田奇琳，林玉玲，鄭慶游，蘇榮峰，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州350002)

?

龍眼DlPPO1基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控分析

田奇琳，林玉玲，鄭慶游，蘇榮峰，賴鐘雄*

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州350002)

摘要:該研究根據(jù)同源克隆技術(shù)，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，以‘四季蜜’龍眼葉片cDNA為模板，獲得龍眼多酚氧化酶基因(polyphenol oxidase，PPO)的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的cDNA全長(zhǎng)序列(KM387405、KM516087和KM516088)和1條DNA序列DlPPO1(KU837229)。DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的全長(zhǎng)分別為1 969、1 960和1 920 bp，包含相同的完整開(kāi)放閱讀框1 800 bp并編碼599個(gè)氨基酸；該基因與荔枝、橄欖和棗等物種的PPO基因同源性較高。生物信息學(xué)分析表明，DlPPO1保守結(jié)構(gòu)域具有多酚氧化酶的典型結(jié)構(gòu)域特征。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)DlPPO1表達(dá)結(jié)果表明，在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中，DlPPO1從心形胚時(shí)期開(kāi)始上調(diào)表達(dá)至子葉胚時(shí)期達(dá)到最高，推測(cè)其在龍眼體胚發(fā)生中后期可能發(fā)揮重要作用； DlPPO1在龍眼葉片中表達(dá)量最高，其次是花芽，而在其他組織部位表達(dá)量較低。激素和非生物脅迫處理下的表達(dá)分析表明，水楊酸(SA)、低濃度茉莉酸甲酯(MeJA)、NaCl、甘露醇及PEG可誘導(dǎo)DlPPO1基因上調(diào)表達(dá)，這些表達(dá)模式暗示其可能參與多種非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程。

關(guān)鍵詞:龍眼；體細(xì)胞胚胎發(fā)生；多酚氧化酶；非生物脅迫；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

多酚氧化酶又叫做兒茶酚酶、酪氨酸酶、綠原酸酶和漆酶等，大體上分成兩類：兒茶酚氧化酶和漆酶，習(xí)慣上把兒茶酚氧化酶稱為多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)，它與漆酶(p-diphenol oxadise 或 Laccase)有明顯的區(qū)別[1]。PPO是一類由核編碼且結(jié)合銅離子的結(jié)構(gòu)蛋白，催化單元酚、雙元酚等多元酚氧化成醌類，普遍存在于動(dòng)植物、真菌和細(xì)菌中。PPO對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的意義，如促進(jìn)乙烯代謝過(guò)程[2]；而且PPO在植物組織和器官中的分布具有時(shí)空特異性，如在番茄中，PPOB基因在大多數(shù)組織的維管和里層中表達(dá)量高，且在幼嫩組織中表達(dá)量高且隨著植株的發(fā)育表達(dá)量降低，而在小麥中，PPO基因在胚芽鞘和胚根中表達(dá)強(qiáng)烈[1-2]。PPO可催化木質(zhì)素和醌類化合物的生成，構(gòu)成保護(hù)性屏障而使細(xì)胞免受或減輕病菌病蟲的侵害，在植物逆境防御中起著重要作用[3-4]；逆境脅迫或病原體侵染等外界因素誘導(dǎo)植物產(chǎn)生PPO活性，其中也涉及到茉莉酸等激素信號(hào)途徑在植物防御反應(yīng)中的作用[5]。在植物體內(nèi)，miRNA 通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)的靶基因來(lái)控制植物參與環(huán)境脅迫的響應(yīng)，PPO則是受到miR1444a調(diào)控的靶基因，參與楊樹(shù)對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答響應(yīng)[6]。

