王琳琳，童群義

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

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葡萄糖酸亞鐵固體脂質(zhì)納米粒的制備工藝研究

王琳琳，童群義*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

摘要[目的]探索葡萄糖酸亞鐵固體脂質(zhì)納米粒的制備方法。[方法]采用兩步W/O/W乳化方式制備葡萄糖酸亞鐵固體脂質(zhì)納米粒(SLN)。以包埋率為指標(biāo)，研究?jī)?nèi)外相、油水相體積比，卵磷脂濃度對(duì)SLN包埋率的影響。[結(jié)果]試驗(yàn)確定當(dāng)內(nèi)相中水相與油相的體積比為0.2，外水相與內(nèi)相乳狀液的體積比為5∶1，卵磷脂濃度為5%時(shí)，SLN的包埋率取得最大值，為52.48%。在內(nèi)水相引入海藻酸鈉(1∶2，W/W)的結(jié)果表明，SLN的包埋率增大，為59.03%，粒徑、Zeta電位和多分散系數(shù)發(fā)生變化。體外釋放試驗(yàn)表明，SLN能起到保護(hù)葡萄糖酸亞鐵經(jīng)受胃酸環(huán)境的作用，并在模擬腸液中表現(xiàn)為突釋的釋放效果。[結(jié)論]固體脂質(zhì)納米粒對(duì)葡萄糖酸亞鐵有較好的保護(hù)及釋放效果，可為無機(jī)鐵補(bǔ)充劑的生產(chǎn)提供新的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞固體脂質(zhì)納米粒；葡萄糖酸亞鐵；海藻酸鈉

缺鐵癥，是常見的營(yíng)養(yǎng)素缺乏癥之一，是引起貧血的重要營(yíng)養(yǎng)因素[1]。據(jù)預(yù)測(cè)，有20億人口正面臨貧血的危機(jī)，其中大部分是由于缺鐵造成的[2]。缺鐵會(huì)降低成人勞動(dòng)能力，引起孕婦早產(chǎn)以及新生兒體重過低甚至死亡[3]。服用鐵強(qiáng)化劑和鐵補(bǔ)充劑是目前應(yīng)對(duì)缺鐵問題的主要手段[4]。

盡管親水性亞鐵鹽具有生物利用性高和成本低的優(yōu)點(diǎn)，但是當(dāng)隨食物攝入時(shí)，會(huì)刺激消化道，造成感官不適，嚴(yán)重的甚至引起惡心、腹痛[1]。另外，食品中的成分，諸如植酸和多酚，可以在消化道內(nèi)結(jié)合鐵離子并與之形成復(fù)合物，降低了無機(jī)鐵鹽的生物利用率，從而限制了親水性無機(jī)鐵鹽的使用[5]。

固體脂質(zhì)納米體(solidlipidnanoparticle，SLN)，是一種以酯類或類酯類作為載體的膠體運(yùn)載系統(tǒng)，具有生物相容性和降解性好，毒性低，適用于在親水性和親油性成分的包埋和運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，目前已應(yīng)用在多肽、蛋白質(zhì)、抗癌藥物等物質(zhì)的包埋。因此，將SLN技術(shù)應(yīng)用于裝載亞鐵鹽，可以避免藥物的泄露，防止鐵離子與食品中成分發(fā)生沉淀反應(yīng)，起到保護(hù)鐵離子的作用，并潛在提高亞鐵離子的生物利用率。

葡萄糖酸亞鐵是親水性芯材，不易被SLN包載。近年來，以W/O/W兩步乳化方法制備固體脂質(zhì)納米粒的技術(shù)，已成功用于包埋蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)[6]。鑒于此，筆者探索該法制備葡萄糖酸亞鐵SLN的可能性，以硬脂酸作為固相，大豆軟磷脂作為乳化劑，探究各工藝因素對(duì)SLN包埋率的影響，并考察在SLN內(nèi)相中引用海藻酸鈉對(duì)體系包埋率、粒徑和Zeta電位的影響以及包埋體的體外釋放情況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要原料及試劑。葡糖糖酸亞鐵(FeG)、大豆卵磷脂、菲羅嗪、胃蛋白酶、胰蛋白酶、海藻酸鈉(～ 250cps)、聚乙烯醇(分子量30 000～70 000)，Sigma公司；乙醇，為分析純?cè)噭?/p>

