劉澤旭　徐國祺　王立海

(森林持續(xù)經(jīng)營與環(huán)境微生物黑龍江省重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

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乙醇水溶液提取樟樹葉活性成分工藝及其成分分析1)

劉澤旭徐國祺王立海

(森林持續(xù)經(jīng)營與環(huán)境微生物黑龍江省重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

摘要以樟樹葉提取率為響應(yīng)值，采用單因素試驗和響應(yīng)面法對提取時間、提取溫度、液料比和乙醇體積分數(shù)4個影響因素進行優(yōu)化選擇，確定最優(yōu)工藝參數(shù)；而后利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法對所得提取物進行成分分析。結(jié)果表明：各因素對樟樹葉提取率的影響由大到小依次為液料比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)，其中液料比屬極顯著影響因素；樟樹葉提取最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)45%，提取溫度58 ℃，提取時間78 min，液料比16(mL)∶1(g )，平均提取率達到19.33%；提取的樟樹葉提取物中含有大量醇烯化合物，其中異丁香酚甲醚(18.42%)、芳樟醇(11.59%)、反式-橙花叔醇(10.40%)、丁香酚甲醚(6.37%)等都是經(jīng)濟價值較高的化合物。

關(guān)鍵詞樟樹葉；樟樹葉活性成分；提取工藝參數(shù)

樟樹是樟科樟屬植物，屬常綠喬木，分布于臺灣及華東南部等長江流域以南地區(qū)，生長在亞熱帶土壤肥沃的向陽山坡、谷地及河岸平地[1]。研究表明，樟樹葉中富含樟腦和芳樟醇等物質(zhì)，因而樟樹葉被廣泛應(yīng)用于香精香料、醫(yī)藥、化工、食品和煙草等工業(yè)[2]。

馬英姿等[3]研究發(fā)現(xiàn)，樟樹葉精油對大腸桿菌等4種菌種具有較好的抑菌效果，但樟樹鮮葉和落葉提取率僅為0.46%和0.52%；徐國祺[4]發(fā)現(xiàn)，樟樹葉水提取物復(fù)配試劑可以明顯增強竹材的防霉耐腐性能，但微波提取樟樹葉提取物的平均提取率為2.514%；Yeh et al.[5]研究發(fā)現(xiàn)，樟樹葉和枝水提取物能提高南美白對蝦的抗病能力，但葉與枝水提物的提取率分別為1.15%和0.6%；李權(quán)[6]研究發(fā)現(xiàn)，樟樹葉木質(zhì)部甲醇提取物對木材腐朽菌有很好的抑制效果，而且超聲波—微波協(xié)同提取樟樹葉木質(zhì)部提取物的提取率最高為4.65%。雖然樟樹葉提取物有著廣闊的研究前景，但其提取率低，將影響其日后的推廣和應(yīng)用。

樟樹葉提取方法主要有微波輔助提取法、超臨界CO2法和水浴攪拌等方法[4]。微波輔助提取法具有操作簡便、省時迅速以及提取物質(zhì)純度高等優(yōu)點，但其試驗設(shè)備昂貴，提取成本高，使其不能在生產(chǎn)方面得到普及[7]。超臨界CO2法具有無毒、無味、不可燃，產(chǎn)品無有機溶劑殘留，提取效率高等優(yōu)點[8-9]，但其存在提取成本高以及提取率低等問題[4]。水浴攪拌法具有操作方便、試驗條件要求低、成本低和提取率高等優(yōu)點[10]。

本研究以樟樹葉提取率為響應(yīng)值，采用單因素試驗和響應(yīng)面法對其水浴攪拌提取工藝進行優(yōu)化，得到了樟樹葉的最優(yōu)工藝參數(shù)，而后利用頂空固相微萃取—氣相色譜—質(zhì)譜法對最優(yōu)條件下的提取物進行成分分析，為樟樹葉提取物的深入研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

