孫麗芳，王振，王霞，鄧杰，胡凱鳳，王婧擇，楊克軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶163319）

玉米不育系回交轉(zhuǎn)育群體遺傳連鎖圖譜的比較分析

孫麗芳，王振，王霞，鄧杰，胡凱鳳，王婧擇，楊克軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶163319）

以玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育系cms-合344為試驗(yàn)材料，輻63018為輪回親本構(gòu)建BC1F1群體和BC2F1群體，并分別構(gòu)建SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。結(jié)果表明，331對(duì)SSR標(biāo)記中有60對(duì)標(biāo)記在兩親本間呈現(xiàn)穩(wěn)定多態(tài)性；BC1F1群體覆蓋玉米基因組總長(zhǎng)度為1 637.38 cM，標(biāo)記間平均圖距為27.29 cM，BC2F1群體覆蓋玉米基因組總長(zhǎng)度為1 183.64 cM，標(biāo)記間平均圖距為19.73 cM；兩個(gè)圖譜的每條染色體標(biāo)記數(shù)目和種類一致，然而各標(biāo)記位置發(fā)生明顯變化。研究為玉米不育系回交轉(zhuǎn)育分子輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

玉米；回交轉(zhuǎn)育；遺傳連鎖圖譜

遺傳圖譜是進(jìn)行農(nóng)藝性狀QTL定位、分子標(biāo)記輔助選擇育種、種質(zhì)資源多樣性分析等方面研究重要基石［1-2］。玉米是我國(guó)重要的糧食作物，為異花授粉作物，天然異交率在90%以上，雜交制種是保證大田生產(chǎn)用種質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。選育不育系，利用三系配套制種不但有效保證種子質(zhì)量，而且極大降低生產(chǎn)成本。在作物育種實(shí)踐中，不育系的獲得可以通過(guò)回交轉(zhuǎn)育，然而該方法至少需要4～5個(gè)世代才能成功轉(zhuǎn)移性狀。1975年以前玉米遺傳分析主要依賴于后代性狀表現(xiàn)及分離情況等傳統(tǒng)方法。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，在回交育種方法上分子標(biāo)記輔助選擇極大地提高了選擇效率縮短回交世代［3-4］。目前，利用分子標(biāo)記輔助選擇、構(gòu)建遺傳圖譜以及基因定位已經(jīng)做了很多工作［5-7］。研究發(fā)現(xiàn)，SSR標(biāo)記對(duì)日本栽培小豆地方品種×野生小豆的回交BC1F1群體作圖，205個(gè)SSR覆蓋11個(gè)連鎖群，總程度832.1 cM，平均間距為1.85 cM［8］。然而利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇玉米不育系回交轉(zhuǎn)育后代的研究還未見(jiàn)報(bào)道，研究以不育系和欲轉(zhuǎn)育為不育系的優(yōu)良自交系為試驗(yàn)材料，進(jìn)行雜交和回交獲得回交一代和回交二代分離群體，進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建，旨在對(duì)不同回交世代遺傳連鎖圖譜進(jìn)行比較和分析，為進(jìn)一步進(jìn)行基因定位和分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

cms-合344：細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)密山試驗(yàn)實(shí)習(xí)基地選育；輻63018：由黑龍江省農(nóng)科院玉米所輻射育種室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

2012年以玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育系cms-合344為母本與輻63018進(jìn)行雜交，2013年種植F1與父本進(jìn)行回交，獲得BC1F1。2013年10月隨機(jī)取200粒BC1F1種子和父本輻63018在海南進(jìn)行回交加代，共獲得120株BC2F1回交后代。

在室內(nèi)隨機(jī)取BC1F1和BC2F1兩世代種子各200粒發(fā)芽，提取單株基因組DNA，最后兩世代各保留150株構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

1.3 DNA提取及SSR標(biāo)記分析

將取回的葉片放入研缽中，加入液氮后迅速研磨至粉末，玉米基因組總DNA的提取參照張玉胡CTAB方法并略有改動(dòng)。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量濃度，用TE緩沖液將DNA工作液的濃度調(diào)至100 ng·μL-1于4℃保存，保存液濃度為300 ng·μL-1于-20℃保存。

