李果　李厚華　張延龍　辛轉(zhuǎn)霞　　　　魏新翠　　　　唐豆豆

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)　　　　　　　(濟南市學(xué)大教育培訓(xùn)學(xué)校)　　(西北農(nóng)林科技大學(xué))

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鳳丹牡丹ANS(PoANS)基因克隆、特性及表達1)

李果李厚華張延龍辛轉(zhuǎn)霞魏新翠唐豆豆

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)(濟南市學(xué)大教育培訓(xùn)學(xué)校)(西北農(nóng)林科技大學(xué))

摘要通過RT-PCR技術(shù)，從鳳丹牡丹花瓣中克隆出編碼ANS基因的cDNA序列，并對其進行生物信息學(xué)分析。對不同開花階段的鳳丹花瓣進行實時熒光定量及總花青素質(zhì)量分數(shù)測定，構(gòu)建原核表達載體PET-28a-ANS，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進行體外表達。結(jié)果表明：該序列編碼區(qū)域共1 065 bp，編碼354個氨基酸，其蛋白相對分子質(zhì)量為40 475.5 ，亞細胞定位為細胞質(zhì)的可能性最大；表達分析顯示，ANS基因表達水平與不同開花時期的總花青素質(zhì)量分數(shù)及花色相關(guān)，原核表達得到相對分子質(zhì)量約為44 000的ANS-His-tag融合蛋白，與預(yù)測蛋白大小相一致。

關(guān)鍵詞鳳丹牡丹；ANS基因；表達分析；原核表達

鳳丹牡丹(Paeonia ostii‘feng dan’)是中國傳統(tǒng)的藥用植物和新興的油料作物[1]，具有很高的經(jīng)濟價值，同時也是現(xiàn)代觀賞牡丹的主要原始親本之一[2-3]。鳳丹花色主要為白色或淺粉色，單瓣花，在栽培演化進程中受其他種或品種群的影響較小[2]。

決定植物組織顏色的花青素(anthocyanidins)是類黃酮代謝途徑中的重要產(chǎn)物[4]。花青素合成酶基因(Anthocyanidin synthase)是花青素合成途徑中的一個重要基因，它能夠催化無色花青素合成有色花青素[5],花青素能夠使植物呈現(xiàn)藍、紫、粉、紅等顏色[4]。ANS基因最初通過轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)從玉米中克隆出來[6]，已有研究發(fā)現(xiàn)，ANS基因在綠色紫蘇中不表達，在紅色紫蘇中表達較高，證明了其與花青素的積累有密切關(guān)系[7]，同時對蛇莓著色的研究也表明，ANS基因表達量與顏色積累有關(guān)[8]。目前，ANS基因的研究多集中于模式植物以及果蔬類植物，對于觀賞類特別是在開花過程中花瓣顏色變化程度較高的植物中研究較少，且多集中在表達分析層面，對于基因本身以及編碼蛋白的研究很少[9]。

鳳丹直接從野生原種馴化而來，本身花色較為單一，但其開花過程中，花色變化較為明顯，證明其具有很高的觀賞潛力[2]。本研究在鳳丹花瓣中克隆出ANS基因及其序列，并進行了生物信息學(xué)分析，通過實時熒光定量并結(jié)合花青素積累情況分析ANS基因表達與花色變化的關(guān)系，以期為鳳丹花色形成機理及表達調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。通過原核表達獲得ANS基因編碼蛋白，為體外驗證花青素合成酶功能奠定基礎(chǔ)。為后期進行鳳丹花色調(diào)控，提高觀賞性奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

植物材料取自西北農(nóng)林科技大學(xué)野生牡丹資源圃保存的鳳丹不同開花時期，參考前人對花期的劃分[10]，將‘鳳丹’牡丹分為花蕾期、未展期、初展期、盛花期和末花期五個時期(圖1)的花瓣，分別采集多株花型、花色較為接近的花瓣，用于總花青素質(zhì)量分數(shù)測定，用液氮速凍后儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

植物RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，Taq酶、高保真酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶、克隆載體DNA Marker購自TaKaRa公司，瓊脂糖膠回收試劑盒購自于北京康為世紀生物科技有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自BIOMIGA公司，無縫克隆試劑盒購自近岸蛋白公司，氨芐青霉素(Ampicillin)、卡那霉素(Kanamycin)、X-gal、IPTG等試劑均為進口分析純。引物合成、測序等均為北京奧科公司完成。大腸桿菌(E.coli)TOP10、BL21、原核表達載體pET-28a均由本實驗室保存。文中未注明的其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