1.1.2主要儀器設(shè)備。細(xì)胞超聲破碎儀，美國(guó)SONICS公司；恒溫水浴鍋，美國(guó)Fisher公司；超速離心機(jī)SorvallTMLYNX，美國(guó)ThermoScientific公司；動(dòng)態(tài)散射納米粒度分析儀，美國(guó)馬爾文公司；酶標(biāo)儀SynergyHT，美國(guó)biotek公司。

1.2方法

1.2.1固體脂質(zhì)納米粒的制備。將一定量大豆卵磷脂和50mg硬脂酸在60 ℃條件下溶于5mL乙醇中，加入濃度為5mg/mL的葡萄糖酸亞鐵，濃度為10mg/mL的抗壞血酸，提前預(yù)熱至相同溫度的0.01mol/L鹽酸溶液，超聲乳化1min形成W/O型乳狀液。將一定體積的同溫度的1%聚乙烯醇溶液加入到乳狀液中，相同超聲間斷處理2min，得到W/O/W乳狀液。待冷卻至室溫，離心(20 644r/min，30min)處理乳狀液，將得到的沉淀重新溶于5mL1%的聚乙烯醇溶液中，冰浴條件下，超聲處理10min，得到固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?SLN)。將10mg/mL的海藻酸鈉按不同質(zhì)量比加入到內(nèi)水相中，室溫條件下攪拌混合2h后，用相同方法制備SA-SLN。

1.2.2包埋率的測(cè)定。采用菲羅嗪測(cè)定離心后的上清液中的鐵離子濃度，間接測(cè)定鐵離子含量，由下式計(jì)算包埋率：

式中，m1為原料中葡萄糖酸亞鐵的質(zhì)量；m2為上清液中葡萄糖酸亞鐵的質(zhì)量。

鐵離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取10μL1mol/L標(biāo)準(zhǔn)氯化鐵溶液用0.2mol/L鹽酸稀釋為1mmol/L，取出0、2、4、6、8和10μL置于 96孔板，用10%醋酸胺溶液(pH4.5)補(bǔ)充至100μL，加入10μL10%抗壞血酸溶液和40μL3mg/mL菲羅嗪顯色劑，室溫下放置30min后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)560nm下測(cè)定其吸光度A560 nm。以A560 nm值為縱坐標(biāo)，鐵離子摩爾濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)?；貧w方程：y=0.087 3x+0.002 3,r=0.999 7；線性范圍：0～10nmoL。

圖1　鐵離子摩爾濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　 Iron ion molar concentration standard curve

1.2.3粒徑和Zeta電位的測(cè)定。采用粒徑/Zeta分析儀測(cè)定粒徑以及Zeta電位。 將1mL樣品裝入比色皿和Zeta電位比色皿。設(shè)定儀器參數(shù)：分散介質(zhì)的折射指數(shù)為1.33，分散相折射指數(shù)為1.43，溫度測(cè)定條件為25 ℃，散射角為173°。

1.2.4模擬釋放試驗(yàn)。取一定體積的固態(tài)脂質(zhì)納米體與等體積模擬胃液或腸液混合，移入37 ℃、100r/min的恒溫振蕩水浴鍋中釋放，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量設(shè)定時(shí)刻下鐵離子的釋放率。

