賀川江， 張淑英， 李先榮， 金曉梅

(1．石河子市園林研究所，新疆石河子 832000；2．石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003)

?

東北紅豆杉抗寒性分析

賀川江1， 張淑英2*， 李先榮1， 金曉梅1

(1．石河子市園林研究所，新疆石河子 832000；2．石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003)

摘要[目的]分析東北紅豆杉在引種地新疆石河子的抗寒性。[方法]通過5個(gè)低溫處理試驗(yàn)，測(cè)定葉片葉綠素含量、丙二醛(MDA)、游離脯氨酸(Pro)、超氧物歧化酶(SOD)活性、質(zhì)膜透性、可溶性糖(SS)指標(biāo)。[結(jié)果]隨著溫度降低，東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量和SOD活性依次降低，而質(zhì)膜透性、Pro、MDA和SS含量遞增。[結(jié)論]東北紅豆杉對(duì)-30 ℃低溫具有較好的抗逆性。

關(guān)鍵詞東北紅豆杉；抗寒性；低溫

東北紅豆杉(Taxus cuspidateSieb.etZucc.)又稱紫杉、赤柏松，為紅豆杉科紅豆杉屬常綠針葉喬木，原產(chǎn)于我國東北的長(zhǎng)白山等地。東北紅豆杉兼具藥用、材用和觀賞價(jià)值[1]，其自然分布零星、稀少，是瀕臨滅絕的國家一級(jí)保護(hù)樹種。為了增加?xùn)|北紅豆杉種群數(shù)量，擴(kuò)大其地理分布范圍，保護(hù)并更好地開發(fā)利用東北紅豆杉資源，科研人員將東北紅豆杉引種到新疆的石河子。低溫凍害等非生物脅迫是新疆常見的逆境因子，也是影響新疆植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因素[2-4]。為給石河子開展東北紅豆杉的引種馴化、繁育促培及種植推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，筆者就引種的東北紅豆杉苗對(duì)新疆低溫凍害等逆境因子的生理響應(yīng)進(jìn)行了試驗(yàn)分析。

1材料與方法

1.1供試材料試驗(yàn)所用的植物材料為新疆石河子市園林研究所從東北吉林通化長(zhǎng)白山區(qū)引種栽培的5年生東北紅豆杉。將東北紅豆杉苗栽培在規(guī)格為21cm×21cm盆缽內(nèi)，每缽留苗1株，置于露地養(yǎng)護(hù)。盆栽土壤取自石河子市園林研究所院內(nèi)肥料池，按肥料土∶腐熟鋸末∶細(xì)沙=10∶3∶1配制。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置5個(gè)溫度處理，分別為20(CK)、-30、-35、-40、-45 ℃，記為處理①～⑤。將東北紅豆杉缽苗先置于光照培養(yǎng)箱中降溫至0 ℃后，再搬入超低溫冰柜中開始進(jìn)行低溫處理，各處理采取逐漸降溫的方法(即每天降溫5 ℃，待2d后小苗適應(yīng)低溫，繼續(xù)降溫)。低溫處理2～3d后取樣，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分別對(duì)葉片質(zhì)膜透性(電導(dǎo)率)、葉綠素、超氧物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸(Pro)含量、可溶性糖(SS)含量進(jìn)行測(cè)試分析。

1.3取樣方法

1.3.1葉綠素測(cè)定取樣。從每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選定2株幼苗，摘下功能葉片，剪碎，測(cè)定葉綠素a、b含量。

1.3.2酶活性測(cè)定取樣。摘取處理后的東北紅豆杉功能葉片，剪碎，定量稱取后，用錫箔紙包裹，編號(hào)，液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍儲(chǔ)藏，待測(cè)定。

1.4測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1葉綠素含量。葉綠素含量測(cè)定采用乙醇丙酮混合法[5]。稱取0.20g新鮮葉片于25mL容量瓶?jī)?nèi)，加乙醇(95%)∶丙酮(50%)=1∶1的浸提液25mL，封口，于暗處浸提36h，至葉片呈白色，其間每隔12h振蕩片刻，使色素均勻分布于乙醇丙酮混合溶液中，分別在663、645nm處測(cè)定吸光度。

