張?zhí)m河,王佳佳,,高　敏,仇天雷,韓梅琳,王旭明①

(1.東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 吉林　132012；2.北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京　100097)

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施用畜禽糞便有機(jī)肥土壤抗生素抗性基因污染狀況

張?zhí)m河1,王佳佳1,2,高敏2,仇天雷2,韓梅琳2,王旭明2①

(1.東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 吉林132012；2.北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京100097)

摘要：為研究施用畜禽糞便有機(jī)肥農(nóng)田土壤中抗生素抗性基因的分布狀況，采集北京地區(qū)9個(gè)長期施用有機(jī)肥蔬菜基地的溫室和大田土壤，對土壤中的抗生素耐藥菌和18種抗性基因進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明，溫室土壤中四環(huán)素耐藥菌占總菌數(shù)的比例顯著高于大田土壤(P<0.05)，但溫室土壤中氨芐西林、磺胺甲惡唑和環(huán)丙沙星耐藥菌占總菌數(shù)的比例均與大田土壤無顯著性差異(P>0.05)。大田土壤和溫室土壤中磺胺類抗性基因sulⅠ、sul2和四環(huán)素類抗性基因tetL的檢出率均為100%。其他抗性基因，如四環(huán)素抗性基因tetA、tetA/P、tetC，紅霉素抗性基因ermB，以及Ⅰ類整合子(intⅠ1)，溫室土壤的檢出率均高于大田土壤，這可能與溫室土壤有機(jī)肥施用量較大有關(guān)。

關(guān)鍵詞：土壤；有機(jī)肥；抗生素耐藥菌；抗生素抗性基因

抗生素是20世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一,為傳染病的防治作出了重要貢獻(xiàn)。抗生素有刺激動(dòng)物生長和預(yù)防疾病的作用,因此,常以亞治療劑量長期在飼料中使用[1]。大多數(shù)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素不能被完全代謝吸收,約25%～75%的抗生素以母體化合物的形式隨糞尿排出體外[2]。因此,動(dòng)物糞便中的抗生素、耐藥菌及抗性基因通過有機(jī)肥進(jìn)入農(nóng)田土壤中,可能會導(dǎo)致土壤微生物的抗生素抗性增加[3]。

2006年,PRUDEN等[4]首次將抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)作為一種新型的環(huán)境污染物提出。不同于傳統(tǒng)的化學(xué)污染物,ARGs通過整合到一些可移動(dòng)基因元件上,如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等,在共生微生物之間、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌之間、致病菌和非致病菌之間相互傳播[5]。通過這種基因水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer,HGT),ARGs可以在土壤、地下水及各個(gè)環(huán)境介質(zhì)中遷移、轉(zhuǎn)化,并很有可能通過食物鏈最終進(jìn)入人體,對人類健康造成威脅[6]。更重要的是,ARGs通過基因水平轉(zhuǎn)移,并不依賴其相應(yīng)的抗生素和耐藥菌,這進(jìn)一步增加了ARGs的傳播風(fēng)險(xiǎn)[7]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將ARGs作為21世紀(jì)威脅人類健康的最重大挑戰(zhàn)之一,并宣布將在全球范圍內(nèi)對控制ARGs進(jìn)行戰(zhàn)略部署[8]。

為了解有機(jī)肥施用對農(nóng)田土壤中ARGs分布的影響,筆者選擇北京地區(qū)長期施用有機(jī)肥的蔬菜基地,對土壤中抗生素耐藥菌和ARGs進(jìn)行檢測分析,旨在為掌握北京地區(qū)農(nóng)田土壤抗生素耐藥菌和ARGs的污染狀況以及從ARGs角度評估有機(jī)肥應(yīng)用的安全性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1采樣地點(diǎn)與時(shí)間