模擬胃酸(pH2)由0.4% 氯化鈉，0.5%胃蛋白酶和去離子水組成。模擬腸液(pH6.8)由6.8mg/mL磷酸二氫鈉，5mg/mL胰蛋白酶和去離子水配制而成。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。文中數(shù)據(jù)為3次平行測(cè)定值的平均值。采用GraphPadPrism軟件在0.05顯著性水平下進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄糖酸亞鐵對(duì)SLN包埋率的影響由圖2可以看出，SLN的包埋率隨著葡萄糖酸亞鐵的用量增加而降低。當(dāng)葡萄糖酸亞鐵用量為2.5mg時(shí)，SLN的包埋率為79.1%，而用量為5.0mg時(shí)，包埋率下降為52.47%，當(dāng)亞鐵鹽用量繼續(xù)增加時(shí)，包埋率降低。這與前人的研究具有相同結(jié)論[7-8]，Zariwala等研究發(fā)現(xiàn)，鐵用量與SLN的包埋率有負(fù)相關(guān)性，并推測(cè)造成此現(xiàn)象的原因可能是由于葡萄糖酸亞鐵的強(qiáng)電解質(zhì)屬性影響了脂質(zhì)囊體壁組成[7]。綜合以上，選擇葡萄糖酸亞鐵的添加量為5.0mg。

圖2　葡萄糖酸亞鐵含量對(duì)SLN包埋率的影響Fig.2　The effect of ferrous gluconate content on the entrapment efficiency of SLN

2.2內(nèi)相水相油相體積比對(duì)包埋率的影響由圖3可以看出，隨著內(nèi)相水相與油相的比例增大，固體脂質(zhì)納米體對(duì)鐵的包埋率先增大，在水相與油相體積比達(dá)到0.2時(shí)，包埋率取得最大值；當(dāng)水相與油相體積比繼續(xù)增大時(shí)，包埋率減小。這可能是由于油相體積不變，水相增大導(dǎo)致分散在水相外的油膜層變小，水相容易沖破油層而導(dǎo)致體系不穩(wěn)定[10]。綜合以上，選取內(nèi)相中水相與油相的體積比為0.2。

圖3　內(nèi)相中水相與油相的體積比對(duì)固體脂質(zhì)納米體包埋率的影響Fig.3　Entrapment efficiency of SLN with different ratios(V/V)of aqueous and oil phase in internal phase

2.3外水相與內(nèi)相乳狀液的體積比對(duì)包埋率的影響由圖4可以看出，隨著外水相體積的增大，固體脂質(zhì)納米體對(duì)鐵的包埋率逐漸增大，當(dāng)外水相與內(nèi)相乳狀液的體積比大于5∶1時(shí)，包埋率基本穩(wěn)定。這可能由于當(dāng)外相水相體積逐漸增大時(shí)，被分散的內(nèi)相乳滴相互之間碰撞的機(jī)會(huì)減少，穩(wěn)定性提高。所以，選取5∶1作為外水相與內(nèi)相乳狀液的體積比。

圖4　外水相與內(nèi)相乳狀液的體積比對(duì)固體脂質(zhì)納米體包埋率的影響Fig.4　Entrapment efficiency of SLN with different volume ratio of aqueous phase of external phase to W/O emulsion of internal phase

2.4大豆卵磷脂含量對(duì)包埋率的影響磷脂，尤其大豆卵磷脂，廣泛用作有效成分和藥物的塑形劑[6]。因其具有兩親分子特性和較好的生理兼容性，常被用于SLN的制備中。由圖5可以看出，隨著卵磷脂用量的上升，包埋率逐漸并且顯著增加。當(dāng)達(dá)到3.5%時(shí)，包埋率緩慢增大。這可能是由于芯材表面的乳化層已有效地穩(wěn)定了內(nèi)相液滴的結(jié)構(gòu)，乳化層增厚帶來的效果逐漸不顯著。

2.5大豆卵磷脂含量對(duì)粒徑和多分散系數(shù)的影響由圖6可以看出，卵磷脂濃度增加，固體脂質(zhì)納米體的粒徑逐漸減小，這是因?yàn)殡S著乳化劑用量的增加，乳滴表面聚集的乳化層增加，降低了油水界面間的表面張力，提高了穩(wěn)定性。同時(shí)，分散系數(shù)減小，說明體系中的粒子形態(tài)更均勻。綜合圖5的結(jié)果，選擇卵磷脂濃度5%為最佳條件。

