李　鸝，龍　華，張愛麗，黃衡宇*

(1 吉首大學(xué) 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首 416000；2 云南中醫(yī)學(xué)院 中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心，昆明 650500)

?

青葉膽開花動(dòng)態(tài)及有性生殖特征的解剖學(xué)研究

李鸝1，龍華1，張愛麗2，黃衡宇2*

(1 吉首大學(xué) 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首 416000；2 云南中醫(yī)學(xué)院 中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心，昆明 650500)

摘要:對(duì)中國云南區(qū)域性特色藥用植物青葉膽(Swertia mileensis)單花開放、雌雄配子體形成、胚胎發(fā)育過程進(jìn)行了觀察研究。結(jié)果顯示：(1)青葉膽繁殖生長始于每年8月底9月初，蕾期較長，一般為35 d左右；花期較短，2～3 d即完成開花；果實(shí)期最長，為40～45 d。(2)青葉膽具有一系列機(jī)制來保證其異花授粉，如：花藥為丁字著藥；雌雄異熟，雄蕊比雌蕊早熟23 h左右，在性成熟時(shí)間上二者僅有1～2 h的重疊期；此外，發(fā)現(xiàn)一種新的避免自花授粉機(jī)制，即雄蕊與雌蕊在空間上位置的變化，花藥正面由最先與雌蕊緊貼，倒轉(zhuǎn)180°后，變成背面面對(duì)雌蕊，同時(shí)花絲發(fā)生30°的偏移，導(dǎo)致花藥位置最后發(fā)生了210°的變化。(3)解剖學(xué)觀察顯示：青葉膽花藥4室，花藥壁發(fā)育為基本型，分化完全的花藥壁由5 層細(xì)胞組成；絨氈層單層，2型起源，為腺質(zhì)絨氈層，藥室內(nèi)的“類胎座”或“橫格”是早期該層細(xì)胞有絲分裂凸入藥室中央并原位退化形成的；中層2層；藥室內(nèi)壁退化；表皮宿存，纖維狀加厚。小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂為同時(shí)型，四分體排列方式主要為四面體形；成熟花粉為2-細(xì)胞或3-細(xì)胞類型。子房上位，2心皮，1室；側(cè)膜胎座，薄珠心，單珠被；倒生胚珠；大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成4個(gè)大孢子直線形排列，合點(diǎn)端的大孢子具功能，雌配子體發(fā)育為蓼型。3個(gè)反足細(xì)胞宿存，每個(gè)細(xì)胞均多核和異常膨大，反足吸器明顯，并在胚乳之外形成染色較深的類似“外胚乳”的結(jié)構(gòu)。珠孔受精，屬有絲分裂前類型。胚乳發(fā)育為核型；胚胎發(fā)育為茄型。果實(shí)成熟時(shí)，種子發(fā)育至早心形胚階段，具發(fā)達(dá)的胚柄。發(fā)達(dá)的反足細(xì)胞和胚柄結(jié)構(gòu)對(duì)青葉膽種子的后熟具有重要的生殖適應(yīng)與進(jìn)化意義。

關(guān)鍵詞:青葉膽；開花；胚胎學(xué)；獐牙菜屬；生態(tài)適應(yīng)

青葉膽(SwertiamileensisT. N. Ho & W. L. Shi)為獐牙菜屬多枝組多枝系一年生草本[1]，主要分布于云南紅河州的彌勒、開遠(yuǎn)等地，生于海拔1 300～1 650 m的荒坡稀疏小灌木叢或黃茅草叢間，生長在沙地的陽性山坡或向陽石灰?guī)r坡地上。青葉膽在云南紅河哈尼族、彝族地區(qū)用于治療肝炎等疾病具有悠久的歷史[2-3]，是中國藥典歷版(1977～2010)收載品種。青葉膽自20世紀(jì)70年代從云南省開遠(yuǎn)、彌勒等地民間發(fā)掘出來后，即作為新的藥物資源被1974年版的《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》以及1977～2010版的《中華人民共和國藥典》所收載。

近年來，國內(nèi)學(xué)者對(duì)青葉膽的化學(xué)成分以及藥理活性進(jìn)行了一些研究，研究結(jié)果[4-5]表明青葉膽具有保肝、抗菌、降血糖、抗膽堿及解痙等多種藥理活性。由青葉膽水提取物開發(fā)研制的青葉膽片，廣泛應(yīng)用于臨床治療急性病毒性肝炎，療效顯著，能夠明顯降低患者體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)水平[6]。隨著對(duì)青葉膽研究的愈加深入，市場對(duì)其的需求量也不斷擴(kuò)大，而毀滅性的采挖行為致使野生種群已不多見，同時(shí)由于各種人類活動(dòng)因素的影響，使其生境不斷遭到破壞，分布范圍日益縮減，野生資源量銳減，遺傳多樣性大量喪失，趨于漸危狀態(tài)[7]。因此，對(duì)青葉膽開展保護(hù)性研究工作已勢在必行。導(dǎo)致植物漸瀕、瀕危的原因很多，在眾多的致瀕因素中，植物的繁殖過程顯得特別重要，已成為當(dāng)今植物保護(hù)生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問題[8-9]。另一方面，由于植物胚胎學(xué)性狀通常受外部環(huán)境因素影響較小，具有相對(duì)較大的遺傳穩(wěn)定性，一直是系統(tǒng)學(xué)研究的重要依據(jù)，特別在屬以上的系統(tǒng)發(fā)育研究中更具重要意義[10-11]。龍膽科的胚胎學(xué)性狀常被用于討論該科下的系統(tǒng)位置及科下系統(tǒng)發(fā)育[12]，獐牙菜屬植物的胚胎學(xué)研究已有一些報(bào)道[12-21]，但尚未見青葉膽有關(guān)有性生殖方面的報(bào)道。本研究對(duì)青葉膽單花開放過程、大小孢子發(fā)生、雌雄配子體形成以及胚胎發(fā)育進(jìn)行研究，旨在為青葉膽的生殖生物學(xué)和保護(hù)生物學(xué)提供新資料，并為探討龍膽科內(nèi)各屬間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供有性生殖方面的證據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