樟樹葉2013年春季采自中南林業(yè)科技大學(xué)植物園。選取表面狀態(tài)良好的葉子隨機采自于不同的香樟樹(Cinnamomum camphora (Linn.) Presl)，均勻混合。將樟樹葉放置于室內(nèi)陰涼干燥處陰干，而后利用高速離心粉碎機研磨成過40～60篩子的粉末，收集樟樹葉粉末置于干燥培養(yǎng)皿中密封備用。

儀器：無水乙醇(分析純，天津市天理化學(xué)試劑有限公司)，蒸餾水；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型，國華電器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52AA型，上海亞榮生化儀器)；高速離心粉碎機(Q-250A3型，上海冰都電器有限公司)；電子分析天平(0.1 mg)(FA2001N型，鄭州時代儀器設(shè)備有限公司)；攪拌器(DK-98-IIA型，天津市泰斯特儀器有限公司)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent6890N型，美國Agilent公司)；PDMS固相萃取萃取頭(57318型，上海哈姆儀器技術(shù)有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1提取工藝的單因素試驗

水浴攪拌提取過程中主要的試驗因素為提取時間、提取溫度、液料比和乙醇體積分數(shù)。對這4個因素分別進行單因素試驗[11]，各因素單因素試驗設(shè)計見表1。

表1　單因素試驗設(shè)計

注：由于溫度過高會使樟樹葉部分化學(xué)成分大量揮發(fā)[4]，故提取溫度最高取65 ℃；當測定某一變量對提取率的影響時，其他條件始終保持不變；各變量的定值為提取時間60 min，提取溫度50 ℃，液料比12 mL∶1 g，乙醇體積分數(shù)40%。

1.2.2提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)先前單因素試驗的結(jié)果，以提取率作為響應(yīng)變量，對4個影響因素，提取時間、提取溫度、液料比與乙醇體積分數(shù)，進行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗[12-13]，各因素水平見表2。

表2　響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平

1.2.3樟樹葉提取率計算

利用電子天平稱取20 g樟樹葉粉末，放置于500 mL錐形瓶中，按照先前試驗要求調(diào)節(jié)各個因素，進行水浴攪拌提取。用真空泵和布氏漏斗抽取濾液，將濾液放置于已稱質(zhì)量的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(水浴溫度為40 ℃)，待旋蒸至質(zhì)量恒定，稱取蒸發(fā)瓶與剩余物的總質(zhì)量[10]。樟樹葉提取率的計算公式如下：

W=(m2-m1)/m0。

式中：W表示提取率(%)；m0表示樟樹葉粉末質(zhì)量(g)；m1表示旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶質(zhì)量(g)；m2表示蒸發(fā)瓶與剩余物總質(zhì)量(g)。

1.2.4優(yōu)化工藝驗證

根據(jù)先前單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗確定的最優(yōu)工藝參數(shù)，進行3次樟樹葉提取，計算提取率平均值和相對誤差，驗證響應(yīng)面的優(yōu)化結(jié)果，比較兩種優(yōu)化結(jié)果提取率的差異，相對誤差計算公式如下：

相對誤差=|y2-y1|/y1。

式中：y1表示提取率的預(yù)測值；y2表示提取率的實際值。

1.2.5頂空固相微萃取—氣相色譜—質(zhì)譜檢測方法

依據(jù)先前確定的最佳提取條件對樟樹葉進行提取，取1 g所得提取物，采用頂空固相微萃取技術(shù)進行預(yù)處理。頂空固相微萃取條件：在80 ℃下萃取60 min，在進樣口熱解析2 min。

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent公司生產(chǎn)的19091Z-433 HP-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱，載氣為氦氣。色譜柱程升條件為初始溫度40 ℃保持3 min，以5 ℃·min-1的速度升至100 ℃，再以20 ℃·min-1的速度升至250 ℃，保持10 min，分流比為50∶1。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊源(EI)，電子能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描質(zhì)量范圍為20-680 m/z。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

提取溫度對提取率的影響：當其他條件一定，提取溫度分別為45、50、55、60、65 ℃時，樟樹葉的提取率分別為15.71%、15.07%、17.59%、16.98%和13.83%。說明隨著溫度升高，樟樹葉提取率先增大后減小。溫度在55 ℃以下，提取率總體呈上升趨勢。溫度在55 ℃以上，提取率隨溫度的升高而逐漸減小。這是由于樟樹葉提取物中含有樟腦等揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)的揮發(fā)性會隨著溫度的升高而增強[1，4]，所以溫度較高時提取率不僅不會增加反而會減小。綜上所述，提取溫度以55 ℃為宜。