近年來(lái)PPO的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，許多熱帶南亞熱帶木本果樹(shù)(如龍眼、荔枝、橄欖等)，在果實(shí)貯藏保鮮及組織培養(yǎng)過(guò)程中容易發(fā)生褐變，而多酚氧化酶的酶促反應(yīng)是影響褐變的主要原因[7-8]。龍眼果皮褐變和果肉自溶等問(wèn)題是導(dǎo)致龍眼采后難以長(zhǎng)期貯存的重要原因，關(guān)于龍眼果皮和果肉等組織的多酚氧化酶活性研究已有報(bào)道，如經(jīng)50 ℃熱水處理10 min可有效降低果皮PPO活性，保持較高的果皮總酚含量，可有效降低采后龍眼果實(shí)酚類物質(zhì)代謝，從而延緩采后龍眼果實(shí)果皮褐變的發(fā)生；PPO酶等同工酶也與龍眼果實(shí)自溶的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。許多植物PPO的研究主要集中在酶學(xué)特性上[11-12]，其生理機(jī)制尚不明確，近年來(lái)許多植物尤其是果樹(shù)PPO基因已經(jīng)得到克隆[13-16]，但植物PPO在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和逆境脅迫表達(dá)調(diào)控機(jī)制方面的研究還很少。榮霞分離獲得橄欖PPO基因并發(fā)現(xiàn)該基因在橄欖試管苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能與幼嫩組織的啟動(dòng)分化有關(guān)[15]；王家保等分離獲得荔枝PPO基因，且檢測(cè)到該基因在果實(shí)采后貯藏早期果皮中上調(diào)表達(dá),可能提高PPO活性從而加劇荔枝果實(shí)采后過(guò)程中的果皮褐變[16]。植物胚胎發(fā)育過(guò)程的遺傳調(diào)控可以作為探索植物發(fā)育過(guò)程中形態(tài)發(fā)生規(guī)律及控制機(jī)理的基礎(chǔ)手段，且龍眼中PPO基因的克隆及表達(dá)調(diào)控機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究利用龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)[17]，分離、鑒定一個(gè)完整的PPO基因，并對(duì)其在龍眼體胚發(fā)育過(guò)程、不同組織器官、以及逆境脅迫處理下過(guò)程中的差異表達(dá)進(jìn)行分析，以期為探索多酚氧化酶與龍眼生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)之間的關(guān)系提供線索。

1材料和方法

1.1材料

以‘四季蜜’品種龍眼的葉片作為基因克隆的材料，以 ‘紅核子’ 品種[17]龍眼胚性愈傷組織、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚以及‘四季蜜’品種[18]龍眼的根、葉、花和果實(shí)等為用于檢測(cè)基因在龍眼組織不同部位的差異表達(dá)材料。對(duì)培養(yǎng)18 d的龍眼胚性愈傷組織進(jìn)行茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)兩種激素處理：200 mL錐形瓶中加入40 mL MS(蔗糖20 g/mL)液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基內(nèi)依次添加一種激素至終濃度依次為：0、25、50、75和100 μmol/L，3次重復(fù)，選取松散、淺黃且顆粒較細(xì)的龍眼愈傷大約0.5g輕輕放入培養(yǎng)基中，將錐形瓶置于搖床110 r/min，25 ℃，黑暗培養(yǎng)24 h。脅迫因素處理：200 mL錐形瓶中加入40 mL MS(蔗糖20 g/mL)液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基內(nèi)各添加NaCl(150 mmol/L)、甘露醇(150 mmol/L)、PEG-4000(10%)和ABA(10 μmol/L)，3次重復(fù)后選取松散、淺黃且顆粒較細(xì)的龍眼愈傷大約0.5 g輕輕放入培養(yǎng)基中，將錐形瓶置于搖床110 r/min，25 ℃，黑暗培養(yǎng)1、2、4、8、12、16和24 h后，分別收集以上處理材料用于RNA提取和定量表達(dá)分析。

1.2方法

1.2.1DNA和總RNA提取及cDNA合成采用改良CTAB法[19]提取DNA，采用TriPure(Roche)試劑盒提取總RNA，并采用GeneRacer Kit(Invitrogen)進(jìn)行RT-PCR反轉(zhuǎn)錄。qPCR的cDNA合成采用PrimeScript?RT reagent Kit(TaKaRa)，具體方法參照說(shuō)明書。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank報(bào)道的PPO氨基酸保守序列和核酸序列分別設(shè)計(jì)同源克隆引物DlPPO1-F1和簡(jiǎn)并引物DlPPO1-R1進(jìn)行DlPPO1部分cDNA序列的擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增得到的部分cDNA序列設(shè)計(jì)RACE引物，用于擴(kuò)增DlPPO1基因cDNA 3′末端和5′末端序列；根據(jù)獲得的3′末端和5′末端序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行DlPPO1基因開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增。研究中所用的引物名稱及序列見(jiàn)表1，引物委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30～35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。

