染評(píng)價(jià)與控制。E-mail: 0517jhyzy@163.com

Response of Phenol Oxidase in Plant to in Vitro Induction of Contaminant of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons.

YANG Zhen-ya1,2, LU Xiao-dan2, GAO Yan-zheng2

(1.Jiangsu Key Laboratory of Environmental Engineering, Jiangsu Provincial Academy of Environmental Science, Nanjing 210036, China;2.Institute of Organic Contaminant Control and Soil Remediation, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:The knowledge of impacts of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) on enzyme activities in plant will be of great significance to risk assessment of PAH contamination. However, little information is hitherto available in literature on in vitro experiment to study PAH-influenced enzyme activity in plant. Impacts of PAHs on phenol oxidase (PPO) activity in shoots of clover (Trifolium repens) were investigated in vitro. Acenaphthene and pyrene were used to represent PAHs. PPO activity in clover shoots was enhanced steadily with rising acenaphthene concentration from 0 to 39.68 mg·L-1, indicating an inductive effect of acenaphthene on PPO activity. In contrast, PPO activity increased first and decreased thereafter with increasing pyrenecon centration from 0 to 0.16 mg·L-1, suggesting an inductive effect in the early phase and an inhibition effect in the late phase. It was observed that PPO in clover shoots was more sensitive to acenaphthene stress than to pyrene stress, which is consistent with the trend of acenaphthene being higher than pyrene in toxicity. All the results of this work indicate that in vitro experiment may be a fast, simple and effective means to evaluate impacts of PAHs on PPO activity in plants.

Key words:plant; phenol oxidase; polycyclic aromatic hydrocarbon; induction in vitro