觀察樣地設(shè)于云南省彌勒縣小蒼窩(24°15′32″ N，103°29′60″ E及附近，Alt: 1 620 m)，標(biāo)本經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院黃衡宇教授鑒定為青葉膽(SwertiamileensisT. N. Ho & W. L. Shi)。

1.2方法

2013年8月25日～12月20日，間隔15 d至觀察樣地進(jìn)行定株觀察記錄。其中，10月15～20日、11月5～10日2次進(jìn)行單花開放記錄。

按單花標(biāo)記時(shí)期，在同一種群內(nèi)分別取相應(yīng)時(shí)期的花芽和花朵固定于改良的FAA固定液中(50%乙醇∶冰乙酸∶甲醛=89∶6∶5)。固定48 h后的材料經(jīng)50%乙醇沖洗后，愛氏蘇木精整染7 d，經(jīng)10個(gè)不同濃度乙醇梯度脫水，5個(gè)不同濃度二甲苯透明和滲透，切片石蠟包埋，Leitz切片機(jī)切片，切片厚度5～8 μm，中性樹膠封片。ZEISS-AxioskopⅡ型顯微鏡下觀察并攝影。

2結(jié)果與分析

2.1單花開放過程

青葉膽花基數(shù)為4(圖版Ⅰ，A)。每年8月底9月初開始繁殖生長，9月10日開始出現(xiàn)幼小花序(圖版Ⅰ，B)，花原基基本形成，此時(shí)苞片與其它部分相比生長較快。15 d后，即9月25日左右，幼小花蕾出現(xiàn)，其頂部略顯紫色，其他大部分呈現(xiàn)淺綠色(圖版Ⅰ，C)；花蕾出現(xiàn)第5 d，即9月30日，花蕾逐漸長大至花萼1/3處，上部由綠轉(zhuǎn)紫，且向下擴(kuò)展(圖版Ⅰ，D)；10 d后，即10月10日，花蕾長至幾與花萼平齊，紫色區(qū)域加深，螺紋明顯(圖版Ⅰ，E)；5 d后，即10月15日，花蕾基部膨大，萼片展開，花瓣即將解螺旋開放(圖版Ⅰ，F(xiàn))，此時(shí)雄蕊花絲已生長至與雌蕊柱頭平齊，花藥正面相對(duì)花柱并與之平行緊鄰(圖版Ⅰ，G)。至此，青葉膽繁殖期內(nèi)的花蕾期結(jié)束，歷時(shí)約35 d左右。

青葉膽開花時(shí)期較短，約2～3 d，單花開放時(shí)間不固定，大多數(shù)集中在上午6：30～8：30間。以1朵花為例，10月16日7：05開花時(shí)，花瓣從外向內(nèi)解旋，先是1個(gè)花瓣打開(圖版Ⅰ，H)，5 min后，即7:10，其余3個(gè)花瓣同時(shí)展開(圖版Ⅰ，I)；8：10在完成解旋后的60 min內(nèi)，花藥完成了與柱頭由最初正面相對(duì)翻轉(zhuǎn)至垂直并略高于柱頭(圖版Ⅰ，J)；30 min后，即8：40，花藥完成了與柱頭背面相對(duì)的另一個(gè)90°翻轉(zhuǎn)，同時(shí)花絲逐漸偏移柱頭約30°，此時(shí)花藥開始散粉，但柱頭處于不可授狀態(tài)(圖版Ⅰ，K)，這一時(shí)期持續(xù)時(shí)間較長，可達(dá)23 h；第2天，即10月17日7：40，花藥處于散粉高峰期，花藥、藥絲顏色逐漸加深，而柱頭仍處于不可授狀態(tài)(圖版Ⅰ，L)；4 h后，即11：40，花藥進(jìn)入散粉末期，顏色變黑并開始萎縮，宿存于淡藍(lán)色花絲上，偶見脫落，此時(shí)柱頭進(jìn)入可授期(圖版Ⅰ，M)；2 h后，即13：40，柱頭進(jìn)入最佳可授期，同時(shí)子房持續(xù)膨大呈寶瓶狀(圖版Ⅰ，N)，這一時(shí)期持續(xù)約5 h。授粉完成后，柱頭顏色逐漸加深變黑，子房進(jìn)一步膨大(圖版Ⅰ，O)。2～3 d后，花萼花瓣逐漸以雌蕊為中心，緊緊向內(nèi)包攏，花瓣紙質(zhì)化皺縮，進(jìn)入果期。青葉膽果實(shí)期較長，約40～45 d，以后蒴果從上部裂開，散出種子。青葉膽單花繁殖期從花序出現(xiàn)至蒴果成熟約需80～90 d，期間完成了生活史中最重要的兩個(gè)過程——減數(shù)分裂和受精作用。整個(gè)種群花期約120 d。

此外，對(duì)青葉膽進(jìn)行繁育系統(tǒng)檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，種群在盛花期中大約有5%花朵雄蕊在發(fā)育早期敗育，在花瓣解螺旋打開時(shí)雄蕊即已枯萎死亡。這樣的小花在以后的發(fā)育中，雌蕊生長極好，蒴果內(nèi)的種子數(shù)明顯高于平均種子數(shù)，表明雄蕊敗育不僅是異花授粉的保障之一，同時(shí)能將更多的能量資源分配給雌蕊。

2.2小孢子發(fā)生和雄配子體形成

青葉膽每枚雄蕊具4個(gè)小孢子囊(圖版Ⅱ，A)，每個(gè)小孢子囊的4個(gè)角隅處分化出的孢原細(xì)胞平周分裂向外產(chǎn)生初生壁細(xì)胞，向內(nèi)產(chǎn)生初生造孢細(xì)胞(圖版Ⅱ，B)，初生壁細(xì)胞繼續(xù)平周分裂產(chǎn)生外層和內(nèi)層；外層細(xì)胞分裂形成藥室內(nèi)壁和中層，內(nèi)層細(xì)胞分裂形成中層和絨氈層(圖版Ⅱ，C)，至小孢子母細(xì)胞時(shí)期，分化完全的花藥壁由5層細(xì)胞組成，由外向內(nèi)依次為：表皮、藥室內(nèi)壁、2層中層和絨氈層(圖版Ⅱ，D)。中層由外層和內(nèi)層分裂產(chǎn)生的細(xì)胞共同組成，按Davis[22]的劃分，青葉膽花藥壁發(fā)育屬于基本型。而絨氈層主要來源于初生壁內(nèi)層，部分來自藥隔細(xì)胞，為二型起源。

