于立權，張祥濤，姜自慶，李鳳華，朱金艷，寧芮奇，崔玉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶163319；2.山東聯(lián)創(chuàng)建筑（礦業(yè)）設計有限公司；3.富裕光明生態(tài)示范奶牛養(yǎng)殖有限公司；4.大連三儀集團生物工程研究所；5.莊河市食品檢驗監(jiān)測中心）

EDTA對殼聚糖的抑菌增效研究

于立權1，張祥濤2，姜自慶3，李鳳華4，朱金艷5，寧芮奇1，崔玉東1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶163319；2.山東聯(lián)創(chuàng)建筑（礦業(yè)）設計有限公司；3.富裕光明生態(tài)示范奶牛養(yǎng)殖有限公司；4.大連三儀集團生物工程研究所；5.莊河市食品檢驗監(jiān)測中心）

為了研究殼聚糖與EDTA的協(xié)同抗菌效果，采用體外藥敏片擴散法和抑菌效應方法，測試了殼聚糖和EDTA聯(lián)合應用后對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制效應，來考察EDTA對殼聚糖的抑菌增強效果。結果表明，與殼聚糖對照組相比，殼聚糖和EDTA聯(lián)合應用能增強殼聚糖對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制殺傷作用，且對大腸桿菌的抑制殺傷效應更加明顯。表明EDTA能夠增強殼聚糖對細菌、真菌的抑制效應，為開發(fā)一種新型的抗菌劑提供了試驗依據(jù)。

殼聚糖；EDTA；抑菌增效取

殼聚糖（Chitosan）為甲殼素脫乙?；a(chǎn)物，是自然界唯一大量存在的堿性氨基多糖，具有良好的生物降解性、生物相容性和哺乳動物細胞低毒性［1-3］。近年來，有關殼聚糖及其聚合物抗菌性能的報道較多［4-6］，證實了殼聚糖具有天然的廣譜抗菌性能。EDTA是一種常見的膜通透性促進劑，可以與維持細胞膜結構和功能的必須成分如Ca2+、Mg2+等2價陽離子絡合，從而導致細胞流動性和通透性增加，促進藥物進入細胞內(nèi)。有研究發(fā)現(xiàn)，EDTA與乳鏈菌肽和溶菌酶等聯(lián)用時能增強對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，沙門氏菌和李斯特菌等的抑菌殺菌效果［7］，特別是在抗菌藥物中加入EDTA能夠恢復多重耐藥細菌對藥物的敏感性［8］。

白色念珠菌是人體重要的機會性致病菌，也是人們飲食鏈條（特別是奶制品）中不可忽視的病原真菌［9］。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌污染食品、水源的機會較多，常引起疾病暴發(fā)流行［10-11］?；跉ぞ厶橇己玫目咕钚?，考察了殼聚糖與EDTA聯(lián)用后對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白念珠菌的抑菌效應，可為進一步開發(fā)殼聚糖基的細菌、真菌高效安全的抗菌劑提供有力數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌Newman菌株，大腸桿菌O157∶H7菌株，白色念珠菌RM1000菌株均由黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院微生物制藥實驗室提供。殼聚糖為杭州富麗生物科技有限公司產(chǎn)品。EDTA為南方東方之珠工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。酮康唑藥片（每片0.2 g）為西安楊森制藥有限公司產(chǎn)品。紅霉素為上海士鋒生物科技有限公司產(chǎn)品。氨芐青霉素為南京奧多福尼生物科技有限公司。YPD培養(yǎng)基（胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母抽提物1%，）用于培養(yǎng)白色念珠菌；LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%）用于培養(yǎng)大腸桿菌；TSB培養(yǎng)基為美國Dickinson and Company（BD）公司產(chǎn)品；固體培養(yǎng)基所用瓊脂粉由北京奧博生物技術責任有限公司提供。

1.1.2 主要儀器

FA2004N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；超凈工作臺，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株復蘇與活化

用滅菌的Tip頭分別蘸取-70℃保存的白色念珠菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株和大腸桿菌菌液，在相應的YPD、TSB和LB固體培養(yǎng)基上密布劃線后置于35℃恒溫培養(yǎng)箱復蘇培養(yǎng)。待長出單菌落后，挑取單菌落，在相應的固體培養(yǎng)基上三線法劃線，培養(yǎng)活化出單菌落。挑取單菌落接種到相應的1 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600=0.4～0.6）。