SSR引物序列信息摘自玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.maizegdb.org/ssr.php），并由北京華大基因科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為10 μL，ddH2O 5.6 μL， 10×PCR buffer 1.0 μL，dNTP（2.5 mM each）1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR Taq（5 μ·μL-1）0.2 μL，DNA（100 ng·μL-1）1.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；12℃保存。擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 SSR帶型統(tǒng)計(jì)分析

待膠片取出后置于燈箱上進(jìn)行觀察、照相。對(duì)條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并記錄。根據(jù)篩選出的具有多態(tài)性的SSR引物擴(kuò)增結(jié)果，在相同的遷移位置上，群體中帶型與輪回親本帶型相同者賦值為“0”，為兩親本共同擁有的雜合帶型賦值為“1”，缺失的標(biāo)記賦值為“-1”。利用EXCEL2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

將統(tǒng)計(jì)好的符合要求的數(shù)據(jù)采用QTLIcimapping4.0軟件，對(duì)BC1F1、BC2F1群體的SSR標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行遺傳連鎖分析，按照LOD臨界值3.00標(biāo)準(zhǔn)分群，采用Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間多態(tài)性引物篩選

隨機(jī)選用玉米10條染色體上的SSR引物331對(duì)，對(duì)cms-合344和輻63018兩親本進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，選出具有多態(tài)性標(biāo)記SSR引物60對(duì)（表1），占篩選引物總數(shù)的18.13%。

多態(tài)性SSR引物的選擇，兩親本間存在明顯的差異條帶，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上帶型清晰可見(jiàn)，60對(duì)SSR引物對(duì)BC1F1和BC2F1兩群體進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，所篩選出的引物均能在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測(cè)到穩(wěn)定的產(chǎn)物條帶。根據(jù)擴(kuò)增出的電泳條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算遺傳背景回復(fù)率。見(jiàn)圖1。

圖1 SSR標(biāo)記um c2067在玉米（cm s-合344×輻63018）回交后代群體中擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.1 The results of amplified by umc2067 in backcross progeny group

表1 60對(duì)SSR引物及其圖譜位置Table 1 60 pairs of SSR primers and their map location

2.2 兩群體遺傳連鎖圖譜的比較

根據(jù)60對(duì)SSR引物的擴(kuò)增信息，用QTLIcimapping4.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，BC1F1和BC2F1遺傳連鎖圖譜如圖2和圖3所示，標(biāo)記在染色體上的分布情況如表2所示。根據(jù)經(jīng)典形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR標(biāo)記位點(diǎn)的結(jié)果，60個(gè)SSR標(biāo)記全部可以分布到10條染色體上。從兩遺傳連鎖圖譜可以看出，兩圖譜在個(gè)別染色體上的標(biāo)記位置以及在基因組覆蓋程度上均存在明顯的變化。BC1F1遺傳連鎖圖譜覆蓋玉米基因組總長(zhǎng)度為1 637.38 cM，標(biāo)記間平均圖距為27.29 cM。其中第二條染色體上的標(biāo)記最多，為11個(gè)標(biāo)記，覆蓋染色體225.85 cM，標(biāo)記間平均圖距為20.53 cM；第4、6和第7條染色體上的標(biāo)記最少，都為3個(gè)標(biāo)記，覆蓋染色體分別為84.55 cM、135.70 cM和70.36 cM，標(biāo)記間平均圖距為28.18 cM、45.23 cM和23.45 cM。在10條連鎖群中最大標(biāo)記間距離在第1條染色體上，標(biāo)記間距離為124.07 cM，最小標(biāo)記間距離在第8條染色體上，標(biāo)記間距離為2.95 cM（圖2）。

BC2F1遺傳連鎖圖譜覆蓋玉米基因組長(zhǎng)度為1 183.64 cM，標(biāo)記間平均圖距為19.73 cM。在第二條染色體上的標(biāo)記數(shù)目最多為11個(gè)，覆蓋染色體長(zhǎng)度為207.9 cM，標(biāo)記間平均圖距為18.90 cM；在4、6和第7條染色體上的標(biāo)記最少，各為3條，覆蓋染色體長(zhǎng)度分別為90.63 cM、99.71 cM和50.47 cM，標(biāo)記間平均圖距分別為30.21 cM、33.24 cM和16.82 cM。在10條染色體中最大標(biāo)記間距離在第4條染色體上，標(biāo)記間距離為77.65 cM，最小標(biāo)記間距離在第3條染色體上，標(biāo)記間距離為2.72 cM（圖3）。