1.2.3目的片段的回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目的條帶采用BIOMIGA公司 DNA快速純化回收試劑盒進(jìn)行回收，采用pMD18-T Vector(Takara Biotechnology)或者pEASY-T5 Zero Cloning Kit(TransGen Biotech)進(jìn)行目的片段的克隆。陽(yáng)性克隆子的測(cè)序委托上海博尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.4生物信息學(xué)分析采用NCBI的Blast和DNAMAN 6.0對(duì)獲得的基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析。DlPPO1蛋白的生物信息學(xué)分析，采用以下分析工具進(jìn)行：蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的分析(ExPASy Protparam, http://web.expasy.org/protparam/),信號(hào)肽預(yù)測(cè)(SignalP 4.1 Server, http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)(PSORT, http://psort. hgc.jp/)，蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)(EMBnet TMpred, http://www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html)，磷酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)(NetPhos 2.0 Server, http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/)，蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(NCBI-ProteinTools, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(PSIPRED Protein Structure Prediction Server, http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/)，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(SWISS-MODEL, http://swissmodel.expasy.org/)，分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(Mega 5)。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)參照Lin和Lai[20]的步驟進(jìn)行，儀器為L(zhǎng)ightCycler 480(Roche Applied Science, Switzerland)。反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)10 μL，cDNA 1 μL，引物(DlPPO1-QF、DlPPO1-QR)各0.8 μL，總共體積20 μL。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)；通過(guò)熔解曲線分析確定擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。以eIF4A、EF-1A和Fe-SOD為內(nèi)參基因[20]。

表1　DlPPO1基因克隆和qPCR引物列表

2結(jié)果與分析

2.1龍眼DlPPO1基因cDNA全長(zhǎng)序列的獲得

以龍眼葉片cDNA為模板，以DlPPO1-F1和DlPPO1-R1為引物擴(kuò)增獲得1 137 bp的序列，經(jīng)NCBI的Blast比對(duì)推測(cè)該序列為龍眼PPO基因保守區(qū)部分序列，再根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)RACE引物，獲得PPO基因的5′末端序列和3′末端序列，并在其5′末端和3′末端序列設(shè)計(jì)特異性引物DlPPO1-CF1和DlPPO1-CR1進(jìn)行ORF驗(yàn)證，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TGA，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)為 1800 bp，編碼599個(gè)氨基酸；DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c的5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)相同，長(zhǎng)度為32 bp，3′非編碼區(qū)(3′-UTR)長(zhǎng)度不同，分別為137、128和88 bp， 且polyA長(zhǎng)度分別為20、28和23 bp。將該序列推導(dǎo)的編碼區(qū)氨基酸序列在NCBI進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)DlPPO1與其他植物如荔枝、橄欖、胡楊等的PPO基因高度同源，其中與荔枝的一致性最高，達(dá)94%。經(jīng)結(jié)構(gòu)域分析推測(cè)該基因?yàn)辇堁跴PO基因，該基因3個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列在GenBank中登錄，分別命名為DlPPO1-a、DlPPO1-b和DlPPO1-c，登錄號(hào)分別為KM387405、KM516087和KM516088。以‘四季蜜’龍眼葉片DNA為模板，以DlPPO1-CF1和DlPPO1-CR1為引物擴(kuò)增獲得1條長(zhǎng)度為2 163 bp DNA序列，命名為DlPPO1(GenBank登錄號(hào)KU837229)；DlPPO1基因僅含有1個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為214 bp。

2.2生物信息學(xué)分析

2.2.1龍眼DlPPO1蛋白基本性質(zhì)分析采用ExPASy中的蛋白質(zhì)基本參數(shù)分析工具 ProtParam 對(duì)DlPPO1基本參數(shù)進(jìn)行計(jì)算表明，DlPPO1編碼的蛋白為堿性蛋白，具有親水性，且?guī)д姲被釘?shù)量(Arg+Lys)均大于帶負(fù)電的氨基酸數(shù)量(Asp+Glu)；DlPPO1是不穩(wěn)定蛋白。采用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)表明DlPPO1不含信號(hào)肽，不是分泌蛋白。采用PSORT分析顯示DlPPO1蛋白定位于葉綠體基質(zhì)的可能性最大，分值為0.892。在亞細(xì)胞定位分析的基礎(chǔ)上，利用ExPASy中的TMpred工具進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)顯示，DlPPO1具有跨膜結(jié)構(gòu)域，可能與膜定位和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，DlPPO1蛋白共含35個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)21個(gè)，蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)分別為8個(gè)和6個(gè)，DlPPO1蛋白中絲氨酸的比例明顯大于蘇氨酸和酪氨酸。對(duì)DlPPO1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大，而α螺旋和β折疊所占比例相當(dāng)；在了解蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)的結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)論相符。使用NCBI-CD-Search工具進(jìn)行蛋白保守區(qū)域分析，結(jié)果顯示DlPPO1氨基酸序列中173-382區(qū)域與酪氨酸酶超家族的核心序列高度同源，具有PPO蛋白的典型特征，含PPO1_DWL和PPO1_KFDV兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.2.2龍眼DlPPO1基因相關(guān)MicroRNA預(yù)測(cè)與分析miRNAs作為一種調(diào)節(jié)分子，參與控制植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答。已有研究表明miRNAs在植物花、種子、葉、根和維管等形態(tài)建成和發(fā)育中均發(fā)揮重要作用；且miRNAs除了可以響應(yīng)激素信號(hào)調(diào)控并參與控制其他miRNAs的生物合成，還可以通過(guò)應(yīng)答干旱脅迫、病毒侵染等逆境脅迫調(diào)控基因表達(dá)。因此，研究miRNAs對(duì)靶基因的調(diào)控作用，對(duì)于研究靶基因如何參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控及環(huán)境脅迫響應(yīng)有重要意義。利用在線軟件psRNA Target等[21]對(duì)調(diào)控DlPPO1的miRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果在楊樹(shù)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)發(fā)現(xiàn)DlPPO1存在楊樹(shù)miR1444(ptc-miR1444)的翻譯抑制位點(diǎn)，說(shuō)明在龍眼DlPPO1可能也存在與ptc-miR1444類似抑制位點(diǎn)，受到龍眼中類似miRNA成員的調(diào)控。