9個(gè)采樣地點(diǎn)(A～I(xiàn))分別位于北京市延慶縣、海淀區(qū)、昌平區(qū)、順義區(qū)、平谷區(qū)、房山區(qū)、大興區(qū)和通州區(qū)(圖1),均為連續(xù)施用有機(jī)肥5 a以上的蔬菜生產(chǎn)基地。采樣時(shí)間為2014年3—4月。采用5點(diǎn)混合采樣法分別采集每一采樣點(diǎn)的溫室和大田表層(5～10 cm)土壤各1 kg。以上采樣點(diǎn)的溫室每年至少種植2茬蔬菜,施用由畜禽糞便加工而成的有機(jī)肥,施用量為60～120 t·hm-2·a-1;大田采樣點(diǎn)每年種植1～2茬蔬菜,同樣以有機(jī)肥作為底肥,但施用量較溫室少,一般不超過30 t·hm-2·a-1。在采樣點(diǎn)Ⅰ附近采集1份常年不施肥的林地土壤樣品作為對照。采集的土樣放入裝有冰盒的采樣箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,在24 h內(nèi)進(jìn)行抗生素耐藥菌計(jì)數(shù),剩余樣品于-80 ℃條件下保存，用于DNA提取。

圖1　采樣點(diǎn)分布示意

1.2抗生素耐藥菌的計(jì)數(shù)

稱取10 g過2 mm孔徑篩的土壤樣品,加入到裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,于搖床上按200 r·min-1振蕩30 min,靜置30 min后用10倍稀釋法進(jìn)行系列稀釋。取0.1 mL適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液涂平板,每個(gè)稀釋度重復(fù)3次。細(xì)菌總數(shù)的計(jì)數(shù)采用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù),將已滅菌的LB培養(yǎng)基加入相應(yīng)的抗生素,不同抗生素的最終濃度:ρ(四環(huán)素)為16 mg·L-1[9-11],ρ(氨芐西林)為32 mg·L-1[10-11],ρ(環(huán)丙沙星)為4 mg·L-1[10-11],ρ(磺胺甲惡唑)為152 mg·L-1[12]。所有平板于28 ℃下培養(yǎng)2～3 d。選擇菌落數(shù)量為30～300的平板計(jì)算活菌數(shù)。

1.3土壤DNA提取

土壤樣品總DNA采用The PowerSoil?DNA Isolation Kit(12888-50)(MO BIO Laboratories,Inc)進(jìn)行提取。DNA提取完畢后,用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop)檢測含量及純度，A260/A280值在1.8～2.0之間,表明用試劑盒提取的DNA純度較高。

1.4ARGs的PCR檢測

對3種β-內(nèi)酰胺類ARGs(blaCARB-4、blaSPM-1、blaTEM*)、1種喹諾酮類ARGs(qnrS)、3種磺胺類ARGs(sulⅠ、sul2、dfrA1)、9種四環(huán)素類ARGs(tetA、tetA/P、tetC、tetE、tetL、tetW、tetG、tetX、tetY)、1種紅霉素類ARGs(ermB)和1種Ⅰ類整合子(intⅠ1)進(jìn)行檢測。以上ARGs的引物及退火溫度見表1[13-22]。

PCR過程:預(yù)變性溫度為94 ℃,時(shí)間3 min;然后94 ℃變性30 s,不同溫度(T)退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)30次;72 ℃保持5 min;最后4 ℃保溫。反應(yīng)體系如表2所示。

PCR產(chǎn)物檢測:用w為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用核酸染料GelRed染色,每5 μL的RCR原液與1 μL的6倍緩沖液混合加入膠內(nèi)(即6 μL Marker Trans2K plus檢測瓊脂糖凝膠),恒壓110 V,跑膠 40 min,Alphalmager HP凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照檢測。

2結(jié)果與討論

2.1農(nóng)田土壤抗生素耐藥菌的數(shù)量

選擇4種常見的抗生素(四環(huán)素、氨芐西林、環(huán)丙沙星和磺胺甲惡唑)耐藥菌進(jìn)行分析檢測[23-24]。大田土壤和溫室土壤中抗生素耐藥菌活菌數(shù)如表3所示。由表3可知，溫室土壤中四環(huán)素耐藥菌和氨芐西林耐藥菌數(shù)量顯著高于大田土壤(P<0.05),但環(huán)丙沙星和磺胺甲惡唑耐藥菌數(shù)量在溫室土壤和大田土壤之間無顯著性差異(P>0.05)。由于大田和溫室土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)不同,所以單純從絕對數(shù)量上比較不足以全面反映大田和溫室土壤中抗生素耐藥菌的差別。