1.2.2 殼聚糖醋酸液（Chitosan-acetate）和EDTA貯液的配制

稱取殼聚糖，溶于1.5%的醋酸溶液中，調(diào)pH值為4，最終配制成40 g·L-1的貯存液。稱取EDTA溶于8%的氫氧化鈉（g·mL-1）中，配制成100 g·L-1的貯存液。取殼聚糖醋酸貯存液和EDTA貯存液，配置Chitosan-EDTA混合液使用藥液，分別為CE1（Chitosan終濃度為1 g·L-1，EDTA終濃度為1 g·L-1，pH為4）和CE2（Chitosan終濃度分別為0.5 g·L-1，EDTA終濃度為1 g·L-1，pH為4）。將用作測試白念珠菌敏感性試驗的陽性對照酮康唑藥片（每片0.2 g）充分研磨成粉末后，用甲醇配制0.25 g·L-1酮康唑濃度的藥液，0.45 μm濾膜過濾后備用。

1.2.3 不同藥液濃度的藥敏片制備

參照文獻［12］，用打孔器（孔徑為6 mm）在濾紙上打孔，制備直徑為6 mm的圓形濾紙片，裝入干凈的西林瓶中，高壓滅菌，超凈臺上烘干，4℃保存。

分別將CE1藥液、CE2藥液、1 g·L-1的殼聚糖藥液（C1）、0.5 g·L-1的殼聚糖藥液（C2）、1 g·L-1的EDTA液（E）、0.25 g·L-1的酮康唑藥液（測試白念珠菌敏感性陽性對照）或0.015 g·L-1的紅霉素藥液（測試金黃色葡萄球菌敏感性陽性對照）或和0.01 g·L-1的氨芐青霉素藥液（測試大腸桿菌敏感性陽性對照）（K，代表三種陽性對照中的任意一種）加入青霉素瓶中，（藥液的多少以浸透紙片為宜），將多余的藥液倒掉，無菌超凈臺上晾干或放在37℃的恒溫箱內(nèi)烘干，加蓋后置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 敏感性試驗

取對數(shù)生長期的白色念珠菌RM1000、金黃色葡萄球菌Newman和大腸桿菌O157：H7菌液10 μL，加入到含有140 μL滅菌水的eppendorf管中充分混勻后，L玻璃棒均勻涂布在YDD、TSB和LB平板上，待菌液完全吸收后，將平板平均劃分4個區(qū)域，分別貼上將CE1、CE2、C1、C2、E和K藥敏片，在平板中心圓點貼上無菌水處理的紙片做陰性對照。35℃下培養(yǎng)24 h。試驗重復三次。

1.2.5 殺菌效應測定

用滅菌蒸餾水將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液調(diào)整至1×106CFU·mL-1，取1 mL菌液加入到上述不同濃度的藥液中，分別作用和培養(yǎng)0 min，5 min，10 min和20 min，1∶100倍體積培養(yǎng)基稀釋后，取50 μL液體涂布到相應平板中，35℃下培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)。

1.2.6 結果判讀

肉眼觀察抑菌圈大小。游標卡尺測定抑菌圈直徑，每個抑菌圈在兩個方向各測量兩次，取其平均值，Excel軟件處理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析結果。菌落計數(shù)用筆型細菌計數(shù)器進行計數(shù)。

2 結果與分析

2.1 EDTA增強病原菌對殼聚糖的敏感性

為研究添加EDTA后Chitosan對病原菌的抑菌效應，我們選取了革蘭氏陰性細菌大腸桿菌，革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球和病原真菌白色念珠菌為測試代表菌株，進行三次重復試驗，獲得的抑菌圈數(shù)據(jù)取平均值，進行統(tǒng)計分析。與0.5 g·L-1的Chitosan和1 g·L-1EDTA相比，添加1 g·L-1的EDTA后，Chitosan對于白念珠菌和大腸桿菌的抑菌效應明顯增強，差異顯著（P＜0.01）。但對于金黃色葡萄球菌，抑菌效果有所增強但差異不顯著（P＞0.05）（圖1）。已有研究表明，chitosan的抑菌效果不呈現(xiàn)劑量效應［6］。為了考察在添加1 g·L-1的EDTA后Chitosan的抑菌效果是否具有劑量效應，我們將Chitosan濃度增加到1 g·L-1，發(fā)現(xiàn)添加EDTA后，Chitosan的抑菌活性并沒有顯著增強（圖1），說明chitosan聯(lián)合EDTA后的抑菌活性不呈現(xiàn)劑量效應。

