范諸平　王立雪　楊東　曹德憧　于義　張彥妮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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重瓣長(zhǎng)壽花組織培養(yǎng)再生體系的建立1)

范諸平王立雪楊東曹德憧于義張彥妮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

摘要以重瓣長(zhǎng)壽花的莖段和葉片為外植體，利用單因子和交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究了不同激素組合對(duì)葉片和莖段愈傷組織的誘導(dǎo)、分化及生根的影響，以及不同栽培基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響。結(jié)果表明：適合愈傷組織誘導(dǎo)的外植體是莖段，最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS+6-BA0.10 mg·L-1+2,4-D1.00 mg·L-1,以莖段為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率為100.000%；最佳的愈傷組織分化培養(yǎng)基是MS+6-BA1.00 mg·L-1,增殖系數(shù)達(dá)19.920；最佳的生根培養(yǎng)基是1/2MS+IBA0.50 mg·L-1,生根率為100.000%，根長(zhǎng)3.87 cm；最佳的栽培基質(zhì)是V(園土)∶V(蛭石)=2∶1，此時(shí)移栽成活率為95.710%。

關(guān)鍵詞重瓣長(zhǎng)壽花；組織培養(yǎng)；愈傷組織；再生體系

長(zhǎng)壽花(Kalanchoe blossfeldiana)是景天科伽藍(lán)菜屬的一種多年生草本植物，具有圓錐狀聚傘花序，小花高腳碟狀，花色有橙紅、桃紅、黃色等[1]，自12月份至翌年4月份開花，花期長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月，觀賞價(jià)值極高，是一種重要的室內(nèi)盆栽花卉。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要進(jìn)行了長(zhǎng)壽花抑菌特性[2]、雜交親和性[3]、基因表達(dá)與調(diào)控[4-7]、無土栽培[8-11]等方面的研究。長(zhǎng)壽花一般采用扦插的方法進(jìn)行繁殖[12]，速度較慢且增殖系數(shù)小，一塊葉片或一個(gè)莖段僅能發(fā)育成一個(gè)植株，且繁殖方法易受季節(jié)影響，遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)上的需求[13]。而利用組織培養(yǎng)的繁殖方法不僅不受天氣、季節(jié)的影響[14]，且繁殖速度快、增殖系數(shù)高，可以為進(jìn)一步的科學(xué)研究和工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。長(zhǎng)壽花的很多器官、組織都可以作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽分化和植株再生，目前的研究主要集中于葉片[12，14-18]、葉柄[19]、花序[20]、莖段[20]、莖尖[21]等。品種及外植體類型對(duì)離體器官的再生成苗有很大影響，不同基因型的植株有不同的最適宜的培養(yǎng)基[22]。

重瓣長(zhǎng)壽花是長(zhǎng)壽花近年來推出的栽培新品種[20]。該品種與其原種長(zhǎng)壽花相比，由于花朵的重瓣性，花色更加艷麗、觀賞價(jià)值更高，因而其市場(chǎng)價(jià)格高出同規(guī)格的長(zhǎng)壽花近一倍。重瓣長(zhǎng)壽花自然花期長(zhǎng)，是一種重要的年宵花卉，又因其名字寓意健康長(zhǎng)壽，因而具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景[18]。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)長(zhǎng)壽花離體培養(yǎng)的報(bào)道較多，而對(duì)于重瓣長(zhǎng)壽花的組織培養(yǎng)報(bào)道僅有兩例，分別以花序[20]和葉片[23]為外植體,建立了重瓣長(zhǎng)壽花的組培再生體系，尚未見以莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的報(bào)道。

文中通過不同的培養(yǎng)基和栽培基質(zhì)篩選比較，分別以重瓣長(zhǎng)壽花的葉片和莖段作為外植體，從愈傷組織誘導(dǎo)及分化、不定芽生根到煉苗移栽，總結(jié)了一套增殖系數(shù)高達(dá)19.920的完整的組培繁殖方法，可以滿足大批量現(xiàn)代化溫室生產(chǎn)的需求，并能在質(zhì)量上達(dá)到更高標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)為重瓣長(zhǎng)壽花進(jìn)一步的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