表1ARGs檢測的PCR引物

Table 1Primers for ARGs detection with PCR

類型目標(biāo)基因5'端序列3'端序列退火溫度/℃參考文獻(xiàn)β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaCARB-4ACCGTATTGAGCCTGATTTAATTGAAGCCTGTGTTTGAGC55[13]blaSPM-1CTAAATCGAGAGCCCTGCT-TGCCTTTTCCGCGACCTTGATC53[14]blaTEM*TCCGCTCATGAGACAATA-ACCTTGGTCTGACAGTTAC-CAATGC55[15]喹諾酮類抗性基因qnrSACGACATTCGTCAACTGCAATAAATTGGCACCCTGTAGGC53[16]磺胺類抗性基因sulⅠTTCGGCATTCTGAATCTCACATGATCTAACCCTCGGTCTC53[17]sul2CGGCATCGTCAACATAACCTTGTGCGGATGAAGTCAGCTC66[18]dfrA1AGCATTACCCAACCGAAAGTTGTCAGCAAGATAGCCAGAT60[19]四環(huán)素類抗性基因tetAGGCGGTCTTCTTCATCATGCCGGCAGGCAGAGCAAGTAGA64[18]tetA/PCTTGGATTGCGGAAGAAGAGATATGCCCATTTAACCACGC55[20]tetCGCTGTAGGCATAGGCTTGGTGCCGGAAGCGAGAAGAATCA64[18]tetEGTTATTACGGGAGTTTGTT-GGAATACAACACCCACAC-TACGC55[20]tetLTCGTTAGCGTGCTGTCATTCGTATCCCACCAATGTAGCCG55[20]tetWGAGAGCCTGCTATATGC-CAGCGGGCGTATCCACAATGTTA-AC60[21]tetGGCTCGGTGGTATCTCTGCTCAGCAACAGAATCGGGAACAC55[21]tetXCAATAATTGGTGGTGGACCCTTCTTACCTTGGACATCCCG58[21]tetYATTTGTACCGGCAGAG-CAAACGGCGCTGCCGCCATTATGC55[21]紅霉素類抗性基因ermBGATACCGTTTACGAAATTGGGAATCGAGACTTGAGTGTGC58[22]Ⅰ類整合子intⅠ1CTGGATTTCGATCACG-GCACGACATGCGTGTAAAT-CATCGTCG60[20]

表2PCR反應(yīng)體系

Table 2PCR reaction system

試劑每管用量/μL2×TransStartTMFastPfuPCRSuperMix12.5上游引物(10μM·μL-1)1下游引物(10μM·μL-1)1ddH2O8.5模板體積1總體積25

從抗生素耐藥菌占可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的比例來看,大田土壤中四環(huán)素耐藥菌占總菌數(shù)比例的平均值為1.91%,顯著低于溫室土壤(P<0.05)。大田土壤中氨芐西林、環(huán)丙沙星、磺胺甲惡唑耐藥菌占總菌數(shù)的比例分別為4.90%、1.50%和20.47%,均與溫室土壤中這幾種抗生素耐藥菌的比例無顯著性差異(P>0.05)。林地土壤樣品中四環(huán)素、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星和磺胺甲惡唑的耐藥菌數(shù)量分別占總菌數(shù)的0.5%、0.8%、0.7%和7.9%,遠(yuǎn)低于大田和溫室土壤中耐藥菌的比例,這說明人工施肥后增加了土壤中抗生素耐藥菌的比例。

表3溫室土壤與大田土壤中抗生素耐藥菌數(shù)量及占總菌數(shù)的比例

Table 3Number of antibiotics resistant bacteria and percentage of antibiotics resistant bacteria to total bacteria in greenhouse soil and in field soil