外觀大多為多邊形的次生造孢細(xì)胞經(jīng)過生長發(fā)育，體積進(jìn)一步增大，變?yōu)閳A形的小孢子母細(xì)胞。青葉膽小孢子母細(xì)胞時(shí)期較為短暫，一經(jīng)形成即進(jìn)行減數(shù)分裂，減數(shù)分裂大約經(jīng)歷10 d，花朵外形如圖版Ⅰ，D。小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂期時(shí)，中層細(xì)胞開始退化，而起源于藥隔部分的絨氈層細(xì)胞在發(fā)育過程中進(jìn)行平周分裂凸入藥室腔內(nèi)，形成“類胎座”或“橫格”(圖版Ⅱ，E)。小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂(圖版Ⅱ，F(xiàn)～I(xiàn))后形成小孢子四分體(圖版Ⅱ，J)，其胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，四分體排列方式主要為四面體形，花朵外形如圖版Ⅰ，F(xiàn)；此時(shí)，絨氈層細(xì)胞強(qiáng)烈解體，原位退化，藥室內(nèi)具有的退化絨氈層核是早期該層細(xì)胞有絲分裂凸入藥室中央并原位退化形成的(圖版Ⅱ，J)，而非周緣的絨氈層細(xì)胞退化后流動(dòng)進(jìn)入所致。剛從四分體釋放出來的小孢子核位于中央，細(xì)胞質(zhì)中只有一些小液泡，壁較薄(圖版Ⅱ，K)；隨著生長發(fā)育，小孢子原生質(zhì)開始出現(xiàn)許多小液泡(圖版Ⅱ，L)，后匯集成一大液泡，位于細(xì)胞中央，原生質(zhì)遂分布于細(xì)胞壁的周邊，其核隨著細(xì)胞的液泡化由中央隨機(jī)地移到靠壁的一側(cè)(圖版Ⅱ，M)，這一過程大約需1.5 h，花朵外形如圖版Ⅰ，H～J。在花藥以與花絲相連“關(guān)節(jié)”處進(jìn)行翻轉(zhuǎn)時(shí)(圖版Ⅰ，J、K)，靠邊小孢子核進(jìn)行有絲分裂，產(chǎn)生大小懸殊的2個(gè)核，隨后進(jìn)行胞質(zhì)分裂，形成大小懸殊的2個(gè)細(xì)胞(圖版Ⅱ，N)。大的為營養(yǎng)細(xì)胞，包含著原先小孢子的大液泡和大部分原生質(zhì)，其核含有1個(gè)顯著的大核仁；貼壁的是生殖細(xì)胞，只含有少量的原生質(zhì)，這一時(shí)期可以稱為2-細(xì)胞花粉粒早期。以后，生殖細(xì)胞側(cè)邊脫離花粉壁向心突出，逐漸從花粉壁上脫落，細(xì)胞壁漸漸溶解，其核也不斷增大，最終游離在營養(yǎng)細(xì)胞的原生質(zhì)中，生殖細(xì)胞在散粉前分裂一次形成成熟的3-細(xì)胞花粉粒(圖版Ⅱ，O)。由于小孢子發(fā)育的不同步，少量花粉粒在花藥完成翻轉(zhuǎn)后即從藥隔斷裂處逸出，23 h后絕大多數(shù)小孢子始發(fā)育成熟，達(dá)到散粉高峰。此時(shí)，花藥壁僅宿存帶狀加厚的表皮。

圖版 Ⅰ　青葉膽單花開放過程A．花基數(shù)4；B．花序出現(xiàn)；C～F．花蕾期，約為20 d；G．尚未開放花朵雄蕊位置；H．初開放花朵；I．花藥開始翻轉(zhuǎn)；J．隨后60 min內(nèi)，花藥與柱頭由最初正面相對(duì)翻轉(zhuǎn)至垂直并略高于柱頭；K．30 min后，花藥完成了與柱頭背面相對(duì)的另一個(gè)90°翻轉(zhuǎn)，并開始散粉，此時(shí)柱頭不可授；L．23 h后，花藥處于散粉高峰，而柱頭仍不可授；M．4 h后，花藥進(jìn)入散粉末期，柱頭進(jìn)入可授期；N．2 h后，柱頭進(jìn)入最佳可授期；O．完成授粉后的子房形態(tài)。PlateⅠ　The duration of the single flowerA. Tetramerous flower; B. Inflorescence emergence; C-F. The bud time, which lasts for about 20 days; G. The position of stamens in unopened flower； H. The flower bud opens; I. The anthers turn outwards; J. The anther position is vertical to pistil and higher than stigma for 60 minutes; K. After 30 minutes, the anther keep on turning outwards 90° to face against the pistil, the pollen begin falling while the stigma is still unreceptive; L. The shedding of pollen peaks at 23 hours after it starts while the stigma is still unreceptive; M. 4 hours later the anthers are in the late stage of pollen shedding while the stigma is receptive; N. The stigma is optimal for pollination 2 hours later; O. Ovary shape after pollination