2.2.3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，龍眼DlPPO1與同科的荔枝(JF926153.1)PPO距離較近，與木犀科植物橄欖(JQ319005.1)、鼠李科植物棗(HQ634289.1)和蕓香科植物甜橙(XM_006468155.1)等的PPO的遺傳距離也較近(圖2)。

2.3龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中DlPPO1基因表達(dá)模式

植物基因在胚胎發(fā)育過(guò)程的轉(zhuǎn)錄水平變化可為探索其在植物發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供線索。DlPPO1基因在龍眼體胚發(fā)生不同時(shí)期(胚性愈傷組織、不完全緊實(shí)結(jié)構(gòu)、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明，從胚性愈傷組織時(shí)期到心形胚時(shí)期的DlPPO1基因的轉(zhuǎn)錄水平一直相對(duì)較低，而從心形胚開(kāi)始逐漸上調(diào)，魚雷形胚時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平約為愈傷組織時(shí)期的4倍，子葉胚時(shí)期達(dá)到最高，約為愈傷組織時(shí)期的6倍(圖3)。說(shuō)明在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中，DlPPO1基因主要在后期即子葉胚時(shí)期表達(dá)。

2.4DlPPO1基因的組織特異性表達(dá)分析

為進(jìn)一步探索DlPPO1基因的組織差異性表達(dá)特點(diǎn)，對(duì)其在龍眼不同組織部位(根、葉、花芽、成花、幼果、成熟果、果皮、果肉和種子)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，DlPPO1基因在葉片中表達(dá)量最高，在成花中也有少量存在，在龍眼其他組織部位表達(dá)量較低(圖4)。說(shuō)明在龍眼生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，DlPPO1基因主要在葉片和花中表達(dá)。

分支上的數(shù)字代表1 000次Bootstrap重復(fù)驗(yàn)證中該節(jié)點(diǎn)的可信度百分比值圖2　DlPPO1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Numbers at the nodes represent the bootstrap values based on 1 000 replicationsFig. 2　Phylogenetic tree for DlPPO1

圖1　DlPPO1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 1　Functional domains prediction for DlPPO1

2.5DlPPO1基因的激素應(yīng)答及脅迫響應(yīng)

植物PPO如何應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化及其反應(yīng)機(jī)制的研究具有重要意義。低濃度MeJA誘導(dǎo)DlPPO1的表達(dá)，而高濃度MeJA抑制DlPPO1的表達(dá)，說(shuō)明DlPPO1基因具有較復(fù)雜的茉莉酸響應(yīng)機(jī)制；隨著SA處理濃度的提高，DlPPO1基因表達(dá)量整體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，說(shuō)明SA對(duì)DlPPO1具有正調(diào)控作用(圖5)。不同非生物脅迫的時(shí)序表達(dá)分析表明，NaCl模擬的鹽脅迫和甘露醇模擬的滲透脅迫處理下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)DlPPO1基因總體表達(dá)量上升，而PEG模擬干旱脅迫也誘導(dǎo)DlPPO1表達(dá)，說(shuō)明DlPPO1參與對(duì)鹽脅迫、滲透脅迫和干旱脅迫等多種非生物脅迫過(guò)程，其中對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)最為顯著。此外，ABA處理下DlPPO1基因的表達(dá)水平相對(duì)平穩(wěn)，說(shuō)明DlPPO1并不直接依賴于ABA激素信號(hào)途徑(圖6)。