葉綠素a=12.72OD663-2.59OD645

(1)

葉綠素b=22.88OD645-4.67OD663

(2)

葉綠素=葉綠素a+葉綠素b

(3)

葉綠素含量=色素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù) / 樣品鮮重

(4)

1.4.2丙二醛(MDA)含量。MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[6]。吸取預(yù)先提取的粗酶液2mL，加入2mL0.6%的TBA(溶于10%的三氯乙酸)溶液，將混合物置于沸水浴中反應(yīng)15min，然后快速在冰浴上冷卻，在40 000r/min離心10min，取上清液于450、532、600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)MDA在532nm處的毫摩爾消光系數(shù)為155換算出提取液中MDA濃度。

1.4.3脯氨酸(Pro)含量。采用茚三酮比色法[7]測(cè)定Pro的含量。取0.400～0.450g鮮樣于大試管中，加入5mL3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min，待冷卻至室溫后，吸取上清液2mL，加2mL冰乙酸和3mL2.5%酸性茚三酮顯色液，于沸水浴中加熱40min，冷卻后向各試管中加入5mL甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜止待分層后吸取甲苯層，在波長(zhǎng)520nm下比色。

1.4.4超氧化物歧化酶(SOD)活性。用氮藍(lán)四唑光化學(xué)還原法[7]測(cè)定SOD活性。酶液提?。悍Q取0.400～0.450g葉樣，加入少許石英砂、1%(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮 (PVPP)，分次加入8mL50mmol/LpH6.8磷酸緩沖液于冰浴上研磨成勻漿，4 ℃下離心20min，上清液用于SOD活性的測(cè)定。

1.4.5質(zhì)膜透性。用電導(dǎo)率儀法測(cè)定質(zhì)膜透性[5]。將東北紅豆杉功能葉用去離子水清洗3次以去除葉片表面黏附的電解質(zhì)。用直徑5mm的打孔器避開主脈取樣，混合均勻。每個(gè)重復(fù)取6片放入50mL三角瓶中，裝30mL去離子水，在25 ℃旋轉(zhuǎn)搖床上溫浴24h之后測(cè)定電導(dǎo)率(Lt)，然后煮沸20min，用流動(dòng)自來水進(jìn)行冷卻，立即測(cè)定各處理的煮后電導(dǎo)率(Lo)。

質(zhì)膜透性=Lt/Lo×100%

(5)

1.4.6可溶性糖(SS)含量。SS含量的測(cè)定采用蒽酮比色法[8]。

1.4.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

(1)1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液。將分析純蔗糖在80 ℃下烘至恒重，精確稱取1.000g。加少量水溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加入0.5mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。

(2)100μg/L蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1mL加入100mL容量瓶中，加水至刻度。取20mL刻度試管11支，從0～10分別編號(hào)，分為6組(含空白),對(duì)應(yīng)6個(gè)處理，除空白外,各處理重復(fù)2次，按表1加入溶液和水。

表1蒽酮法測(cè)SS標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑量

Table1Dosagesofthesolublesugarstandardcurvebyanthronemethod

管號(hào)Tubecode100μg/L蔗糖液100μg/Lsucrosesolution∥mL水WatermL蔗糖量Sucroseamountμg002.001/20.21.8203/40.412.6405/60.61.4607/80.81.2809/101.01.0100

按順序向試管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管均準(zhǔn)確保溫1min,取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。

1.4.6.2SS的提取。取新鮮東北紅豆杉葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.10～0.30g，共3份。分別放入3支刻度試管中，加入5～10mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min(提取2次)，將提取液過濾入25mL容量瓶中，反復(fù)漂洗試管及殘?jiān)?，定容至刻度?/p>