圖版 Ⅱ　小孢子發(fā)生和雄配子體形成(標(biāo)尺：A=100 μm；B～E、J=20 μm；F～I(xiàn)、K～O=10 μm)A. 4枚花藥；B. 初生壁細(xì)胞(PP)和初生造孢細(xì)胞(PS)；C. 次生造孢細(xì)胞時(shí)期的花藥壁：表皮(EP)、外層(OL)和內(nèi)層(IL)及分裂相(箭頭)；D. 小孢子母細(xì)胞(MIC)時(shí)期分化完全的花藥壁：表皮(EP)、藥室內(nèi)壁(EN)、中層(M)、絨氈層(T)；E. 絨氈層細(xì)胞凸入藥室內(nèi)形成“類胎座”(PL)；F. 減Ⅰ中期；G. 減Ⅰ后期；H.減Ⅱ中期；I.減Ⅱ末期；J. 四分體時(shí)期由絨氈層細(xì)胞形成的“類胎座”(PL)；K. 剛從四分體釋放出來的小孢子；L. 小孢子中出現(xiàn)小液泡；M. 小孢子中出現(xiàn)大液泡； N. 2-細(xì)胞花粉粒早期，可見明顯的細(xì)胞壁；O. 成熟的3-細(xì)胞花粉粒Plate Ⅱ　Microsporegenesis and development of the male gametophyte (Scale Bar: A =100 μm; B-E, J=20 μm; F-I, K-O=10 μm)A. The transection of anther, showing four anthers; B. Primary parietal cells (PP) and primary sporogenous cells (PS); C. Anther wall in the time of secondary sporoginous cell: epidermis (EP), out layer (OL) and inner layer (IL) with its division phase; D. Anther wall in the time of microspore mother cells: epidermis (EP), endothelium (EN), middle layer (M), tapetum (T); E. “Placentoid (PL)” from the tapetum; F. Meiosis metaphaseⅠ; G. Meiosis anaphaseⅠ; H. Meiosis metaphaseⅡ; I. Meiosis telophase Ⅱ; J. “Placentoid (PL)” from the tapetum in the time of tetrads; K. Microspore had just formed from microspore tetrads; L. Some small vacuoles appear in the microspore; M. Vacuolate period of uninucleate microspore; N. Early 2-celled pollens, showing obvious cell wall; O. Mature 3-celled pollens

2.3大孢子發(fā)生和雌配子體形成

青葉膽為圓錐狀聚傘花序，多花，子房上位，2心皮，1室。雌蕊膨大成囊狀，心皮沒有愈合的部分分化為柱頭，不閉合。子房橫切面具多列胚珠，側(cè)膜胎座(圖版Ⅲ，A)。在珠心頂端表皮下一層細(xì)胞中分化出單個(gè)孢原細(xì)胞(圖版Ⅲ，B)。 孢原細(xì)胞不分裂，體積增大并伸長直接發(fā)育為大孢子母細(xì)胞，其質(zhì)濃厚，具大而顯著的細(xì)胞核(圖版Ⅲ，C)?？梢?，青葉膽大孢子母細(xì)胞與珠心表皮細(xì)胞間無周緣細(xì)胞層，故屬薄珠心胚珠。珠被始發(fā)生于孢原細(xì)胞晚期，由珠心基部細(xì)胞衍生而成，生長速度較快，由于兩側(cè)生長不均勻，至大孢子母細(xì)胞時(shí)期，胚珠處于倒生的位置(圖版Ⅲ，C)。

大孢子母細(xì)胞持續(xù)時(shí)間較長，約15～20 d，花朵外形如圖版Ⅰ，E。大孢子母細(xì)胞經(jīng)減Ⅰ分裂(圖版Ⅲ，D)形成大孢子二分體(圖版Ⅲ，E)；大孢子二分體經(jīng)減Ⅱ分裂形成直線形大孢子四分體(圖版Ⅲ，F(xiàn))。四分體中，珠孔端3個(gè)退合，合點(diǎn)端大孢子體積增大，發(fā)育為功能大孢子，此時(shí)可見退化大孢子痕跡(圖版Ⅲ，G)。這一發(fā)育時(shí)間也較長，持續(xù)至花藥完成翻轉(zhuǎn)并開始散粉，花朵外形如圖版Ⅰ，J、K。

功能大孢子體積繼續(xù)增大，在珠孔端出現(xiàn)小液泡，發(fā)育為單核雌配子體(圖版Ⅲ，H)；單核雌配子體經(jīng)2次有絲分裂形成二核雌配子體(圖版Ⅲ，I)和四核雌配子體(圖版Ⅲ，J)，四核雌配子體再經(jīng)一次有絲分裂形成八核雌配子體，隨即細(xì)胞化產(chǎn)生七細(xì)胞八核雌配子體(圖版Ⅲ，K～L)，此過程約持續(xù)24 h。此時(shí)，花藥散粉進(jìn)入末期，柱頭進(jìn)入可授期。成熟雌配子體中，珠孔端3個(gè)細(xì)胞形成卵器，卵細(xì)胞和2個(gè)助細(xì)胞呈“品”字形排列，卵細(xì)胞略小于助細(xì)胞，核位于合點(diǎn)端，珠孔端為一大液泡；2個(gè)助細(xì)胞大小幾乎相等，極性與卵細(xì)胞相反。合點(diǎn)端的3個(gè)反足細(xì)胞非常發(fā)達(dá)，在形成后不久，體積便迅速增大，幾占整個(gè)胚囊的1/3(圖版Ⅲ，M)。在以后的發(fā)育中，反足細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，核多次分裂形成內(nèi)源多倍體，其形成的反足吸器明顯，形成一個(gè)十分類似“外胚乳”的結(jié)構(gòu)。反足細(xì)胞宿存時(shí)間較長，2-細(xì)胞原胚時(shí)還很發(fā)達(dá)，到6-細(xì)胞原胚時(shí)期才開始退化。