圖6　卵磷脂濃度對(duì)固體脂質(zhì)納米體粒徑和多分散系數(shù)的影響Fig.6　The influence of lecithin concentration on the size and PDI of SLN

2.6海藻酸鈉的引入對(duì)SLN包埋率的影響海藻酸鈉，是一類多糖大分子，其溶液中帶有大量陰離子。當(dāng)海藻酸鈉分子與亞鐵離子混合后形成海藻酸鈉與亞鐵的絡(luò)合物，引入固體脂質(zhì)納米粒時(shí)，可能會(huì)影響亞鐵的包埋率及SLN的性質(zhì)。

由圖7可以看出，海藻酸鈉的引入對(duì)SLN的包埋率產(chǎn)生了顯著的影響。隨著海藻酸鈉用量的增加，SLN對(duì)葡萄糖酸亞鐵的包埋率減??；當(dāng)海藻酸鈉與葡萄糖酸亞鐵的質(zhì)量比為1∶2和1∶1時(shí)，SA-SLN的包埋率高于對(duì)照組，而當(dāng)比值為2∶1時(shí)，包埋率明顯低于對(duì)照組。造成此現(xiàn)象的原因可能是海藻酸鈉分子中的羧基基團(tuán)使其帶有大量負(fù)電荷，通過靜電作用與帶正電荷的二價(jià)鐵離子發(fā)生交聯(lián)[11]，二價(jià)鐵離子分布在海藻酸鈉分子鏈上，同時(shí)海藻酸鈉的線性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)阻止了內(nèi)水相液滴的聚集，維持了體系的穩(wěn)定，提高了固體納米體對(duì)Fe2+的包埋率。但是，當(dāng)鐵離子濃度一定，多糖分子濃度增大，海藻酸鈉作為多糖大分子，對(duì)鐵離子的空間阻礙作用增大，并與二價(jià)鐵離子爭(zhēng)奪乳化劑的親水端，破壞了乳狀液的穩(wěn)定性，導(dǎo)致包埋率降低。

圖7　SA-SLN在不同海藻酸鈉與葡萄糖酸亞鐵的質(zhì)量比下的包埋率Fig.7　Entrapment efficiency of SA-SLN with different ratios(W/W)to ferrous gluconate

2.7海藻酸鈉對(duì)SLN粒徑、Zeta電位以及多分散系數(shù)的影響表1顯示，海藻酸鈉的加入對(duì)固體納米粒的粒徑、Zeta電位以及多分散系數(shù)產(chǎn)生顯著影響。隨著海藻酸鈉與葡萄糖酸亞鐵的質(zhì)量比增大，粒徑明顯增大，多分散系數(shù)顯示粒徑分布混亂不均一。這是由多糖大分子海藻酸鈉以及與二價(jià)鐵離子形成的絡(luò)合物造成的空間體積增大的緣故。Zeta電位表現(xiàn)為隨著海藻酸鈉濃度的增大而降低，原因是海藻酸鈉帶有大量陰離子，一部分大分子裸露在外表面而引起表面電位的降低。添加海藻酸鈉的固體脂質(zhì)納米粒的Zeta電位值大于-30mV，而對(duì)照組為-22.27mV，說明引入海藻酸鈉使得粒子間排斥力強(qiáng)于對(duì)照組，預(yù)示著體系更加穩(wěn)定。

2.8SLN和SA-SLN的體外釋放在模擬胃液釋放試驗(yàn)中，由于樣品的流體性質(zhì)，SLN懸濁液在胃液環(huán)境停留的時(shí)間短，故采用30min作為釋放時(shí)間[12]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，SLN在pH2的模擬胃液環(huán)境下釋放3.79%的芯材鐵，SA-SLN在相同條件下釋放3.43%，低于未加海藻酸鈉的SLN，說明SLN在低pH的胃酸環(huán)境下穩(wěn)定，且有效保護(hù)芯材，防止泄漏。