EC.松散型胚性愈傷組織；ICpEC.不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)；GE.球形胚；HE.心形胚；TE.魚雷形胚；CE.子葉胚圖3　龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中DlPPO1的相對(duì)表達(dá)量EC. embryogenic callus; ICpEC. incomplete compact pro-embryogenic cultures; GE. globular embryos; HE. heart-shaped embryos; TE. torpedo-shaped embryos; CE. cotyledon embryos.Fig. 3　Relative expression of DlPPO1 at different stages of longan SE

R.根；L.葉；FB.花芽；F.成花；YF.幼果；MF.成熟果；P.果肉；PC.果皮；S.種子圖4　龍眼不同組織部位DlPPO1的相對(duì)表達(dá)量R. Roots; L. Leaves; FB. Floral buds; F. Flowers; YF. Young fruits; MF. Mature fruits; P. Pulp; PC. Pericarp; S. Seeds.Fig. 4　Relative expression of DlPPO1 in different tissues of longan

3討論

3.1龍眼DlPPO1的潛在功能

生物膜將細(xì)胞分隔成帶有不同種類蛋白質(zhì)的細(xì)胞器，并發(fā)揮各自不同的功能，蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分析可以為研究其功能提供線索。由于PPO屬于核基因編碼的質(zhì)體酶，基因在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)后需經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)體靶位點(diǎn)而發(fā)揮作用[22]，而本研究預(yù)測(cè)的DlPPO1具有較豐富跨膜結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，正符合該基因的作用特征。質(zhì)體醌是一種醌分子，與光合作用中的光反應(yīng)的電子傳遞鏈有關(guān)。經(jīng)本研究中預(yù)測(cè)DlPPO1可能定位于葉綠體基質(zhì)中的類囊體上，推測(cè)DlPPO1有可能參與葉綠體中質(zhì)體醌的形成，可能間接影響龍眼光合作用的電子傳遞鏈反應(yīng)。

圖5　外源激素處理下DlPPO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5　Relative expression of DlPPO1 in response to exogenous phytohormones

圖6　非生物脅迫因素處理下DlPPO1 的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6　Relative expression of DlPPO1 in response to abiotic stress

本研究中DlPPO1蛋白的結(jié)構(gòu)特征符合前人關(guān)于PPO的報(bào)道。DlPPO1具有PPO蛋白的典型特征，含PPO1_DWL和PPO1_KFDV兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，同時(shí)還含有兩個(gè)保守的銅離子束縛區(qū)CuA和CuB雙結(jié)合位點(diǎn)[23]。另外DlPPO1 在龍眼中可能存在與ptcmiR1444s類似的翻譯抑制位點(diǎn)。

3.2DlPPO1的組織表達(dá)特性

植物PPO在不同組織中的表達(dá)具有特異性，如蘋果PPO在幼莖、幼葉、花瓣、枝皮等組織中均有表達(dá)，在幼葉中表達(dá)量最高而在花瓣中的表達(dá)量最低[24]；橄欖中幼嫩組織器官的PPO轉(zhuǎn)錄水平高于成熟組織[15]；荔枝PPO在花和葉中表達(dá)量最高，在果肉中表達(dá)量最低[16]。盡管果樹(shù)中有關(guān)于PPO在植物若干組織部位的差異性表達(dá)研究，但在種子形成之前的胚胎發(fā)育階段的表達(dá)調(diào)控研究尚未有報(bào)道，且龍眼PPO基因的表達(dá)調(diào)控研究仍為空白。龍眼胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[25]中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PPO基因的記錄，由此可初步推測(cè)，DlPPO1可能在龍眼胚胎發(fā)育早期表達(dá)量較低或者以其他前體等形式存在。通過(guò)對(duì)DlPPO1基因的在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程的差異表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，DlPPO1從體胚發(fā)育中期開(kāi)始積累，到子葉胚時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)早期顯著上調(diào)，說(shuō)明DlPPO1在龍眼體胚發(fā)育后期開(kāi)始發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能為參與幼胚發(fā)育及后期萌發(fā)等過(guò)程中的酚類氧化和木質(zhì)素形成過(guò)程儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量。DlPPO1在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍需要今后進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。組織特異性表達(dá)分析表明，DlPPO1在龍眼葉片中表達(dá)量最高，可能與其亞細(xì)胞定位于葉綠體基質(zhì)有關(guān)；其次在花芽表達(dá)量較高，可能原因?yàn)橄鄬?duì)較高的PPO活性有利于花芽分化[26]；而DlPPO1基因的在其他組織部位幾乎無(wú)表達(dá)，可見(jiàn)其表達(dá)具有組織特異性，且龍眼中可能還存在其他成員以實(shí)現(xiàn)PPO在龍眼不同組織部位的氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)。