耐藥菌類型 土壤類型活菌數(shù)(以干重計(jì))耐藥菌占總菌數(shù)的比例平均值1)/g-1標(biāo)準(zhǔn)差1)/g-1顯著性(P)2)平均值/%標(biāo)準(zhǔn)差/%顯著性(P)2)四環(huán)素耐藥菌大田8.47×1041.33×1050.0031.912.270.048溫室6.56×1055.18×1056.646.83氨芐西林耐藥菌大田2.21×1052.52×1050.0174.904.000.260溫室6.99×1055.29×1057.175.16環(huán)丙沙星耐藥菌大田6.19×1046.69×1040.1301.500.890.910溫室2.45×1052.37×1051.571.29磺胺甲惡唑耐藥菌大田5.20×1055.35×1050.18020.4712.470.470溫室3.89×1065.10×10615.736.55

1)以CFU計(jì)。2)為同種耐藥菌類型的大田與溫室土壤間某指標(biāo)的差異顯著性分析結(jié)果。

以上研究結(jié)果表明,無論是否施用有機(jī)肥,土壤中磺胺甲惡唑耐藥菌數(shù)量和占總菌數(shù)比例遠(yuǎn)高于四環(huán)素、氨芐西林和環(huán)丙沙星耐藥菌。長期施用有機(jī)肥的農(nóng)田土壤中,四環(huán)素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、磺胺甲惡唑耐藥菌占總菌數(shù)的比例遠(yuǎn)高于不施肥的林地土壤。由于溫室的有機(jī)肥施用量高于大田土壤,可能會造成溫室土壤中可培養(yǎng)四環(huán)素耐藥菌比例增高。

2.2土壤中ARGs的檢測結(jié)果

大田土壤檢出13種ARGs和1種Ⅰ類整合子intⅠ1(表4)?；前奉惪剐曰騭ulⅠ、sul2和四環(huán)素抗性基因tetL檢出率為100%,其中sulⅠ、sul2屬于目標(biāo)分流抗性基因,通過突變或者酶基因的缺失使抗生素?zé)o法作用于目標(biāo)酶[25-26],tetL屬于外排泵基因。四環(huán)素類編碼核糖體保護(hù)蛋白基因tetW也有很高的檢出率,為77.8%。4個(gè)外排泵機(jī)理的四環(huán)素抗性基因tetA、tetA/P[27]、tetC、tetG和1個(gè)酶修飾基因tetX也有不同程度的檢出[28]。β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaCARB-4、blaTEM*、紅霉素類抗性基因ermB和磺胺類抗性基因dfrA1也有一定的檢出。Ⅰ類整合子intⅠ1的檢出率為22.2%。

溫室土壤檢出14種ARGs和1種Ⅰ類整合子intⅠ1(表5)。磺胺類抗性基因sulⅠ、sul2和四環(huán)素抗性基因tetL檢測率為100%?；前奉惪剐曰騞frA1、四環(huán)素外排泵基因tetG和酶修飾基因tetX也有很高的檢出率,分別為77.8%、77.8%和66.7%。3個(gè)外排泵機(jī)理的四環(huán)素抗性基因tetA、tetA/P、tetC、tetG和1個(gè)編碼核糖體保護(hù)蛋白基因tetW,以及紅霉素類抗性基因ermB也有較高的檢出率。β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaCARB-4、blaTEM*和喹諾酮類抗性基因qnrS也有檢出,但檢出率較低。Ⅰ類整合子intⅠ1檢出率為55.6%。

表4大田土壤中抗性基因的檢測結(jié)果

Table 4ARGs detected in field soil

樣品β-內(nèi)酰胺類抗性基因喹諾酮類抗性基因磺胺類抗性基因四環(huán)素類抗性基因紅霉素類抗性基因Ⅰ類整合子blaCARB-4blaSPM-1blaTEM*qnrSsulⅠsul2dfrA1tetAtetA/PtetCtetEtetLtetWtetGtetXtetYermBintⅠ1A----++-----++-----B----++-----++-----C----++-----++++-+-D----+++----++++-+-E----++-----++-----F----++-----+-+--+-G--+-++-----+------H+-+-++++-+-++++-++I----++++++-++++--+CK------------------檢出率/%11.1022.2010010033.322.211.122.2010077.855.644.4044.422.2