圖8的結(jié)果顯示，SLN和SA-SLN在模擬腸液中呈現(xiàn)出快速釋放的現(xiàn)象，并且在30min的釋放時(shí)間之后緩慢釋放。此現(xiàn)象的原因可能是，在釋放介質(zhì)環(huán)境下，附在固脂粒表層的二價(jià)鐵離子逐漸釋放出來。與SLN在30min釋放18.57%藥物相比，SA-SLN呈現(xiàn)出更高的釋放率，為22.32%，推測(cè)原因?yàn)楫?dāng)SLN在釋放時(shí)，由于聚合物的參與，聚合物在顆粒表面逐漸舒展溶解，形成通路，F(xiàn)e2+與外界介質(zhì)的接觸增大，釋放率提高，從而為固體脂質(zhì)納米粒在無機(jī)鐵離子吸收部位釋放提供了可能性。

表1　SLN的物理化學(xué)特征

圖8　SLN 和SA-SLN在模擬腸液中的釋放Fig.8　Release of SLN and SA-SLN in simulated intestinal fluid

3結(jié)論

該試驗(yàn)運(yùn)用W/O/W乳化法成功制備了葡萄糖酸亞鐵固體脂質(zhì)納米粒，并考察了內(nèi)外相、油水相體積比以及卵磷脂濃度對(duì)SLN包埋率的影響，確定當(dāng)內(nèi)相中水相與油相的體積比為0.2，外水相與內(nèi)相乳狀液的體積比為5∶1，卵磷脂濃度為5%時(shí)，SLN的包埋率取得最大，為52.48%。海藻酸鈉的引入，由于與二價(jià)鐵離子發(fā)生靜電作用，對(duì)SLN的包埋率、粒徑及Zeta電位產(chǎn)生了影響。當(dāng)海藻酸鈉與葡萄糖酸亞鐵的質(zhì)量比為1∶2時(shí)，SLN的包埋率取得最大，為59.03%，優(yōu)于對(duì)照組。釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示，SLN在模擬胃液中可以保護(hù)藥物，并且在模擬腸液介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)釋放。綜上，固體脂質(zhì)納米體作為新型藥物傳遞釋放系統(tǒng)，為無機(jī)亞鐵的包埋提供了新的技術(shù)手段。

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作者簡(jiǎn)介王琳琳(1992-)，女，北京人，碩士研究生，研究方向：食品資源與利用。*通訊作者，教授，博士，從事碳水化合物資源與利用研究。

收稿日期2016-04-22

中圖分類號(hào)TS 201.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)16-090-04

StudyonPreparationTechniqueofFerrousGluconate-LoadedSolidLipidNanoparticles

WANGLin-lin,TONGQun-yi*

(FoodScienceSchool,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122)

Abstract[Objective] The aim was to explore preparation method of ferrous gluconate-loaded solid lipid nanoparticles. [Method] The ferrous gluconate solid lipid nanoparticles (SLN) was prepared by W/O/W double emulsion techniques. The influences of volume ratio of outer/ inner phase, aqueous/oil phase of internal phase and concentration of lecithin applied as the surfactant on the entrapment efficiency of SLN were investigated. [Result] The maximal entrapment efficiency, 52.48%, was obtained under the circumstances of 0.2 as the aqueous/oil phase of internal phase, 5∶1 as the volume ratio of outer/ inner phase, and 5% as concentration of lecithin. The addition of sodium alginate with weight ratio of 1∶2 to ferrous gluconate posed a positively impact on the entrapment efficiency, which was 59.03% and affected the size, Zeta potential and polydispersion index as well. The in vitro release profile showed that SLN could keep integrity in simulated gastric fluid and went through a burst release in simulated intestinal fluid. [Conclusion] SLN could protect the drug from disintegration and release in the active site and be a new method to produce inorganic iron salts supplementation.

Key wordsSolid lipid nanoparticle (SLN); Ferrous gluconate; Sodium alginate