另外，從表2中可以看出在每條染色體上BC2F1遺傳連鎖圖譜覆蓋玉米基因組長(zhǎng)度和平均圖距都要小于BC1F1群體。同時(shí)，比較圖2和圖3可以發(fā)現(xiàn)，在每條染色體上BC1F1和BC2F1的標(biāo)記數(shù)目和種類是一致，而標(biāo)記的位置發(fā)生明顯變化，如在第1條染色體的標(biāo)記umc1774在BC1F1群體圖譜位置為0.0 cM，而該標(biāo)記在BC2F1群體圖譜位置為163.53 cM。

表2 BC1F1和BC2F1群體遺傳連鎖圖譜染色體上的標(biāo)記分布情況Table 2 Distribution of markers on chromosome of genetic linkage map in BC1F1 and BC2F1 populations

圖2 BC1F1遺傳連鎖圖譜Fig.2 BC1F1 genetic linkage map

圖3 BC2F1遺傳連鎖圖譜Fig.3 BC2F1 genetic linkage map

3 結(jié)論與討論

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的問(wèn)世，Helentjaris構(gòu)建了首張玉米R(shí)FLP連鎖圖譜，但由于該標(biāo)記技術(shù)費(fèi)用昂貴、信息量小、操作時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)逐漸被淘汰［9，10］。微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，即SSR標(biāo)記廣泛存在于真核生物中，具有多態(tài)性豐富、共顯性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)正大量應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、品種純度鑒定以及物種進(jìn)化等方面的研究［8］。實(shí)驗(yàn)以玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育系cms-合344和輻63018為試驗(yàn)材料，以輻63018為輪回親本構(gòu)建BC1F1群體和BC2F1群體，利用60對(duì)在兩親本間呈現(xiàn)多態(tài)性的SSR標(biāo)記，構(gòu)建兩個(gè)世代群體遺傳圖譜。BC1F1群體覆蓋玉米基因組總長(zhǎng)度為1 637.38 cM，標(biāo)記間平均圖距為27.29 cM，BC2F1群體覆蓋玉米基因組總長(zhǎng)度為1 183.64 cM，標(biāo)記間平均圖距為19.73 cM，分析兩個(gè)群體圖譜間的差異是由于BC2F1經(jīng)回交兩代后群體內(nèi)雜合度降低而導(dǎo)致標(biāo)記交換的可能性變小，最終使得覆蓋長(zhǎng)度和平均圖距減少。圖譜為玉米不育系回交群體的分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于發(fā)掘雙親之間其他優(yōu)異農(nóng)藝性狀基因資源具有非常重要的價(jià)值。

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Comparative Analysis of Genetic Linkage M ap of M aize Sterile Line Backcross Transformation Populations

Sun Lifang，W ang Zhen，W ang Xia，Deng Jie，Hu Kaifeng，W ang Jingze，Yang Kejun
（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Maize sterile line CMS-He as materials，344BC1F1 and BC2F1 populations were built by using Fu63018 as recurrent parent and their SSR markers genetic linkage maps were obtained.The results showed that a total of 60 pair markers displayed steady polymorphism between two parents；the BC1F1 group covered 1 637.38 cM length of maize genome，and the BC2F1 group covered 1 183.64 cM，the average marker interval was 27.29 cM and 19.73 cM，respectively；the number and type of markers in each chromosome were consistent with two maps，but the position of each marker was changed.The analysis laid the theoretical basis for molecular assisted selection of maize sterile line backcross transportation.

maize；backcross；genetic linkage map

S513

A

1002-2090（2016）03-0001-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.001

2015-07-15

農(nóng)業(yè)部公益性項(xiàng)目（201303007）；黑龍江省青年科學(xué)基金（QC2015029）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)作物學(xué)科學(xué)技術(shù)骨干科研啟動(dòng)項(xiàng)目（ZWXQDJ-6）。

孫麗芳（1981-），女，講師，吉林大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事玉米遺傳育種方面的研究工作。

楊克軍，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：byndykj@163.com。