圖版 Ⅲ　大孢子發(fā)生和雌配子體形成(標(biāo)尺：A=100 μm； B=20 μm；C=30 μm；D～M=50 μm)A. 側(cè)膜胎座；B. 大孢子孢原(箭頭)；C. 大孢子母細(xì)胞(箭頭)；D. 大孢子母細(xì)胞減Ⅰ中期； E. 大孢子二分體；F. 直線形大孢子四分體；G. 功能大孢子(F)和退化的3個(gè)大孢子(箭頭)；H. 單核雌配子體；I. 二核雌配子體；J. 四核雌配子體；K～M. 七細(xì)胞雌配子體，示2個(gè)助細(xì)胞(SY)、卵細(xì)胞(E)、中央細(xì)胞(C)和反足細(xì)胞(ANT)Plate Ⅲ　Megasporogenesis and development of the female gametophyte (Scale Bar: A=100 μm ; B=20 μm; C=30 μm; D-M=50 μm)A. Parietal placenta; B. A female archesporium is hypodermal (arrow); C. Megasporocyte (arrow); D. Meiosis metaphaseⅠ; E. Megaspore dyad; F. Linear tetrad of megaspores; G. Functional megaspore (F) and the three degenerated megaspores (arrow); H. Mononucleate megagametophyte; I. Two-nucleated megagametophyte; J. Four--nucleated megagametophyte; K-M. Seven-celled megagametophyte, showing two synergids (SY), egg (E), central cell (C) and three antipodal cells (ANT)

2.4受精、胚和胚乳的發(fā)育

青葉膽成熟花粉粒在散粉前開始萌發(fā)出花粉管，經(jīng)媒介傳送至柱頭后，花粉管即在花柱中沿著通道細(xì)胞表面的粘液前進(jìn)。到達(dá)子房后，經(jīng)珠孔進(jìn)入胚珠，屬珠孔受精類型?；ǚ酃苓M(jìn)入雌配子體囊腔時(shí)釋放出2個(gè)精子分別與卵細(xì)胞和中央細(xì)胞融合，產(chǎn)生合子及初生胚乳核，受精屬有絲分裂前類型。

初生胚乳核的分裂早于合子的分裂，在合子第一次絲分裂前，胚乳核已在囊腔內(nèi)達(dá)到了一定數(shù)目(圖版Ⅳ，A)，胚乳發(fā)育為核型。合子第一橫分裂(圖版Ⅳ，B)形成1個(gè)頂細(xì)胞CA和1個(gè)基細(xì)胞CB(圖版Ⅳ，C)；頂細(xì)胞先分裂產(chǎn)生L、L′，隨后基細(xì)胞進(jìn)行分裂，最后產(chǎn)生一直線形4-細(xì)胞原胚L、L′、M和Ci(圖版Ⅳ，D)；細(xì)胞L和L′在基細(xì)胞CB分裂結(jié)束后不久分別再進(jìn)行一次橫分裂，產(chǎn)生L1、L2和L1′、L2′，與M、Ci構(gòu)成直線形的6-細(xì)胞原胚(圖版Ⅳ，E)，這一時(shí)期，反足細(xì)胞開始呈現(xiàn)退化的跡象；以后L1、L2、L1′、L2′再分裂數(shù)次和M、Ci一起構(gòu)成球形原胚，此時(shí)胚乳核開始細(xì)胞化(圖版Ⅳ，F(xiàn))。青葉膽胚的發(fā)育過程中，由基細(xì)胞CB衍生而來的細(xì)胞在胚體建成中不起重要作用，因而胚的發(fā)育屬于茄型。

圖版 Ⅳ　受精、胚和胚乳的發(fā)育(標(biāo)尺：A、F～H=50 μm；B、C=30 μm；D、E=20 μm)A. 合子(Z)和胚乳核；B.合子橫分裂相(箭頭)；C. 2-細(xì)胞原胚，頂細(xì)胞(CA)和基細(xì)胞(CB)；D. 4-細(xì)胞(L、L′、M、Ci)原胚；E. 6-細(xì)胞(L1、L2、L1′、L2′、M、Ci)原胚；F. 球形原胚早期，示細(xì)胞化胚乳和胚柄細(xì)胞；G. 球形胚；H. 球形胚時(shí)期發(fā)達(dá)的胚柄吸器Plate Ⅳ　Fertilization and development of embryo and endosperm (Scale Bar: A, F-H=50 μm; B, C=30 μm; D, E=20 μm)A. The zygote (Z) and endosperm nucleus; B. The dividing zygote (arrow); C. At the time of 2-celled proembryo, showing the apical cell (CA) and the base cell (CB); D. Liner 4-celled pro-embryo (L, L′, M, Ci); E. Liner 6-celled pro-embryo (L1, L2, L1′, L2′, M, Ci); F. Early globular embryo; G. Globular embryo; H. Developed suspensor haustorium at the time of globular embryo

在胚體形成后，由基細(xì)胞CB衍生的細(xì)胞加速分裂形成胚柄結(jié)構(gòu)，至球形胚時(shí)期可見發(fā)達(dá)的胚柄，而胚體附近細(xì)胞化的胚乳強(qiáng)烈解體，為胚的發(fā)育提供養(yǎng)料(圖版Ⅳ，G)。種子離開母體時(shí)，胚的分化不完全，大部分處于早心形胚階段，少數(shù)仍處于球形胚時(shí)期，此時(shí)胚柄高度發(fā)達(dá)，可以看到明顯的吸器結(jié)構(gòu)(圖版Ⅳ，H)。從受精到蒴果成熟，約需40～45 d。

3討論

3.1青葉膽對(duì)異花授粉的適應(yīng)

通過對(duì)單花開放過程的觀察，青葉膽具有一系列機(jī)制來保證其異花授粉。從花部形態(tài)上看，花藥為丁字形著藥，散粉時(shí)背向雌蕊裂開。從雌雄蕊空間位置上的變化來看，花藥從發(fā)育早期處于與雌蕊相對(duì)位置到散粉時(shí)的背對(duì)位置，花藥要經(jīng)歷一個(gè)180°倒轉(zhuǎn)的過程，同時(shí)花絲也要偏離雌蕊近30°的向外偏轉(zhuǎn)，這樣花藥的位置幾乎發(fā)生了210°的變化，散粉時(shí)相對(duì)遠(yuǎn)離雌蕊柱頭。在這一過程中，花絲頂部與花藥相連處的“關(guān)節(jié)”部位是一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)?；ㄋ幷峭ㄟ^這一結(jié)構(gòu)才能夠完成其180°的倒轉(zhuǎn)，最終花藥處于與雌蕊相背的位置。與其近緣種川東獐牙菜S.davidii.不同的是，花藥發(fā)生180°倒轉(zhuǎn)是S.davidii.散粉的一個(gè)重要前提，否則便會(huì)在散粉前枯萎死亡。對(duì)青葉膽來說，如果花藥由于某些外力原因未能發(fā)生180°倒轉(zhuǎn)，花藥的發(fā)育就會(huì)滯后，略顯畸形，其花粉活力則低于正?；ǚ鄱⒉粚?dǎo)致其死亡。