提取時間對提取率的影響：當其他條件一定，提取時間分別為50、60、70、80、90 min時，樟樹葉的提取率分別為14.18%、14.94%、17.85%、14.21%和14.17%。說明隨著提取時間的增加，樟樹葉提取率呈現(xiàn)出先增大后減小的變化趨勢。提取時間從50 min增加到70 min，提取率由14.18%提高到17.85%。而70 min以后，提取率隨著提取時間的增長而下降。說明提取時間以70 min為最佳。

液料比對提取率的影響：當其他條件一定，液料比(mL∶g)分別為10∶1、12∶1、14∶1、16∶1和18∶1時，提取率分別為12.23%、14.36%、19.06%、17.99%和13.72%。說明液料比由10 mL∶1 g增加到14 mL∶1 g的過程中，樟樹葉提取率逐漸增加，由12.23%提高到19.06%。液料比大于14 mL∶1 g之后，提取率隨著液料比的增加而減小。說明液料比以14 mL∶1 g為最佳。

乙醇體積分數(shù)對提取率的影響：當其他條件一定，乙醇體積分數(shù)分別為20%、30%、40%、50%和60%時，提取率分別為12.37%、13.37%、13.55%、18.51%和9.54%。說明乙醇體積分數(shù)由20%升高到50%的過程中，樟樹葉的提取率逐漸增加，從12.37%提高到18.51%。乙醇體積分數(shù)從50%增加到60%的過程中，提取率迅速下降。說明乙醇體積分數(shù)以50%為最佳。

2.2響應(yīng)面試驗設(shè)計

應(yīng)用Design-Expert 8.05軟件，采用Box-Benhnken進行試驗設(shè)計，對乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間和液料比4個單因素進行分析并得到試驗方案及結(jié)果(表3)。對表3中試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到結(jié)果如表4所示。以樟樹葉提取率為響應(yīng)值y，經(jīng)回歸擬合后得到回歸方程：

y=16.76-0.079A-0.093B-0.32C+1.34D-0.29AB-

0.098AC-0.56AD+0.77BC+0.82BD+0.95CD-0.72A2-

0.42B2+0.39C2-0.31D2。

由表4可知，上述回歸方程的R2=0.886 2，該模型的F值為7.79，P值為0.000 2<0.01(極顯著)，而失擬項P值為0.796 7>0.05(不顯著)。說明該回歸方程能較好地描述各個因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可利用該方程確定樟樹葉提取率的最佳提取工藝。

由表4可看出，各因素中一次項液料比(D)為極顯著影響因素，交互項提取時間和液料比(CD)為極顯著影響因素，交互項提取溫度和提取時間(BC)與交互項提取時間和液料比(CD)為顯著影響因素，二次項乙醇體積分數(shù)和乙醇體積分數(shù)A2為極顯著影響因素。說明各因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。由對提取率的回歸系數(shù)檢驗值F可知，各因素對樟樹葉提取率的影響由大到大小依次為液料比(D)、提取時間(C)、提取溫度(B)、乙醇體積分數(shù)(A)。

表3　響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表4　方差分析

注：** 表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。

根據(jù)回歸方程作出各因素交互作用的響應(yīng)曲面圖(圖1)。由圖1可知，提取溫度(B)和提取時間(C)、提取溫度(B)和液料比(D)以及提取時間(C)與液料比(D)的交互影響顯著，它們都表現(xiàn)為曲線圖陡峭，等高線密集，這與方差分析結(jié)果相一致。

圖1　雙因素交互作用對樟樹葉提取率的響應(yīng)面圖

2.3工藝優(yōu)化與驗證

以單因素試驗所得結(jié)果確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)50%，提取溫度55 ℃，提取時間70 min，液料比14 mL∶1 g。進行三次重復(fù)驗證試驗，所得提取率分別為16.54%、16.60%和16.76%。計算可知此條件下提取率平均值為16.63%。