試驗(yàn)材料重瓣長(zhǎng)壽花購(gòu)自哈爾濱市花卉市場(chǎng)，于2015年3月6日選取生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的葉片、莖段為外植體。將剪好的外植體盛裝于小燒杯中，先用洗衣粉水沖洗10 min，再用流水沖洗10 min。在超凈工作臺(tái)中，先用75%的酒精浸泡30 s，無菌水沖洗1遍，再用1.00%的NaClO浸泡15 min，無菌水沖洗3～5次，用無菌濾紙吸干材料表面的水分，將外植體剪成約1 cm2的葉片和1.50 cm左右的莖段[24]。

愈傷組織的誘導(dǎo):通過查閱文獻(xiàn)，選取了4種培養(yǎng)基(表1中1～4號(hào))作為預(yù)試驗(yàn)培養(yǎng)基。具體方法為將切割好的葉片和莖段外植體接種到由6-BA和NAA組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于溫度25 ℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間16 h·d-1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每處理50個(gè)外植體，重復(fù)3次，15 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率并記錄生長(zhǎng)狀況。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以愈傷組織誘導(dǎo)率高且植株生長(zhǎng)健壯的激素組合為參考質(zhì)量濃度，又設(shè)置了一些激素質(zhì)量濃度組合(表1)，進(jìn)一步探究最適合葉片和莖段愈傷組織誘導(dǎo)的激素質(zhì)量濃度組合。

不定芽的分化：挑選生長(zhǎng)健壯、質(zhì)地疏松的愈傷組織接種到8種分化培養(yǎng)基(表2)上，每處理50個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的分化率并記錄生長(zhǎng)狀況。

不定芽生根：待愈傷組織再分化形成的不定芽長(zhǎng)到2 cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)入由1/2MS和NAA、IBA組成的8種生根培養(yǎng)基中，30 d后觀察生根情況并記錄。

煉苗及移栽：待根生長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，將封口膜半打開狀態(tài)放置1 d，再完全去掉封口膜放置1 d，在自來水下小心沖去組培苗根部的培養(yǎng)基，移栽至由V(園土)∶V(蛭石)=2∶1、V(園土)∶V(珍珠巖)=2∶1、V(園土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=2∶1∶1栽培基質(zhì)中，在溫室中栽培，及時(shí)澆水，去除雜草，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

利用Microsoft excel軟件統(tǒng)計(jì)分析愈傷組織誘導(dǎo)率、增殖系數(shù)、生根率、生根系數(shù)和移栽成活率，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，利用鄧肯氏多重比較(Duncan’s multiple-range test)檢驗(yàn)其顯著性，P>0.05為變化不顯著，P<0.05為變化顯著。

2結(jié)果與分析

2.1不同質(zhì)量濃度6-BA、NAA、2,4-D組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在6-BA與NAA共同作用下，10 d左右葉片和莖段外植體均產(chǎn)生少量較為緊實(shí)的深綠色的愈傷組織(圖1A)，莖段外植體產(chǎn)生的愈傷組織量明顯大于葉片。以葉片為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率最高的激素組合為3號(hào)培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率為96.670%，葉片在接種一周后邊緣處膨大，15 d時(shí)產(chǎn)生深綠色的愈傷組織，但較為緊實(shí)。以莖段為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率最高的激素組合為7號(hào)培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率為100.000%，比以葉片為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率高3.330%(表1)。莖段下部在接種一周后開始膨大并產(chǎn)生少量愈傷組織，繼而不斷膨大，自莖段基部產(chǎn)生大量愈傷組織，綠色顆粒狀且較為蓬松。

表1　不同激素組合對(duì)重瓣長(zhǎng)壽花外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：表中部分?jǐn)?shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母代表0.05水平上存在顯著差異。