雌、雄蕊發(fā)育的相關(guān)性來看，雄蕊的發(fā)育早于雌蕊，當(dāng)花藥成熟散粉時(shí)，雌配子體僅發(fā)育至功能大孢子時(shí)期；27 h后，雌配子體發(fā)育成熟，而花藥已進(jìn)入散粉末期，兩者僅有1～2 h的重疊期。這樣，在發(fā)育時(shí)間上保證了青葉膽的異花授粉。

3.2青葉膽絨氈層類型

有學(xué)者[23]曾報(bào)道龍膽科植物的絨氈層有腺質(zhì)和變型兩種類型，并提到絨氈層發(fā)育早期具有結(jié)構(gòu)上的各種變化，如進(jìn)行各種分裂凸入藥室腔內(nèi)形成“橫格”和“類胎座”。與S.davidii.的研究結(jié)果類似[24]，本研究認(rèn)為它們是一種類型，是由于對(duì)絨氈層發(fā)育早期結(jié)構(gòu)變化所引起的退化具有不同認(rèn)識(shí)所造成的。青葉膽絨氈層2型起源，其細(xì)胞在發(fā)育早期就縱向伸長，并擠入藥室腔內(nèi)，使絨氈層看上去似乎有2層至多層，特別是起源于藥隔的絨氈層細(xì)胞有時(shí)還形成“橫格”和“類胎座”結(jié)構(gòu)；隨著花粉的發(fā)育，這些進(jìn)入藥室腔內(nèi)的絨氈層細(xì)胞原位解體，存在于小孢子周圍，以至于很容易從表象上誤認(rèn)為是邊緣絨氈層“流動(dòng)”進(jìn)入藥室腔內(nèi)的；本文未觀察到青葉膽絨氈層細(xì)胞解體時(shí)有融合現(xiàn)象，直到消失之前，絨氈層細(xì)胞始終是單個(gè)存在的，沒有形成周原質(zhì)團(tuán)。

3.3青葉膽有性生殖過程中的重要特征

一般認(rèn)為，反足細(xì)胞為胚囊的成熟與受精提供營養(yǎng)，特別是那些具次生增殖的反足細(xì)胞[25]；此外，反足細(xì)胞有可能產(chǎn)生和釋放控制鄰近胚乳發(fā)育的成長物質(zhì)[26]。與龍膽科多數(shù)一年生植物相似[14-19,21,23-24]，青葉膽反足細(xì)胞存在次生增殖，在雙受精至胚乳形成前，具有顯著的吸器結(jié)構(gòu)，并宿存至4-細(xì)胞原胚或更久。而龍膽科多年生植物反足細(xì)胞則無顯著的反足吸器，少發(fā)生次生增殖，受精后就普遍開始消失[27]。

胚柄在胚胎發(fā)育過程中是一個(gè)暫時(shí)性結(jié)構(gòu)，在胚胎發(fā)育過程中，胚柄將胚體推入胚乳組織中，并從母體組織吸收營養(yǎng)物質(zhì)向胚體運(yùn)輸，或者胚柄本身合成特殊物質(zhì)(如赤霉素)，為早期發(fā)育的胚胎提供營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[28]。與其他一些獐牙菜屬植物不同[12,15-18,20,24]，青葉膽在4-細(xì)胞原胚后，并不產(chǎn)生8-細(xì)胞原胚而產(chǎn)生6-細(xì)胞原胚，基細(xì)胞的分裂晚于頂細(xì)胞。至原胚體形成時(shí)，胚柄結(jié)構(gòu)才開始出現(xiàn)。至蒴果成熟種子散出時(shí)，胚柄高度發(fā)達(dá)并形成吸器結(jié)構(gòu)。在其他獐牙菜屬植物中，未見類似報(bào)道。

3.4青葉膽有性生殖特征的生態(tài)適應(yīng)意義

胚胎學(xué)上的特定特征是與其功能相一致的，并在一定程度上反映了該物種的生活史與生殖策略[27]。青葉膽在原生境為每年9月初花序出現(xiàn)，單花開放期2～3 d左右；果期較長，約40～45 d。種子從蒴果中散落時(shí)，大多只發(fā)育至早心形胚階段，種子必須經(jīng)過后熟才能萌發(fā)。在漫長的后熟期中(4個(gè)月左右)，種子一方面可以休眠或后熟的方式避開不良生長季節(jié)，但另一方面，種子在母體時(shí)須貯存足夠養(yǎng)料以滿足離開母體后胚的繼續(xù)發(fā)育，而后熟期的養(yǎng)料猶顯重要。從種子的切片來看，發(fā)達(dá)的胚乳組織即為胚后熟養(yǎng)料的重要保證，這樣在早期胚的發(fā)育中，胚乳就不能被過度利用?？梢酝茰y，青葉膽發(fā)達(dá)的反足細(xì)胞可能是完成這一策略的主要載體：雌配子體成熟時(shí)期吸收珠被的營養(yǎng)，轉(zhuǎn)運(yùn)并儲(chǔ)存于反足細(xì)胞內(nèi)；受精后，發(fā)達(dá)的反足細(xì)胞不僅促進(jìn)胚乳的發(fā)育和養(yǎng)分積累，而且有可能在胚發(fā)育的早期代替胚乳為合子及胚提供營養(yǎng)。此外，青葉膽發(fā)達(dá)的胚柄結(jié)構(gòu)也具有重要意義。在胚的發(fā)育早期，由于胚柄的不斷伸長，將胚體逐漸向囊胚中推進(jìn)，使之處于營養(yǎng)有利的環(huán)境中；而到了早心形胚，即種子脫離母體時(shí)，胚柄產(chǎn)生明顯的吸器結(jié)構(gòu)，從珠孔端伸入珠被組織，從珠被組織中轉(zhuǎn)移營養(yǎng)物質(zhì)至胚，進(jìn)一步提供胚后熟過程中需要的養(yǎng)份；同時(shí)，發(fā)達(dá)的胚柄也有可能為胚體提供生長調(diào)節(jié)因子以保證種子中胚的正常發(fā)育[29]。

參考文獻(xiàn):

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì). 中國植物志(62卷)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1988: 392.