應(yīng)用Design-Expert 8.05軟件，根據(jù)得到的回歸方程，算得樟樹葉提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)45.39%，提取溫度為58.47 ℃，提取時間78.31 min，液料比15.92 mL∶1 g，預(yù)測提取率為19.49%。為了便于試驗操作，乙醇體積分數(shù)取45%，提取溫度取58 ℃，提取時間取78 min，液料比取16 mL∶1 g。進行三次重復(fù)驗證試驗，所得結(jié)果如表5所示。由表5可知，三次的提取率相對誤差均小于2%，平均提取率相對誤差值小于1%，說明提取率預(yù)測值合理可靠。相對于單因素試驗所確定的最優(yōu)工藝參數(shù)，其提取率相對提高了17.20%。

表5　響應(yīng)面優(yōu)化工藝的提取率與相對誤差

響應(yīng)面法是將響應(yīng)受多個變量影響的問題進行建模和分析并以此來優(yōu)化響應(yīng)的一種回歸分析方法[12]，[14]1-10。它具有試驗次數(shù)少，周期短，建立的回歸方程精度高等優(yōu)點[15-16]，還能通過直觀地圖形分析各個因素之間的交互作用[11，17-18]。而單因素試驗只能單獨分析各個變量與響應(yīng)值的關(guān)系，不能分析各個因素的交互性對響應(yīng)值的影響，使其所得到的優(yōu)化值存在一定的局限性[19-20]。本研究表明，在單因素試驗所確定的最佳提取工藝條件下，提取率平均值為16.63%。而在響應(yīng)面法所確定的最佳提取工藝條件下，提取率預(yù)測值為19.49%，其相對誤差小，合理可靠。相對于單因素試驗，其提取率相對提高了17.20%，說明響應(yīng)面法能更好地優(yōu)化樟樹葉提取工藝。

2.4提取物成分分析

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)對樟樹葉提取物化學(xué)成分進行檢測，總離子流圖中出現(xiàn)了45個峰，通過標準庫對照分析，鑒定出39種化學(xué)成分，占提取物化合物質(zhì)量分數(shù)的96.79%，各化學(xué)成分質(zhì)量分數(shù)如表6所示。

表6　樟樹葉提取物化學(xué)成分的GC-MS分析結(jié)果

由表6可知，樟樹葉乙醇水溶液提取物中含有大量醇烯化合物，其中異丁香酚甲醚(18.42%)、芳樟醇(11.59%)、反式-橙花叔醇(10.40%)、環(huán)丁烷甲酸-十三碳-2-炔基酯(9.20%)、丁香酚甲醚(6.37%)、桉油烯醇(5.03%)、6-芹子烯-4醇(3.81%)、1-石竹烯(3.66%)、松油醇(3.35%)、a-芹子烯(3.25%)、α-石竹烯(2.60%)和1,3,3-三甲基-2-(2-甲基-環(huán)丙基)-環(huán)己烯(2.54%)等，共占樟樹葉提取物化學(xué)成分質(zhì)量分數(shù)的80.22%。

異丁香酚甲醚為中國GB2760-1996規(guī)定允許使用的食用香料，其主要用于配制香精和香料[21-22]。研究表明，芳樟醇具有特殊的香氣而被用于香料香精的制造，它還具有抗菌、抗病毒和鎮(zhèn)靜等作用而被用于醫(yī)療保健[23]。反式橙花叔醇又名反式苦橙油醇，為降香油的主要成分，降香是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有行氣活血和止血等功效[24-25]。丁香酚甲醚具有丁香和康乃馨的香氣，常用于配制香精，它還作為多種果蠅的誘惑劑，且在醫(yī)學(xué)上有鎮(zhèn)咳、祛痰、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛功能[26]。由樟樹葉提取物成分分析結(jié)果表明，最優(yōu)條件下提取的樟樹葉提取物中含有以上化學(xué)成分的含量都相對較高。且這些化學(xué)成分人工合成程序復(fù)雜，合成成本較高。說明樟樹葉乙醇水提取物具有較高的經(jīng)濟價值和較好的研究前景。