圖1 EDTA增強病原菌對殼聚糖的敏感性Fig.1 Enhanced sensitivity of pathogen against chitosan with EDTA

2.2 EDTA增強殼聚糖對病原菌的抑菌效應

為進一步研究添加EDTA后chitosan對病原菌的增強抑制效應，我們通過抑菌效應方法測試了藥液對三種病原菌增殖和存活的影響。試驗結果發(fā)現(xiàn)，與金黃色葡萄球菌（圖2）相比，添加1 g·L-1的EDTA的chitosan溶液能夠在很快抑制白色念珠菌（圖3）和大腸桿菌（圖4）。與各組陽性對照組相比，1 g·L-1的EDTA的chitosan溶液能在20 min內(nèi)達到殺傷病原菌效應（圖2，3和4）。添加1 g·L-1的EDTA后，1 g·L-1的較高濃度殼聚糖溶液的抑菌效應和0.5 g·L-1的較低濃度殼聚糖藥液的抑菌效應相當，這一結果與抑菌圈試驗結果吻合（圖1）。

3 討論

殼聚糖能夠結合一些微生物正常生長所必需的微量元素、金屬元素或營養(yǎng)物質(zhì)以及DNA分子，在酸性條件下，低分子量殼聚糖能破壞細菌細胞壁和細胞膜上的負電荷分布，干擾細胞壁的合成，使細胞壁趨向溶解，高分子質(zhì)量殼聚糖發(fā)揮絮凝劑作用。因而，殼聚糖殺菌和抑菌作用受到廣泛關注［2］。EDTA是一種膜通透性促進劑，能增強藥物轉(zhuǎn)運［7］。試驗首次采用低分子量殼聚糖，研究EDTA作用下殼聚糖是否對病原菌的抑菌效應有所增強。試驗結果表明，EDTA能夠增強殼聚糖抑菌效應，但不存在劑量依賴性。同時，EDTA對殼聚糖的抑菌增效也明顯好于酮康唑組，這可能是由于EDTA增強了殼聚糖干擾細胞壁合成作用或者強化了殼聚糖的絮凝作用，其真實的聯(lián)合作用機制有待于進一步探索?？傊?，試驗為進一步評價殼聚糖和EDTA作為臨床應用的抗菌復合劑提供了實驗依據(jù)，對于抗耐藥菌株新型藥物研發(fā)具有很高的研究價值。

圖2 EDTA對Chitosan抑制金黃色葡萄球菌的增強效應Fig.2 Enhanced effect of S.aureus against chitosan with EDTA

圖3 EDTA對Chitosan抑制白色念珠菌的增強效應Fig.3 Enhanced effect of C.albicans against chitosan with EDTA

圖4 EDTA對Chitosan抑制大腸桿菌的增強效應Fig.4 Enhanced effect of E.coli against chitosan with EDTA

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Antibacterial and Synergistic Effect of EDTA on Chitosan

Yu Liquan1，Zhang Xiangtao2，Jiang Ziqing3，Li Fenghua4，Zhu Jinyan5，Ning Ruiqi1，Cui Yudong1
（1.College of Life Science and Biotechnology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Shandong Lianchuang（mining）Architectural Design Co.，LTD；3.Fuyu Brightdairy Ecological Demonstration Co.，LTD；4.Biological Engineering Research Institute，DALIAN SAM Group；5.Food Inspection and Testing Center of Zhuanghe）

The antibacterial synergy of chitosan and EDTA in combination was investigated using vitro diffusion method and killing time.Three kinds of bacteria，E.coli，S.aureus and C.albicans，were tested.The results showed that chitosan and EDTA in combination could enhance the inhibitory effect on tested bacteria.The synergic efficacy of chitosan and EDTA in combination against E.coli was found to be especially significant.It demonstrated that EDTA could enhance the inhibitory effect of Chitosan on bacteria and fungi. This study provided the experimental data for the development of a novel antibacterial agent.

chitosan；EDTA；antibacterial and synergistic effect

S182

A

1002-2090（2016）03-0095-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.019

2015-04-13

黑龍江八一農(nóng)墾大學“博士科研啟動基金”（校啟2011YB-15）；黑龍江八一農(nóng)墾大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（XC2014060）。

于立權（1974-），男，講師，天津大學畢業(yè)，現(xiàn)主要從事病原微生物致病機理及新藥研發(fā)工作。