[2]聶瑞麟, 何仁遠(yuǎn). 青葉膽植物中的紅白金花內(nèi)酯和青葉膽內(nèi)脂的結(jié)構(gòu)[J]. 云南植物研究, 1984, 6(3): 325-328.

NIE R L, HE R Y. The Erythrocentaurin and Swermirin fromSwertiamileensis[J].ActaBotanicaYunnanica, 1984, 6(3): 325-328.

[3]宋萬春. 龍膽科[M]// 吳征鎰. 新華本草綱要 (第2冊(cè)) [M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1991: 387-402.

[4]程淑敏, 周干南. 青葉膽膠囊治療急性腸炎120例報(bào)告[J]. 中藥材, 1990, 13(8): 37-38.

CHENG S M, ZHOU G N.Swertiamileensiscapsule in the treatment of acute enteritis (a report of 120 cases) [J].JournalofChineseMedicinalMaterials, 1990, 13(8): 37-38.

[5]楊永紅, 楊林福, 范建, 等. 青葉膽可持續(xù)利用策略研究[J]. 中國民族民間醫(yī)藥雜志, 2003, 61: 107-109.

YANG Y H, YANG L F, FAN J,etal. Strategy on persistent utilization ofSwertiamileensis[J].ChineseJournalofEthnomedicineandEthnopharmacy, 2003, 61: 107-109.

[6]杜光明, 李國源. 青葉膽治療急性病毒性肝炎422例療效觀察[J]. 云南中醫(yī)雜志, 1981, 3: 35-37.

DU G M, LI G Y.Swertiamileensisin the treatment of acute virus hepatitis (an analytic report of 422 cases) [J].YunnanJournalofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica, 1981, 3: 35-37.

[7]黃衡宇, 黃驥, 王美蓉, 等. 青葉膽組織培養(yǎng)條件優(yōu)化及不同交配方式子代植株再生能力比較研究[J]. 中草藥, 2016, 47(3): 480-487.

HUANG H Y, HUANG J, WANG M R,etal. Comparison on progeny regeneration capacity among different mating patterns and optimization of cultivation condition inSwertiamileensis[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs, 2016, 47(3): 480-487.

[8]何亞平, 劉建全. 植物繁育系統(tǒng)研究的最新進(jìn)展與評(píng)述[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2003, 27(2): 151-163.

HE Y P, LIU J Q. A review on recent advances in the studies of plant breeding system[J].ActaPhytoecologicaSinica, 2003, 27(2): 151-163.

[9]高江云, 任盤宇, 李慶軍. 姜科、閉鞘姜科植物繁育系統(tǒng)與傳粉生物學(xué)的研究進(jìn)展[J]. 植物分類學(xué)報(bào), 2005, 43(6): 574-585.

GAO J Y, REN P Y, LI Q J. Advances in the study of breeding system and pollination biology of gingers (Zingiberaceae and Costaceae) [J].ActaPhytotaxonomicaSinica, 2005, 43(6): 574-585.

[10]THORNE R F. Proposed new realignments in the angiosperms [J].NordicJournalofBotany, 1983, 3:85-117.

[11]THORNE R F. An updated phylogenetic classification of flowing plants [J].Aliso, 1992, 13(2): 365-389.

[12]XUE C Y, HO T N, LI D Z. Embryology ofSweria(Gentianaceae) relative to taxonomy [J].BotanicalJournaloftheLinneanSociety, 2007, 155: 383-400.

[13]SHAMROV I I. The ovule ofSwertiaiberica(Gentianaceae):structural and functional aspects [J].Phytomorphology, 1991, 41(3 & 4 ): 213-229.

[14]SHAMROV I I. Ovule development and significance of its features for Gentianaceae systematics [J].OperaBotanicaBelgica, 1996, 7: 113-118.

[15]劉建全, 薛春迎, 何廷農(nóng). 藏藥抱莖獐牙菜的胚胎學(xué)研究[J]. 西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 1988, 34(4): 59-66.

LIU J Q, XUE C Y, HE T N. Embryology ofSwertiafranchitiana, a famous Tibetan medicine [J].JournalofNorthwestNormalUniversity(Natural Science), 1988, 34(4): 59-66.

[16]何廷農(nóng), 薛春迎, 劉建全. 紅直獐牙菜的胚胎學(xué)[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 1999, 19(1): 76-80.

HE T N, XUE C Y, LIU J Q. Embryology ofSwertiaErythrostictaMaxim [J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 1999, 19(1): 76-80.

[17]薛春迎, 何廷農(nóng), 劉建全. 四數(shù)獐牙菜的胚胎學(xué)及其系統(tǒng)學(xué)意義[J]. 植物分類學(xué)報(bào), 1999, 37(3): 259-263.

XUE C Y, HE T N, LIU J Q. Embryology ofSwertiatetrapteraMaxim.(Gentianaceae) and its systematic implication[J].ActaPhytotaxonomicaSinica, 1999, 37(3): 259-263.

[18]薛春迎, 何廷農(nóng), 李德銖. 西南獐牙菜的胚胎學(xué)及其系統(tǒng)學(xué)意義[J]. 云南植物研究, 2002, 24(1): 75-81.

XUE C Y, HE T N, LI D Z. Embryology ofSwertiacincta(Gentianaceae) and its systematic value [J].ActaBotanicaYunnanica, 2002, 24(1): 75-81.