3結(jié)論與討論

在提取過程中，溶劑浸潤物料，滲入植物組織和細胞中，溶解組織中的活性成分，使其游離于組織或細胞，此時，由于細胞內(nèi)外有效成分存在濃度差，形成內(nèi)高外低的滲透壓，使有效成分向組織或細胞外擴散。在不破壞活性成分的溫度內(nèi)，提取溫度越高，活性成分運動速度越快，擴散作用的速度越快，提取速率也越快，進而影響提取率的大小。而活性成分在乙醇水溶液中的溶解度是一定的，隨著液料比的增大，溶液所能溶解的活性成分就越多，進而影響提取率的大小。在提取過程中，攪拌使固液兩相的接觸面積增大、邊界層更新快[27]。故提取時間越長，攪拌時間越長，固液兩相的接觸越充分，提取效果越好。

一般有機化合物的極性較小，大多數(shù)有機化合物在水中的溶解度都很小，但它們易溶于極性小的有機溶劑。而乙醇水溶液的極性介于水和乙醇之間。乙醇體積分數(shù)的改變使其極性發(fā)生變化，從而影響活性成分的溶解性，導(dǎo)致提取率發(fā)生變化[5]，[14]11-15。

本研究通過對樟樹葉乙醇水溶液提取工藝優(yōu)化及其成分分析得出結(jié)論，樟樹葉最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)45%，提取溫度58 ℃，提取時間78 min，液料比16 mL∶1 g，平均提取率達到19.33%。各因素對樟樹葉提取率的影響由大到小依次為液料比(D)、提取時間(C)、提取溫度(B)、乙醇體積分數(shù)(A)，其中D屬極顯著影響因素；最優(yōu)條件下提取的樟樹葉提取物中含有大量醇烯化合物，其中異丁香酚甲醚、芳樟醇、反式-橙花叔醇、丁香酚甲醚等都是經(jīng)濟價值較高的化合物。說明該方法下得到的樟樹葉乙醇水提取物具有較高的經(jīng)濟價值和較好的研究前景。

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第一作者簡介：劉澤旭，男，1990年1月生，森林持續(xù)經(jīng)營與環(huán)境微生物黑龍江省重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail:1127844691@qq.com。 通信作者：王立海，森林持續(xù)經(jīng)營與環(huán)境微生物黑龍江省重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail:wanglihai2012@126.com。

收稿日期：2015年9月8日。

分類號S718.43

Extraction Technology of Cinnamomum camphora Leaves through Stirring and Its Compounds//

Liu Zexu, Xu Guoqi, Wang Lihai(Key Laboratory of Sustainable Forest Management & Environmental Microbiology in Heilongjiang Province, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P.R.China)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：34-39.

For the optimum extraction technology and compound in the extraction of camphor leaves, we used response surface method and single-factor experiments method to optimize the extraction techniques of camphor leaves.Extraction time, extraction temperature, liquid-material ratio and ethanol concentration were served as independent variables while the extraction rate of camphor leaves was served as the dependent variable.We applied the HS-SPME coupled with GC-MS method to analyze the compounds in the extraction under the optimal parameters.The sequence of every factor for the extraction rate was liquid-material ratio, extraction time, extraction temperature and ethanol concentration.Liquid-material ratio was the extremely significant factor.The optimal extraction parameters of extraction rate of camphor leaves were ethanol concentration of 45%, liquid-material ratio of 16∶1(mL·g-1), extraction temperature of 58 ℃ and extraction time of 78 min.Under the optimal parameters, the average extraction rate of camphor leaves was 19.33%.The camphor leaves ethanol-water extraction, under the optimal parameters, contain plenty of alfin compounds including Methyl isoeugenol (18.42%), Linalool (11.59%), Nerolidol (10.40%), and Methyl eugenol (6.37%) et al., which had high economic value.

KeywordsCamphor leaves; Activity compounds of camphor leaves; Extraction parameters

1)教育部博士點基金項目(20130062110001)。

責(zé)任編輯：任俐。