圖1　不同發(fā)育時期的鳳丹花

RNA提取與cDNA合成：RNA提取采用OMEGA公司的植物總RNA提取試劑盒按照說明進行，提取的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用紫外分光光度計進行質(zhì)量濃度及質(zhì)量檢測。

以每個時期總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，先消除基因組DNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

基因克隆：根據(jù)NCBI網(wǎng)站上已經(jīng)報道的其他植物的ANS基因序列，設(shè)計特異性引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，擴增鳳丹ANS基因cDNA序列。擴增條件為94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 S，58 ℃退火30 S，72 ℃延伸50 S(共30個循環(huán))；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化回收目的條帶，與PGEM-T載體進行連接，連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP-10感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選，以及菌落PCR驗證后，將陽性產(chǎn)物于Amp終質(zhì)量濃度為100 μg·L-1的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，送北京奧科鼎盛公司測序。將驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pGEM-T-ANS。

生物信息學(xué)分析：使用NCBI BLAST進行氨基酸序列同源分析，利用ExPASyProtParam Tool(http://web.expasy.org/protparam/)，HNN SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD，Swiss-Model Workplace(http://swissmodel.expasy.org/)和TMGMM 2.0等軟件進行蛋白質(zhì)各級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。編碼蛋白翻譯后的修飾位點檢測在KinasePhos(http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)中完成。

原核表達分析：首先將PET-28a載體利用EcoRI，HindIII雙酶切進行線性化處理，再根據(jù)載體切口兩端的15 bp同源序列設(shè)計特異性引物nrANSf和nrANSr(表1)，以重組pGEM-T-ANS載體質(zhì)粒為模板，克隆兩端帶有PET-28a同源序列的PoANS基因。凝膠電泳分別回收線性化載體以及PCR產(chǎn)物，在NovoRec?重組酶的作用下進行連接。連接產(chǎn)物首先采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP-10感受態(tài)細胞，經(jīng)kana抗性篩選，挑取單一菌落過夜搖菌后提取質(zhì)粒進行PCR驗證及雙酶切驗證，將陽性重組子于kana終質(zhì)量濃度為50 μg·L-1的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，送北京奧科鼎盛公司測序。將測序正確的重組子命名為PET-28a-ANS。

重組載體PET-28a-ANS驗證正確后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，加入kana終質(zhì)量濃度為50 μg·L-1的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。用LB液體培養(yǎng)基按V(過夜培養(yǎng)菌液)∶V(液體LB培養(yǎng)基)=1∶50稀釋過夜培養(yǎng)的菌液，培養(yǎng)一段時間后至OD600為0.6左右，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG溶液，分別取空載體菌液，重組載體0、2、4、6、8 h的誘導(dǎo)菌液，加入上樣緩沖液，煮沸10 min后離心，吸取上清液進行SDS-PAGE電泳。經(jīng)考馬斯亮藍染色，脫色后，照相保存[11]。

不同開花時期的表達分析：選擇PoANS基因靠近5’端的一段序列設(shè)計實時定量引物rtANSf和rtANSr(表1)，所得擴增片段長度應(yīng)為234 bp，選用牡丹β-微管蛋白基因(β-Tubulin，登錄號：EF608942)作為內(nèi)參基因[12]，設(shè)計特異性引物Tubf和Tubr(表1)，對應(yīng)的擴增片段長度為182 bp。使用IQTM5多重實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)，以五個不同花期cDNA為模板，參照TaKaRa公司的SYBR@PremixExTaqTMⅡ說明書，進行實時熒光定量分析，反應(yīng)程序如下，95 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s(共40個循環(huán))；95 ℃ 1 min，65 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s(步進0.5 ℃·s-1)。每個樣品做4次重復(fù)反應(yīng)，以牡丹β-Tubulin基因為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析[13]。

不同開花時期花瓣總花青素質(zhì)量分數(shù)的測定：將不同時期花瓣液氮速凍后，取0.3 g樣品用1%甲醇鹽酸4 ℃提取24 h，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液定容至10 mL。將樣品分別用pH值1.0的25 mmol·L-1的氯化鉀溶液和pH值4.5的400 mmol·L-1的醋酸鈉溶液按一定的稀釋倍數(shù)稀釋后利用紫外分光光度計測定530 nm和700 nm處的吸光值，同一時期的花瓣每組做3次重復(fù)。然后按照以下公式計算(總花青素質(zhì)量分數(shù)以矢車菊素-3-葡萄糖苷的質(zhì)量分數(shù)計算)[14]：

A=A1-A2；

總花青素質(zhì)量分數(shù)=(A×MW×DF×V×1 000)/(m×ε)。式中：A為吸光度；A1為氯化鉀稀釋樣品液530 nm和700 nm處的吸光值之差；A2為醋酸鈉稀釋樣品液530 nm和700 nm處的吸光值之差;MW為相對分子質(zhì)量；DF為稀釋倍數(shù)；V是溶液定容體積；m為稱取的花瓣質(zhì)量；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)[15])。