[19]李鸝, 黃衡宇. 川東獐牙菜小孢子發(fā)生和雄配子體形成[J]. 植物研究, 2006, 26(4): 452-460.

LI L, HUANG H Y. The genesis of microspore and the formation of male gametophyte inSwertiadavidiiFranch [J].BulletinofBotanicalResearch, 2006, 26(4): 452-460.

[20]黃衡宇, 龍華, 易婷婷, 等. 獐牙菜的胚胎發(fā)生[J]. 植物研究, 2009, 29(6): 665-673.

HUANG H Y, LONG H, YI T T,etal. Embryogenesis ofSwertiabimaculata[J].BulletinofBotanicalResearch, 2009, 29(6): 665-673.

[21]黃衡宇, 龍華, 易婷婷, 等. 獐牙菜小孢子發(fā)生和雄配子體形成[J]. 廣西植物, 2010, 30(5): 584-593.

HUANG H Y, LONG H, YI T T,etal. Microsporogenesis and the development of male gametophyte inSwertiabimaculata[J].Guihaia, 2010, 30(5): 584-593.

[22]DAVIS G L. Systematic Embryology of the Angiosperm [M]. New York: John Wiley and Sons I Incorporated, 1966: 70-71.

[23]SAMKARA R K, NAGARA J M. Studies in Gentianaceae: embryology ofSwertiaminor(Gentianaceae) [J].CanadianJournalofBotany, 1982, 60: 141-151.

[24]李鸝, 黃衡宇. 川東獐牙菜(龍膽科)的胚胎學(xué)研究[J]. 廣西植物, 2015, 35(5): 631-640.

LI L, HUANG H Y. Embryology ofSwertiadavidii(Gentianaceae) [J].Guihaia, 2015, 35(5): 631-640.

[25]CAMERON B G, PTAKSH N. Occurrence of giant antipodals in the female Gametophyte of Australian Bossiaceae, Indigofereae and Mitbelieae (Leguminosae) [J].AustralianJournalofBotany, 1990, 38(4): 395-401.

[26]WILLEMSE M T, WENT J L. The Female Gametophyte[M]// Johri B N. Embryology of angiosperms . Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 1984: 88-91.

[27]AKHALKATS M, WAGNER J. Comparative embryology of three Gentianaceae species from the Caucasus and the European Alps [J].PlantSystematicsandEvolution. 1997, 204: 29-48.

[28]SCHWARTZ B W, YEUNG E C, MEINKE D W. Disruption of morphogenesis and transformation of the suspensor in abnormal suspensor mutants ofArabidopsis[J].Development, 1994, 120: 3 235-3 245.

[29]SONG G Q, WANG X G, LI A Q,etal. Research progress in suspensor of angiosperms [J].ChineseBulletinofBotany, 2012, 47: 188-195.

(編輯:潘新社)

文章編號(hào):1000-4025(2016)06-1146-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1146

收稿日期:2016-03-24;修改稿收到日期:2016-06-08

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(31260077,31260102)；湖南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(JSU071301)

作者簡介:李鸝(1973-)，女，博士，教授，主要從事植物生態(tài)與分子生物學(xué)教學(xué)和科研工作，E-mail: lilyjsu@126.com *通信作者:黃衡宇，博士，教授，主要從事植物發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail: hhyhhy96@163.com

中圖分類號(hào):Q944.58

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Study on Floral Dynamic and Sexual Reproduction ofSwertiamileensis,a Rare and Endemic Medicinal Plant

LI Li1, LONG Hua1, ZHANG Aili2, HUANG Hengyu2*

(1 Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization of College of Hunan Province, Jishou University,Jishou, Hunan 416000, China;2 Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants, Yunnan University of Chinese Traditional Medicine, Kunming 650500, China)

Abstract:The blooming of the single flower, the development of microsporangium, male gametophyte, megasporogenesis, female gametophyte and embryogeny of Swertia mileensis, a special herb endemic to Yunnan, were studied in this article. (1) The reproductive growth of S. mileensis begins at late August or early September and the bud stage is last for approximately 35 days, flowering time is last for only 2-3 days while fruit stage is the longest, approximately 40-45 days. (2) There are a series of mechanism to guarantee the cross pollination in S. mileensis, such as the versatile anther; the dichogamy in which the maturity of stamen was about 23 hours earlier than the maturity of pistil, that means the overlapping time of the mature stamen and pistil is only 1-2 hours. Furthermore a new mechanism was observed in which the stamen and pistil would change their position in space to avoid self-pollination. At first anther clings to stamen and then turn around on the back of the pistil after a 180° reversion, while filament deviate lead to the anther bent down with 210°. Section shows: anthers are tetrasporangiate. The development of anther walls conforms to the basic type and comprises of epidermis, endothecium, two middle layers and tapetum at the mature stage. The tapetum cells have dual origin and belong to the glandular type. The anther locules have degenerating tapetum nuclei in the middle which are from the early dividing and intruding of the tapetum. Two middle layers are ephemeral; endothecium reduces and epidermis persists and develops to become fibrous-thickening. The cytokinesis of the microspore mother cell in meiosis is of the simultaneous type. Most of the microspore tetrads are tetrahedral and pollen grains are 2-celled and 3-celled when shed. The ovary is bicarpellate, unilocular with some series of ovules located at the parietal placentation. The ovule is unitegmic, enuinucellar and anatropous. The one chalazal megaspore in linear tetrad becomes the functional megaspore and the development of female gametophyte is the polygonum type. Three antipodal cells have multiseriate nuclei and distinct haustorium, and persist like a layer of “outer endosperm” just out of the endosperm nucleus layer. Fertilization is porogamous and of premitotic syngamy type. The development of endosperm conforms to nuclear type and the embryogeny corresponds to the solanum type. The embryo is at the late early heart-shaped stage when seeds released from the capsule. The developed antipodal cells and suspensor structure has magnificent significance for the reproductive adaptation and evolution of the seed after-ripening of S. mileensis.

Key words:Swertia mileensis; flowering; embryology; Swertia; ecological adaptation