+代表被檢出,-代表未被檢出。A～I(xiàn)分別為取自北京市延慶縣、海淀區(qū)、昌平區(qū)、順義區(qū)、平谷區(qū)、房山區(qū)、大興區(qū)和通州區(qū)蔬菜基地的大田土壤樣品;CK為對照(林地)土壤樣品。

表5溫室土壤中抗性基因的檢測結(jié)果

Table 5ARGs detected in greenhouse soil

樣品β-內(nèi)酰胺類抗性基因喹諾酮類抗性基因磺胺類抗性基因四環(huán)素類抗性基因紅霉素類抗性基因Ⅰ類整合子blaCARB-4blaSPM-1blaTEM*qnrSsulⅠsul2dfrA1tetAtetA/PtetCtetEtetLtetWtetGtetXtetYermBintⅠ1A----++++++-+-++-++B----++-----++-----C----++++-+-++++---D----+++-++-++++-++E----++-----++-----F----++++-+-+-++-++G--+-+++----+-++-++H+-+-++++++-++++-++I---++++-+--+-+----CK------------------檢出率/%11.1022.211.110010077.844.444.455.6010055.677.866.7055.655.6

+代表被檢出,-代表未被檢出。A～I(xiàn)分別為取自北京市延慶縣、海淀區(qū)、昌平區(qū)、順義區(qū)、平谷區(qū)、房山區(qū)、大興區(qū)和通州區(qū)蔬菜基地的溫室土壤樣品;CK為對照(林地)土壤樣品。

從表4～5還可看出,未施用有機(jī)肥的林地土壤(對照)18種ARGs的檢測結(jié)果均為陰性,而施用有機(jī)肥的大田土壤和溫室土壤中分別檢測出14和15種抗性基因,說明有機(jī)肥施用可能是造成農(nóng)田土壤ARGs污染的原因之一。

此外,無論是溫室還是大田土壤,磺胺類抗性基因sulⅠ、sul2的檢出率均為100%,表明它們在土壤環(huán)境中相當(dāng)穩(wěn)定,應(yīng)引起特別關(guān)注。這一結(jié)果與可培養(yǎng)耐藥菌中磺胺甲惡唑耐藥菌的比例較高相一致(表3)。四環(huán)素類3種抗性機(jī)制(外排泵抗性機(jī)制、核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制和酶修飾蛋白機(jī)制)的抗性基因在大田土壤和溫室土壤中均被不同程度檢出,且檢出率差別不大,說明農(nóng)田土壤中有機(jī)肥施用對不同機(jī)制四環(huán)素抗性基因的存在影響不大?；前奉惡退沫h(huán)素類抗生素是我國養(yǎng)殖業(yè)常用的抗生素[24]。通過糞肥施用,農(nóng)田土壤中這2類抗生素的耐藥菌和抗性基因分布較為廣泛。尤其是磺胺類抗生素為人工合成的一種抗菌藥物,微生物不能合成,因此土壤微生物獲得的磺胺抗性主要是由于進(jìn)入土壤中的磺胺類抗生素對土著微生物產(chǎn)生了選擇壓,誘導(dǎo)磺胺抗性基因的產(chǎn)生;或者是進(jìn)入土壤中的磺胺抗性基因通過橫向轉(zhuǎn)移使土著微生物獲得了磺胺抗性。