3.3DlPPO1可能參與脅迫應(yīng)答

激素在植物應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，已知茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)可作為植物抗病響應(yīng)所需的信號(hào)分子來(lái)激活植物防御機(jī)制[27]；JA和SA分別與植物誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性 (ISR)和系統(tǒng)獲得性抗性 (SAR)有關(guān)[28]；植物體內(nèi)ABA是應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫的重要信號(hào)分子，許多逆境條件下其含量升高，從而提高植物自身抗逆性以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境[29]。有研究指出，植物激素信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間和豐度在決定植物病害程度中起著關(guān)鍵作用[30]。本研究中，DlPPO1的表達(dá)受到低濃度MeJA、SA、鹽脅迫、滲透脅迫和干旱脅迫的誘導(dǎo)，其中鹽脅迫的誘導(dǎo)作用最為顯著，而ABA對(duì)DlPPO1并沒(méi)有顯著的誘導(dǎo)作用，可見(jiàn)DlPPO1可能不直接依賴于ABA的逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而可能是通過(guò)JA或SA的逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物對(duì)脅迫的抗性。另外，楊樹(shù)miR1444可能通過(guò)作用于PPO基因參與毛果楊對(duì)外界環(huán)境脅迫的應(yīng)答[6, 31]；本研究在楊樹(shù)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)分析到DlPPO1也存在楊樹(shù)miR1444翻譯抑制位點(diǎn)，可見(jiàn)龍眼中可能也存在miR1444類似成員通過(guò)調(diào)控龍眼PPO的活動(dòng)以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化?？傊?，究竟DlPPO1在龍眼體胚中如何調(diào)節(jié)植物細(xì)胞以應(yīng)對(duì)脅迫，如何應(yīng)答逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列問(wèn)題還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1]王蕾. 小麥PPO基因變異及Ppo-A1 基因多態(tài)性與面粉白度關(guān)聯(lián)性研究[D]. 陜西楊陵: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2012.

[2]NEWMAN S M, TANTASAWAT P, STEFFENS J C. Tomato polyphenol oxidase B is spatially and temporally regulated during development and in response to ethylene[J].Molecules, 2011, 16(1): 493-517.

[3]FUERST E P, ANDERSON J V, KENNEDY A C,etal. Induction of polyphenol oxidase activity in dormant wild oat (Avenafatua) seeds and caryopses: a defense response to seed decay fungi[J].WeedScience, 2011, 59(2): 137-144.

[4]MAHANIL S, ATTAJARUSIT J, STOUT M J,etal. Overexpression of tomato polyphenol oxidase increases resistance to common cutworm[J].PlantScience, 2008, 174(4): 456-466.

[5]MAYER A M. Polyphenol oxidases in plants and fungi: Going places? A review[J].Phytochemistry, 2006, 67(21): 2 318-2 331.

[6]崔秀娜, 袁麗釵, 蘇曉娟,等. miR1444a參與毛果楊對(duì)鋅脅迫的響應(yīng)[J]. 中國(guó)科學(xué):生命科學(xué), 2012,42(10):850-860.

CUI X N, YUAN L C, XU X J,etal. miR1444a is involved in the response ofPopulustrichocarpato zinc stress. [J].ScientiaSinicaVitae, 2012, 42(10): 850-860.

[7]孫健, 李麗, 等. 荔枝、龍眼采后酶促褐變反應(yīng)化學(xué)機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 43(10):1 561-1 568.

SUN J, LI L,etal. Chemical mechanism advances of enzymatic browning reaction in postharvest lychee and longan fruits[J].JournalofSouthernAgriculture, 2012, 43(10): 1 561-1 568.

[8]張振霞, 洪萍. 橄欖總多酚含量及多酚氧化酶活性與組培褐變的關(guān)系[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 26(22):54-57.

ZHANG ZH X, HONG P. The connection between concentration of total polyphenol, activity of polyphenol oxidase and browning of explants inCanariumalbum(Lour.) Rauesch[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 2010, 26(22): 54-57.