表1　所用引物序列

2結(jié)果與分析

2.1鳳丹花青素合成酶(PoANS)基因的克隆與生物信息學(xué)分析

以鳳丹花cDNA為模板，使用上述引物以及高保真酶擴增出一段大約1 000 bp的片段(圖2)。將該片段連接PGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)測序獲得該片段完整序列，命名為PoANS。

M為2 000 bpMarker；1為鳳丹ANS基因序列。

序列分析結(jié)果顯示，‘鳳丹’牡丹ANS基因編碼區(qū)共1 065 bp,編碼354個氨基酸(圖3)，其蛋白相對分子質(zhì)量為40 475.5，氨基酸種類及所占比例見表2。

圖3　PoANS基因cDNA編碼區(qū)基因序列及其所對應(yīng)的氨基酸序列

氨基酸數(shù)量所占比例/%氨基酸數(shù)量所占比例/%Ala(A)185.1Leu(L)339.3Arg(R)123.4Lys(K)339.3Asn(N)123.4Met(M)82.3Asp(D)123.4Phe(F)133.7Cys(C)51.4Pro(P)195.4Gln(Q)174.8Ser(S)195.4Glu(E)4412.4Thr(T)154.2Gly(G)205.6Trp(W)51.4His(H)82.3Tyr(Y)102.8Ile(I)277.6Val(V)246.8

PoANS蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，其在175～195和230～257有兩個跨膜區(qū)；二級結(jié)構(gòu)由α螺旋(占41.53%)、隨機卷曲(占27.68%)、延伸鏈(占19.21%)和β旋轉(zhuǎn)(占11.58%)組成。對PoANS蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，PoANS蛋白理論等電點為5.42，半衰期較長，為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為53.08，屬于比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，脂溶系數(shù)為90.85，總平均疏水性為-0.405。NCBI CDD軟件在線預(yù)測結(jié)果表明，PoANS蛋白中含有PLN03178功能域(圖4)，Swiss-Model Workplace在線預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖4　PoANS蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果

圖5　PoANS蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

PoANS蛋白在細胞質(zhì)的可能性最大，可信度為4.723(CELLO v.2.5預(yù)測結(jié)果)；PoANS蛋白可能含有2個絲氨酸磷酸化位點，分別位于第33個氨基酸和302個氨基酸；2個絡(luò)氨酸磷化位點，分別位于第115個氨基酸和167個氨基酸；1個蘇氨酸磷酸化位點，位于第261個氨基酸(圖6)。

2.2PoANS基因的原核表達

從抗性篩選呈陽性的大腸桿菌TOP10中提取質(zhì)粒，進行PCR驗證(圖7)和雙酶切驗證(圖8)，使用BamHI和NotI雙酶切，因PoANS序列中含有EcoRI和HindIII酶切位點。結(jié)果顯示，PCR擴增得到1 000 bp左右條帶，雙酶切得到5 000 bp和1 000 bp左右的兩條帶，證明原核表達重組載體構(gòu)建成功。測序結(jié)果表明，無堿基位點發(fā)生突變，可以進行誘導(dǎo)表達。

圖6　PoANS蛋白磷酸化位點預(yù)測結(jié)果

圖7　重組質(zhì)粒PCR驗證

圖8　重組質(zhì)粒雙酶切驗證

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，空載體和0 h左右的菌液表達均不明顯，而隨著誘導(dǎo)時間的增加蛋白表達逐漸增加，可以看到，在相對分子質(zhì)量為43 000左右的位置有明顯異于空載體的蛋白表達。PoANS蛋白相對分子質(zhì)量為40 000左右，原蛋白加上His-tag標簽大概為43 000，由此表明，有融合蛋白成功表達(圖9)。

2.3PoANS基因表達水平分析

ANS基因的表達受到植物的整體代謝控制，同時花青素的積累也受植物體內(nèi)各種因素如底物質(zhì)量濃度、其他類黃酮途徑合成酶，以及外界環(huán)境等影響。為了研究PoANS基因在鳳丹開花過程中對于花色的影響，故對5個不同開花時期的花瓣進行熒光定量PCR分析。以5個不同時期的花瓣總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以β-Tubulin為內(nèi)參基因得到PoANS基因在‘鳳丹’牡丹5個時期花瓣的相對表達量(表3，圖10)，PoANS基因的表達水平呈現(xiàn)出先下降再上升，最后再下降的趨勢，在盛花期達到最高，相對表達量為14.68，花色也最鮮艷，而到末花期，PoANS基因相對表達水平最低，而花瓣也幾乎為純白色。