A.深綠色致密狀愈傷組織；B.黃綠色蓬松狀愈傷組織；C.莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織分化形成的不定芽；D.葉片誘導(dǎo)形成的愈傷組織形成的不定芽；E.生根培養(yǎng)；F.生成的大量絨毛狀須根；G.以V(園土)∶V(蛭石)=2∶1為栽培基質(zhì)移栽形成的小苗；H.以V(園土)∶V(珍珠巖)=2∶1為栽培基質(zhì)移栽形成的小苗；I.以V(園土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=2∶1∶1為栽培基質(zhì)移栽形成的小苗。

圖1重瓣長(zhǎng)壽花葉片莖段愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化及植株移栽

在2,4-D與6-BA的共同作用下，7 d左右外植體即可產(chǎn)生大量黃綠色顆粒狀的愈傷組織，透明蓬松，與胚性愈傷組織的形態(tài)特征基本相符[25](圖1B)。以葉片為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率最高的激素組合為8號(hào)培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)97.330%(表1)，葉片在接種一周后邊緣膨大，15 d時(shí)產(chǎn)生黃綠色透明疏松顆粒狀的愈傷組織。以莖段為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率最高的激素組合為10號(hào)培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100.000%，莖段在接種10 d后下部膨大，20 d左右時(shí)產(chǎn)生大量淺綠色的愈傷組織，愈傷組織質(zhì)地疏松，呈顆粒狀，具備胚性愈傷組織的基本特征。

當(dāng)3種激素共同作用時(shí)，愈傷組織形態(tài)與所占比例高的激素的誘導(dǎo)形態(tài)相一致，誘導(dǎo)率較兩種激素組合時(shí)均有所下降。

由表1可以看出，3號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、10號(hào)為誘導(dǎo)率較高的4種培養(yǎng)基，但是3號(hào)、7號(hào)以6-BA、NAA為激素的培養(yǎng)基所誘導(dǎo)的愈傷組織量少且顏色深綠，不具備胚性愈傷組織的基本特征，8號(hào)以2,4-D與6-BA為激素的培養(yǎng)基，其葉片外植體愈傷誘導(dǎo)率小于10號(hào)以莖段為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率。因此，最適合愈傷組織誘導(dǎo)的外植體是莖段，最適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是10號(hào)培養(yǎng)基，即MS+6-BA0.10 mg·L-1+2,4-D1.00 mg·L-1。

2.2不同質(zhì)量濃度6-BA、NAA、2,4-D組合對(duì)愈傷組織分化的影響

在誘導(dǎo)愈傷組織再分化時(shí)，本試驗(yàn)共設(shè)有MS和6-BA、NAA一種或兩種激素搭配的共8種組合(表2)。將葉片和莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織切割成小塊后接種在8種培養(yǎng)基上，10 d左右愈傷組織上即有不定芽長(zhǎng)出，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖率。在6-BA質(zhì)量濃度為1.00 mg·L-1時(shí)增殖系數(shù)最高，達(dá)19.920,不定芽顏色深綠、健壯且密集(圖1C、圖1D)。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度增高和降低都會(huì)使增殖系數(shù)降低，不定芽葉質(zhì)變軟或呈水漬狀。因此，最適合愈傷組織分化的培養(yǎng)基是MS+6-BA1.00 mg·L-1。

2.3不同生根培養(yǎng)基對(duì)不定芽生根的影響

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度NAA和IBA，試驗(yàn)結(jié)果證明(表3)，生根培養(yǎng)14 d時(shí)，基部均有不同數(shù)量的不定根生成。隨著添加NAA和IBA質(zhì)量濃度的增加，重瓣長(zhǎng)壽花的生根系數(shù)均是先增加后減少。在NAA質(zhì)量濃度為0.20 mg·L-1時(shí)，生根率為100.000%，生根系數(shù)達(dá)到12.330，根長(zhǎng)1.410 cm，根系生長(zhǎng)狀況良好，黑色須根多而粗壯，莖基部密生白色絨毛狀須根(圖1E、圖1F)。隨NAA質(zhì)量濃度的變化，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度大于或小于0.20 mg·L-1時(shí)，根多為絨毛狀根，無粗壯根，且鋪滿培養(yǎng)基表面不能深入培養(yǎng)基。在IBA質(zhì)量濃度為0.50 mg·L-1時(shí)，生根率為100.000%，生根系數(shù)達(dá)到最高，為14.360，根長(zhǎng)3.870 cm，主根黑色粗壯，且在莖基處生成新的小植株。該種培養(yǎng)基與NAA為0.20 mg·L-1的培養(yǎng)基相比，生根率均為100.000%，但該種培養(yǎng)基的生根系數(shù)和根長(zhǎng)大于前者，因此是最適合生根的培養(yǎng)基。