1.4.6.3顯色測(cè)定。吸取樣品提取液0.5mL于20mL刻度試管中(重復(fù)3次)，加蒸餾水1.5mL，以下步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定相同，測(cè)定樣品的吸光度，計(jì)算SS含量。

SS含量=從回歸方程求得糖的量/吸取樣品液體積×提取液量×稀釋倍數(shù)/(樣品干重×106)×100%

(6)

1.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用SPSS軟件(10.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Excel生成圖表。

2結(jié)果與分析

2.1低溫對(duì)東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量的影響由表2可知，低溫對(duì)東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素a含量有明顯影響。隨著溫度的降低，葉綠素a含量依次遞減。其中，葉綠素a含量最低的為-45 ℃低溫處理，比對(duì)照降低0.677mg/g，為對(duì)照的46.73%。低溫對(duì)東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素b含量的影響與葉綠素a基本相似，即隨著溫度的降低，葉綠素b含量依次遞減，其中，葉綠素b含量最低的仍為-45 ℃低溫處理，比對(duì)照降低0.302mg/g，為對(duì)照的27.40%。低溫對(duì)東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量的影響為隨著溫度的降低，葉綠素含量依次遞減，-45 ℃低溫處理比對(duì)照降低0.979mg/g，為對(duì)照的42.00%。

表2不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量

Table2ChlorophyllcontentinT. cuspidateleavesindifferenttreatments

mg/g

2.2低溫對(duì)東北紅豆杉葉片內(nèi)MDA含量的影響由圖1可知，隨著低溫凍害的加劇，東北紅豆杉葉片內(nèi)MDA含量逐漸增加，其中，-30 ℃低溫處理MDA含量較對(duì)照上升0.9μmol/L，而-45 ℃低溫處理MDA含量較對(duì)照增加5.8μmol/L，說明隨著溫度降低，東北紅豆杉膜脂過氧化作用越來越嚴(yán)重。

圖1　不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)MDA含量Fig. 1　Effects of different treatments on the MDA content of T. cuspidate leaves

2.3低溫對(duì)東北紅豆杉葉片內(nèi)Pro含量的影響由圖2可知，在低溫脅迫條件下，東北紅豆杉體內(nèi)Pro含量迅速上升。-45 ℃低溫處理時(shí)，Pro含量為對(duì)照的5.31倍。

圖2　不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)Pro含量Fig. 2　Effects of different treatments on the free proline content of T. cuspidate leaves

2.4低溫對(duì)東北紅豆杉葉片內(nèi)SOD活性的影響由圖3可知，低溫能增加?xùn)|北紅豆杉體內(nèi)活性氧的含量，降低了SOD活性。隨著處理溫度的降低，SOD活性呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照相比，隨著溫度的降低，SOD活性降低了16.55%～69.01%，下降最顯著為-45 ℃低溫處理。

圖3　不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)SOD活性Fig. 3　Effects of different treatments on the SOD activity of T. cuspidate leaves

2.5低溫對(duì)東北紅豆杉葉片質(zhì)膜透性的影響由圖4可知，低溫對(duì)東北紅豆杉葉片質(zhì)膜透性有明顯影響。隨著溫度的降低，質(zhì)膜透性受影響越大。相比于對(duì)照，各低溫處理葉片質(zhì)膜透性比對(duì)照增大0.73%～167.99%。-30 ℃低溫處理時(shí)，與對(duì)照差異不明顯，說明東北紅豆杉對(duì)-30 ℃低溫具有較好的抗逆性。

圖4　不同處理的東北紅豆杉葉片質(zhì)膜透性Fig. 4　Effects of different treatments on the membrane permeability of T. cuspidate leaves

2.6低溫對(duì)東北紅豆杉葉片內(nèi)SS含量的影響由圖4可知，在溫度逐漸降低的條件下，東北紅豆杉葉片內(nèi)SS含量逐漸增加。與對(duì)照比較，隨著溫度的降低，SS含量增加102.39%～121.56%。低溫處理與對(duì)照相比，SS含量均顯示出顯著性差異，而低溫處理之間SS含量差異不顯著。由此說明，東北紅豆杉作為抗寒性強(qiáng)的植物，其體內(nèi)SS含量的增加，對(duì)提高東北紅豆杉的抗寒性具有重要的作用。