經(jīng)過紫外分光光度計測量及后期數(shù)據(jù)處理分析，可發(fā)現(xiàn)花瓣中總花青素的質(zhì)量分數(shù)呈先下降后上升的趨勢，在盛花期達到最高，而在末花期，未檢測到花青素(表3)。

圖9　SDS-PAGE電泳結(jié)果

發(fā)育時期PoANS基因相對表達量花青素積累量/mg·kg-1花蕾期8.21±0.23137.33±5.67未展期4.18±0.1866.65±6.12初展期5.37±0.2083.92±5.49盛花期14.68±0.25152.45±5.16末花期1.00±0.130

圖10　PoANS基因定量產(chǎn)物電泳圖

3結(jié)論與討論

本研究利用RT-PCR技術(shù)成功從鳳丹牡丹的花瓣中克隆出花青素合成酶基因(PoANS)，并對該基因進行了生物信息學(xué)分析、原核表達分析以及表達分析。結(jié)果表明，PoANS開放閱讀框共有1 065個堿基，共編碼354個氨基酸，相對分子質(zhì)量為40 475.5，蛋白消光系數(shù)為42 650，其不穩(wěn)定性系數(shù)為53.08，說明較穩(wěn)定，在細胞質(zhì)的可能性最大。通過構(gòu)建原核表達載體，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，在不同時間收集菌液，經(jīng)過SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，帶有His-tag標簽的融合蛋白大小預(yù)期基本一致，且融合蛋白隨著時間的增長，表達質(zhì)量濃度有明顯的增加，但到8 h左右，增加的幅度已經(jīng)不是很明顯，故誘導(dǎo)的最佳時間為6 h左右。原核表達的成功為下一步進行體外酶促反應(yīng)，進一步驗證PoANS基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

通過對花不同發(fā)育時期PoANS基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，在未開放的花蕾中PoANS表達量較高，而此時的花瓣顏色也呈淺粉色，花青素質(zhì)量分數(shù)也比較高，隨著花逐漸開放，基因表達量先下降再上升，在盛花期達到最高，而此時的花青素積累量也達到最高值，花色也最為鮮艷，證明了ANS基因的不同表達水平對花色的形成具有重要影響，而Zhao et al.[16]的研究中也發(fā)現(xiàn)，ANS的高表達能夠促進花青素的積累，結(jié)合本試驗的結(jié)果，均證實了ANS基因與花青素質(zhì)量分數(shù)的直接聯(lián)系。本試驗在末花期中并沒有檢測到花青素的存在，而此時也有PoANS少量表達，Zhao et al.[17]的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，可能原因是花青素作為底物被下游合成途徑的酶所消耗，導(dǎo)致未檢測到花青素成分。文中研究結(jié)果為下一步利用基因工程手段提高ANS表達水平，以及通過RNAi及病毒干擾技術(shù)干擾花青素合成途徑下游基因、調(diào)控花青素合成與積累、培育兼具經(jīng)濟價值與觀賞價值的鳳丹新品種奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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第一作者簡介：李果，男，1991年10月生，西北農(nóng)林科技大學(xué)風景園林藝術(shù)學(xué)院，碩士研究生。E-mail:547569415@qq.com。 通信作者：李厚華，西北農(nóng)林科技大學(xué)風景園林藝術(shù)學(xué)院，副教授。E-mail:lihouhua73@163.com。

收稿日期：2016年1月24日。

分類號Q785；Q786

Isolation, Characterization and Expression Analysis of Anthocyanidin Synthase (ANS) Gene in Paeonia ostii‘feng dan’//

Li Guo, Li Houhua, Zhang Yanlong, Xin Zhuanxia(Northwest A&F University, Yangling 712100, P.R.China); Wei Xincui(Jinan Xueda School); Tang Doudou(Northwest A&F University)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：64-69.

We isolated a completed CDS sequence encoding ANS gene, designated as PoANS, from Paeonia ostii ‘feng dan’ by RT-PCR.The opening reading frame (ORF) of PoANS is 1 065 bp that encoded 354 amino acid, relative molecular mass is 40 475.5, the subcellular localization most likely be cytoplasm.By real-time quantitative polymerase chain reaction analysis and ultraviolet photometric analysis, the transcript level of PoANS was related with the total anthocyanidins.Prokaryotic expression confirmed that its protein molecular weight agreed with expectations.

KeywordsPaeonia ostii‘feng dan’； Anthocyanin synthase； Expression analysis； Prokaryotic expression

1)林業(yè)公益性行業(yè)科研重大專項(201404701)、國家自然科學(xué)基金項目(31570697)。

責任編輯：任俐。