當(dāng)同時(shí)添加兩種激素時(shí)，生根量少，根短而細(xì)弱。綜上，最適合生根的培養(yǎng)基是7號(hào)培養(yǎng)基，即1/2MS+IBA0.50 mg·L-1。

表2　不同激素組合對(duì)重瓣長(zhǎng)壽花愈傷組織分化的影響

注：表中部分?jǐn)?shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母代表0.05水平上存在顯著差異。

表3　不同激素組合對(duì)重瓣長(zhǎng)壽花不定芽生根的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母代表0.05水平上存在顯著差異。

2.4不同栽培基質(zhì)對(duì)再生苗移栽的影響

從表4可以看出，組培苗在V(園土)∶V(蛭石)=2∶1的基質(zhì)中成活率最高(95.710%)，且植株生長(zhǎng)速度最快，莖粗壯，葉片大而深綠(圖1G)。在添加珍珠巖的栽培基質(zhì)中，組培苗的移栽成活率降低，且移栽后生長(zhǎng)狀況劣于前者，株高和葉片面積均低于前者(圖1H、圖1I)。其中，V(園土)∶V(珍珠巖)=2∶1的栽培基質(zhì)成活率最低，僅為87.140%。因此，最適合重瓣長(zhǎng)壽花組培苗生長(zhǎng)的栽培基質(zhì)為V(園土)∶V(蛭石)=2∶1。

表4　不同栽培基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響

注：表中部分?jǐn)?shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母代表0.05水平上存在顯著差異。

3結(jié)論與討論

不同的外植體愈傷組織誘導(dǎo)難易程度不同，對(duì)重瓣長(zhǎng)壽花來說，莖段的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于葉片，并在培養(yǎng)基質(zhì)量濃度為2,4-D1.00 mg·L-1+6-BA0.10 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高，為100.000%。這與樹莓[26]、鞍雜楊[27]、食用玫瑰[28]、鐵皮石斛[29]、紅網(wǎng)紋草[30]等研究結(jié)果一致。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，莖段產(chǎn)生的愈傷組織在不定芽分化、生根及組培苗移栽階段的表現(xiàn)均優(yōu)于葉片。原因可能是不同外植體所含的內(nèi)源激素種類、濃度存在差異[31]，外植體所處的生理狀態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育階段不同[32-33]。利用莖段作為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100.000%，這種方法優(yōu)于利用葉片誘導(dǎo)愈傷組織的方法，且重瓣長(zhǎng)壽花分枝較多，莖段取材較為豐富。本試驗(yàn)沒有進(jìn)一步研究莖尖的再生體系建立效果是否高于莖段，需在今后的試驗(yàn)中進(jìn)一步探索。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)的過程中有著重要的作用[34]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將6-BA與2,4-D組合在一起，誘導(dǎo)出的愈傷組織為半透明淺綠色顆粒狀。而將6-BA與NAA組合在一起，誘導(dǎo)出的愈傷組織為深綠色，質(zhì)地較為緊實(shí)，在后期的分化以及生根、移栽等方面均劣于前者。這與Mucciarelli et al.[35]、 Linacero et al.[36]的研究結(jié)果吻合，說明2,4-D對(duì)于重瓣長(zhǎng)壽花愈傷組織誘導(dǎo)具有重要作用，且適宜質(zhì)量濃度的2,4-D有利于胚性愈傷組織的形成。