[9]趙云峰, 林河通, 林藝芬,等. 熱處理延緩采后龍眼果實(shí)果皮褐變及其與酚類物質(zhì)代謝的關(guān)系[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014(5):218-224.

ZHAO Y F, LIN H T, LIN Y F,etal. Effect of heat treatment on browning delaying and phenolics metabolism in pericarp of harvested longan fruit[J].ModernFoodScienceandTechnology, 2014, (5): 218-224.

[10]陳子健, 吳振先, 等. 龍眼果肉自溶與部分氧化還原酶同工酶變化的關(guān)系[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2014,(7):1 434-1 438.

CHEN Z J, WU ZH X,etal. Relationship between longan pulp-breakdown and the changes of some oxidoreductase isozymes[J].ChineseJournalofTropicalCrops, 2014,(7): 1 434-1 438.

[11]ANDERSON J V, MORRIS C F. Purification and analysis of wheat grain polyphenol oxidase (PPO) protein[J].CerealChemistry, 2003, 80(2): 135-143.

[12]NISHIMURA M, FUKUDA C, MURATA M,etal. Cloning and some properties of Japanese pear (Pyruspyrifolia) polyphenol oxidase, and changes in browning potential during fruit maturation[J]. JournaloftheScienceofFoodandAgriculture, 2003, 83(11): 1 156-1 162.

[13]李桂琴, 李會(huì)宣, 許冬倩,等. 鴨梨多酚氧化酶基因CDS區(qū)的克隆及表達(dá)[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2008, 25(4):577-580.

LI G, LI H X, XU D Q,etal. Cloning and expression of polyphenol oxidase gene of CDS from Yali Pear [J].Journaloffruitscience, 2008, 25(4): 577-580.

[14]高宇瓊, 林玉玲, 賴鐘雄. 金花茶多酚氧化酶基因的克隆及其體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2014, 43(6):602-608.

GAO Y Q, LIN Y L, LAI ZH X. Cloning and expression ofPPOgene during somatic embryogenesis inCamellianitidissimaChi.[J].JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(Natural Science Edition), 2014, 43(6): 602-608.

[15]榮霞, 賴鐘雄, 林玉玲,等. 橄欖多酚氧化酶基因(PPO)克隆及其試管苗離體保存過(guò)程中的表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2014, 35(4):738-745.

RONG X, LAI Z X, LIN Y L,etal. Cloning and expression of polyphenol oxidase(PPO)gene during different process of preservation ininvitroChinese Olive(Canariumalbum)[J].ChineseJournalofTropicalCrops, 2014, 35(4): 738-745.

[16]WANG J, LIU B, XIAO Q,etal. Cloning and expression analysis of litchi (LitchiChinensisSonn.) polyphenol oxidase gene and relationship with postharvest pericarp browning[J].PloSone, 2014, 9(4): e93982.

[17]LAI Z, CHEN C, ZENG L,etal. Somatic embryogenesis in longan [DimocarpuslonganLour.][M]//. In: Somatic Embryogenesis in Woody Plants Springer, 2000: 415-431.

[18]LIN Y, LAI Z, TIAN Q,etal. Endogenous target mimics down-regulate miR160 mediation of ARF10, -16, and -17 cleavage during somatic embryogenesis inDimocarpuslonganLour[J].FrontiersinPlantScience, 2015, 6(e219).

[19]陳桂信, 呂柳新, 賴鐘雄,等. 柰基因組DNA的提取與純化[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 26(3):329-333.

CHEN G X, LV L X, LAI Z X,etal. Extraction and purification of genomic DNA in Nai(PrunussalicinaLindl. var.cordata)[J].ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis, 2004, 26(3): 329-333.

[20]LIN Y, LAI Z. Reference gene selection for qPCR analysis during somatic embryogenesis in longan tree[J].PlantScience, 2010, 178(4): 359-365.

[21]DAI X, ZHAO P X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server[J].NucleicAcidsResearch, 2011, 39(suppl 2): W155-W159.

[22]SOMMER A, NE’EMAN E, STEFFENS J C,etal. Import, targeting, and processing of a plant polyphenol oxidase[J].PlantPhysiology, 1994, 105(4): 1 301-1 311.

[23]LIAO Z, CHEN R, CHEN M,etal. Molecular cloning and characterization of the polyphenol oxidase gene from sweetpotato[J].MolecularBiology, 2006, 40(6): 907-913.