圖5　不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)SS含量Fig. 5　Effects of different treatments on the soluble sugar content of T. cuspidate leaves

3小結(jié)與討論

該研究表明，隨著溫度降低，東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量和SOD活性依次降低，而質(zhì)膜透性、Pro、MDA和SS含量遞增。在該低溫試驗(yàn)中，東北紅豆杉表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗寒性，對(duì)-30 ℃低溫具有較好的抗逆性。該試驗(yàn)低溫處理采取逐漸降溫的方法,降溫幅度均勻,且每次降溫持續(xù)時(shí)間基本一致，這與自然降溫過程有差異，今后再做東北紅豆杉抗寒性試驗(yàn)，應(yīng)注意對(duì)自然降溫過程的全真模擬及進(jìn)行綜合分析。

參考文獻(xiàn)

[1] 周志強(qiáng),胡丹，劉彤.天然東北紅豆杉種群生殖力與開花結(jié)實(shí)的特性[J].林業(yè)科學(xué)，2009,45(5)：80-86.

[2] 姚麗花.新疆奎屯墾區(qū)近10年棉花苗期低溫冷(凍)害天氣分析[C]//第28屆中國氣象學(xué)會(huì)年會(huì)：S11氣象與現(xiàn)代農(nóng)業(yè).廈門：中國氣象學(xué)會(huì),2011.

[3] 吉春容,鄒陳,陳叢敏,等.新疆特色林果凍害研究概述[J].沙漠與綠洲氣象,2011,5(4)：1-4.

[4] 孫曉碩.新疆北疆地區(qū)冬季葡萄凍害成因及預(yù)防措施[J].林業(yè)科學(xué),2015(5):116-117.

[5] 郝建軍.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,2001.

[6] 劉成運(yùn),孟慶梅.冷害條件下鳳眼蓮某些生理特性變化的研究[J].武漢植物學(xué)研究,1993,11(4):345-354.

[7] 王易振,楊治國,曾祥瓊,等.低溫處理對(duì)青蒿葉片脯氨酸、SOD和CAT的含量及蛋白質(zhì)的影響[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2010,29(5):927-930.

[8]WANGXG,SHENLT,YAOJH,etal.Physiologicalandbiochemicaleffectsofessentialoilsonseedpotatostorage[J].Actaphytophylacicasinica, 2016,4(13):300-306.

基金項(xiàng)目新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師石河子市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012cz02)。

作者簡(jiǎn)介賀川江(1967- )，男，新疆石河子人，高級(jí)工程師，碩士，從事園林植物引種馴化栽培與城鄉(xiāng)綠化研究。*通訊作者，講師，博士研究生，從事作物生理生化與栽培研究。

收稿日期2016-05-03

中圖分類號(hào)S 791.49

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)16-174-03

ColdResistanceAnalysisofTaxus cuspidateSieb.etZucc.

HEChuan-jiang1,ZHANGShu-ying2*,LIXian-rong1etal

(ShiheziHorticulturalInstitute,Shihezi,Xinjiang832000; 2.CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003)

Abstract[Objective] To analyze the cold resistance of Taxus cuspidate Sieb. et Zucc. in Shihezi City of Xinjiang Province. [Method] Five low-temperature treatments were designed to test the leaf chlorophyll content, MDA content, free proline content, SOD activity, membrane permeability and soluble sugar content. [Result] With the decrease of temperature, the chlorophyll content and SOD activity in T. cuspidate leaves reduced, but membrane permeability, free proline, MDA content and soluble sugar content enhanced. [Conclusion] T. cuspidate has relatively good cold resistance to -30 ℃ low temperature.

Key wordsTaxus cuspidate Sieb. et Zucc.; Cold resistance; Low treatment