段鵬慧等[23]的研究表明，利用葉片誘導(dǎo)生成的愈傷組織，在1/2MS+6-BA1.00 mg·L-1+NAA0.10 mg·L-1的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)可達(dá)12.2。本試驗(yàn)利用莖段誘導(dǎo)生成的愈傷組織，在MS+6-BA1.00 mg·L-1的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)可達(dá)19.920，顯著高于以葉片為外植體的增殖系數(shù)。原因可能是不同的外植體對(duì)不同激素質(zhì)量濃度組合的反應(yīng)不同，莖段較之葉片為中度成熟器官，而中度成熟器官在分化率上高于幼嫩器官[37]。另外，無論MS與NAA的質(zhì)量濃度如何，關(guān)艷清[16]、崔廣榮[21]等的試驗(yàn)結(jié)果也表明，最適宜的6-BA質(zhì)量濃度是1.00 mg·L-1，說明在愈傷組織分化過程中，6-BA的質(zhì)量濃度選擇至關(guān)重要，原因是6-BA作為一種重要的細(xì)胞分裂素，對(duì)于細(xì)胞的分裂分化以及器官的形成有著關(guān)鍵作用。

不同的栽培基質(zhì)對(duì)移栽成活率有影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，在V(園土)∶V(蛭石)=2∶1的栽培基質(zhì)中，移栽苗的生長(zhǎng)狀況最佳，移栽成活率最高，高達(dá)95.710%。而在栽培基質(zhì)中添加珍珠巖后，由此而組成的兩種培養(yǎng)基的移栽成活率均有所下降，其中V(園土)∶V(珍珠巖)=2∶1的培養(yǎng)基移栽成活率為87.140%，下降8.570%；由V(園土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=2∶1∶1的栽培基質(zhì)移栽成活率為90.000%，下降5.710%。原因可能是園土和蛭石構(gòu)成的栽培基質(zhì)質(zhì)地較緊實(shí)，持水力大，能夠貯存更多的水分[38]，而重瓣長(zhǎng)壽花原產(chǎn)非洲馬達(dá)加斯加，生長(zhǎng)過程中也需要較多水分，因而由園土和蛭石構(gòu)成的栽培基質(zhì)更能夠保證重瓣長(zhǎng)壽花移栽初期充足的水分供應(yīng)?；蛘呤菆@土與蛭石構(gòu)成的基質(zhì)具有適合重瓣長(zhǎng)壽花發(fā)育的養(yǎng)分供應(yīng)能力和酸堿度[39-40]。

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第一作者簡(jiǎn)介：范諸平，女，1993年8月生，東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，本科生。E-mail:2663168876@qq.com。 通信作者：張彥妮，東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，副教授。E-mail:ynzhang808@126.com。

收稿日期：2016年1月30日。

分類號(hào)S682.36;Q943.1

Establishing the Regeneration System for Double-flowered Kalanchoe blossfeldiana//

Fan Zhuping, Wang Lixue, Yang Dong, Cao Dechong, Yu Yi, Zhang Yanni(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P.R.China)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：54-58.

We established an in vitro culture system of double-flowered Kalanchoe blossfeldiana using leaves and stem segments by single and cross-over designs, and studied the effects of leaves and stems callus induction, differentiation, rooting with different hormone combination, and the effects of survival rate with different cultivating media.The stem segments were the most appropriate among all kinds of explants.The optimal medium for callus induction was MS medium supplemented with 0.10 mg·L-16-BA, 1.00 mg·L-12,4-D in which the stems had the highest induction rate of 100.000%.The best medium for callus differentiation was MS medium supplemented with 1.00 mg·L-16-BA, and the multiplication coefficient reached 19.920.The most suitable rooting medium was 1/2MS medium containing 0.50 mg·L-1IBA.The rooting rate was 100.000% and the root length was 3.87 cm.The best cultivation matrix volume proportion was 2∶1 of garden soil and vermiculite with the transplanting survival rate of 95.710%.

KeywordsDouble-flowered Kalanchoe blossfeldiana; Tissue culture; Callus; Regeneration system

1)國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510225064)、黑龍江省留學(xué)歸國(guó)科學(xué)基金項(xiàng)目(LC201410)。

責(zé)任編輯：任俐。