[24]馬長(zhǎng)青, 柏素花, 戴洪義. ‘嘎拉’蘋果多酚氧化酶基因MdPPO的克隆與表達(dá)分析[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2013,(8):803-810.

MA C Q, BAI S H, DAI H Y. Cloning and expression analysis of polyphenol oxidase gene (PPO) identified from ‘Gala’ apple[J].PlantPhysiologyJournal, 2013, (8): 803-810.

[25]LAI Z, LIN Y. Analysis of the global transcriptome of longan (DimocarpuslonganLour.) embryogenic callus using Illumina paired-end sequencing[J].Bmc.Genomics, 2013, 14(2): 178-189.

[26]臧紗紗, 趙尊練, 江山,等. 線辣椒花芽分化過(guò)程的形態(tài)觀察及部分代謝產(chǎn)物和酶活性的變化[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2014,(4):171-178.

ZANG S S, ZHAO Z L, JIANG S,etal. Morphology and changes in metabolites during floral bud differentiation of chili pepper[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(Natural Science Edition), 2014,(4):171-178.

[27]RIVAS-SAN VICENTE M, PLASENCIA J. Salicylic acid beyond defence: its role in plant growth and development[J].JournalofExperimentalBotany, 2011, 62(10): 3 321-3 338.

[28]DOORNBOS R F, GERAATS B P, KURAMAE E E,etal. Effects of jasmonic acid, ethylene, and salicylic acid signaling on the rhizosphere bacterial community ofArabidopsisthaliana[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions, 2011, 24(4): 395-407.

[29]CUTLER S R, RODRIGUEZ P L, FINKELSTEIN R R,etal. Abscisic acid: emergence of a core signaling network[J].AnnualReviewofPlantBiology, 2010, 61(1): 651-679.

[30]MUR L A J, PAUL K,etal. The outcomes of concentration-specific interactions between salicylate and jasmonate signaling include synergy, antagonism, and oxidative stress leading to cell death[J].PlantPhysiology, 2006, 140(1): 249-262.

[31]SHANFA L, YING-HSUAN S, CHIANG V L. Stress-responsive microRNAs inPopulus[J].PlantJournalforCell&MolecularBiology, 2008, 55(1): 131-151.

(編輯:宋亞珍)

文章編號(hào):1000-4025(2016)06-1098-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1098

收稿日期:2016-03-05;修改稿收到日期:2016-04-26

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31272149,31572088);福建省重大科技專項(xiàng)(2015NZ0002-1)

作者簡(jiǎn)介:田奇琳(1990-)，女，博士，主要從事果樹(shù)生物技術(shù)研究。 *通信作者:賴鐘雄，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事園藝植物生物技術(shù)與遺傳資源研究。E-mail：Laizx01@163.com

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Cloning and Expression Analyses ofDlPPO1 fromDimocarpuslonganLour.

TIAN Qilin, LIN Yuling, ZHENG Qingyou, SU Rongfeng, LAI Zhongxiong*

(Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

Abstract:Based on homology cloning techniques, we isolated the polyphenol oxidase gene (3 transcripts：DlPPO1-a，DlPPO1-b, and DlPPO1-c; Genbank：KM387405, KM516087, and KM516088) from leaves of longan (‘Sijimi’ cultivar) by RT-PCR and RACE．The full-length cDNA sequence of DlPPO1-a，DlPPO1-b, and DlPPO1-c were 1 969 bp, 1 960 bp and 1 920 bp, respectively, containing a 1 800 bp open reading frame (ORF) which encoded 599 amino acids; DlPPO1 shared high homology with PPO gene of Litchi chinensis, Canarium album, and Populus euphratica, etc. Bioinformatic analysis revealed that the deduced DlPPO1 protein with conserved domains shared the typical characteristics of the PPO family. QPCR analysis indicated that during somatic embryogenesis (SE) in longan, the expression level of DlPPO1 rose from the stage of heart embryo and then reached the highest at the stage of the cotyledon embryo, which suggested that DlPPO1 might play important roles during the middle and late stages of longan SE. It was detected that DlPPO1 abundantly accumulated in longan leaves, followed by flower buds; there was lower expression in other longan tissues. After exposure to phytohormones and abiotic stress, the expression of DlPPO1 was induced by salicylic acid (SA), methyl jasmonte (MeJA), NaCl, mannitol, and PEG treatments. Consequently, it suggested that DlPPO1 might participate in abiotic stress responsiveness.

Key words:longan; somatic embryogenesis; polyphenol oxidase; abiotic stress, real-time quantitative PCR