從ARGs種類的分布可以看出,大田土壤和溫室土壤中ARGs的種類區(qū)別不大,僅喹諾酮類抗性基因qnrS只能在溫室土壤檢出。從各種ARGs的檢出率可以看出,溫室土壤中ARGs檢出率比大田土壤高,這可能與有機(jī)肥施用量有關(guān)。溫室由于每年種植多茬蔬菜,施肥量遠(yuǎn)大于大田,因此造成溫室土壤ARGs檢出率高于大田土壤。溫室土壤中Ⅰ類整合子intⅠ1檢出率是大田土壤的2倍多。Ⅰ類整合子intⅠ1能夠控制細(xì)菌的外源性基因表達(dá),而被認(rèn)為是在ARGs傳播過程中起到重要作用的一類抗性基因[23,28]。由于Ⅰ類整合子intⅠ1在溫室土壤中具有較高的檢出率,因此,相比大田土壤,溫室土壤中的ARGs可能更容易橫向轉(zhuǎn)移,造成更大的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

糞肥的施用畜禽糞便不但能增加受納農(nóng)田土壤中某些抗生素耐藥菌的數(shù)量,而且可增加多種ARGs的檢出率,具有潛在的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)。因此,從ARGs的角度去評估有機(jī)肥的生態(tài)安全性是十分必要的。其次,還應(yīng)從ARGs消減的角度加強(qiáng)有機(jī)肥發(fā)酵工藝的研究,以降低ARGs的環(huán)境傳播風(fēng)險(xiǎn)[29]。

3結(jié)論

長期施用有機(jī)肥會增加土壤中可培養(yǎng)耐藥菌豐度,同樣會增加ARGs檢出率。溫室土壤中四環(huán)素耐藥菌占總菌數(shù)的比例約是大田土壤的3倍。溫室土壤和大田土壤之間氨芐西林耐藥菌、環(huán)丙沙星耐藥菌和磺胺甲惡唑耐藥菌占總菌數(shù)的比例無顯著性差異?；前奉惪剐曰騭ulⅠ、sul2和四環(huán)素抗性基因tetL在大田土和溫室土的檢出率都為100%。其他抗性基因,如四環(huán)素抗性基因tetA、tetA/P、tetC,紅霉素抗性基因ermB,以及Ⅰ類整合子(intⅠ1)均是溫室土壤的檢出率高于大田土壤。

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(責(zé)任編輯： 陳昕)

收稿日期：2015-06-10

基金項(xiàng)目：家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)資金(CARS-PSTP)；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX2014302)

通信作者①E-mail: wangxuming@baafs.net.cn

中圖分類號：X53

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-4831(2016)04-0664-06

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.04.023

作者簡介：張?zhí)m河(1971—),男,黑龍江雙鴨山人,教授,博士,主要從事環(huán)境生物技術(shù)方面的研究。E-mail: zhanglanhe@163.com

Pollution of Antibiotics Resistant Genes in Farmland Amended With Livestock Organic Manure.

ZHANG Lan-he1, WANG Jia-jia1,2, GAO Min2, QIU Tian-lei2, HAN Mei-lin2, WANG Xu-ming2

(1.College of Chemical Engineering, Northeast Dianli University, Jilin 132012, China；2.Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing 100097, China)

Abstract:In order to investigate distribution of antibiotics resistant genes (ARGs) in farmland soil amended with organic manure, soil samples from greenhouses and fields in nine vegetable production bases in the suburbs of Beijing were collected for analysis of antibiotics resistant bacteria and 18 types of ARGs. The analysis shows that the soil samples from greenhouses were higher than those from fields in proportion of tetracycline resistant bacteria to total bacteria in count (P<0.05), and little difference was found between the two groups of soil samples in proportion of ampicillin, sulfa methoxazole and ciprofloxacin resistant bacteria to total bacteria in count. Sulfanilamide resistant genes (sulⅠ and sul2) and tetracycline resistance genes (tetL) were detected in all the soil samples, whereas tetracycline resistant genes (tetA, tetA/P and tetC), erythromycin resistant genes (ermB), and I integron (intⅠ1) were detected with a higher detectable rate in greenhouse soil than in field soil, which may be associated with more organic manure applied to the former than to the latter.Key words:soil;organic manure;antibiotics resistant bacteria;antibiotics resistant genes