汪　月，張艷霞，藺艷麗，吳盼盼，張衛(wèi)東*，高慶榮，張　凱，趙　睿

(1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 / 國家作物生物學(xué)重點實驗室, 山東泰安 271018; 2 山東省濱州市農(nóng)業(yè)局， 山東濱州 256600)

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小麥Ven型胞質(zhì)雄性不育植株與可育植株花藥蛋白質(zhì)組差異研究

汪月1，張艷霞2，藺艷麗2，吳盼盼2，張衛(wèi)東1*，高慶榮1，張凱1，趙睿1

(1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 / 國家作物生物學(xué)重點實驗室, 山東泰安 271018; 2 山東省濱州市農(nóng)業(yè)局， 山東濱州 256600)

摘要:普通小麥具有偏凸山羊草(Ae. ventricosa)細(xì)胞質(zhì)的不育系為Ven型胞質(zhì)雄性不育系(Ven-cytoplasmic male sterility, Ven-CMS)，是粘類小麥CMS的一種類型。該研究對小麥Ven型雄性不育系冀5418A及其同型保持系冀5419B的單核期和二核期的花藥進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，探討小麥質(zhì)核互作雄性不育的分子機(jī)制。通過雙向電泳分離花藥蛋白，基質(zhì)輔助激光解析飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF)對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，利用生物信息學(xué)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白鑒定和功能注釋分析。結(jié)果表明，在分子量19.0～100.0 kD、等電點4～7線性范圍內(nèi)，共檢測到約2 000個蛋白點。2個時期共檢測到差異蛋白98個，其中兩個時期差異表達(dá)變化一致的蛋白點56個；數(shù)據(jù)庫搜索獲得鑒定的蛋白點41個，其中18個蛋白的表達(dá)量在冀5418A 中顯著下調(diào)，23個在冀5418B 中明顯下調(diào)。在不育系和可育系中均有參與能量代謝、活性氧代謝、核糖體合成、花粉物質(zhì)合成的差異蛋白。GO分析預(yù)測差異蛋白生物學(xué)過程多涉及電子傳遞和能量代謝、核糖體代謝、活性氧代謝等，細(xì)胞組成主要是在膜區(qū)域和線粒體，分子功能主要是DNA和RNA結(jié)合功能和水解酶等。KEGG分析表明，較多蛋白分布于碳水化合物代謝、活性氧代謝和蛋白組裝和折疊途徑。推測不育系冀5418A 的雄性不育性除了涉及能量代謝、活性氧清除過程，核糖體蛋白、伴侶蛋白等也有重要作用，雄性不育性可能還與蛋白質(zhì)加工、物質(zhì)合成過程的紊亂有關(guān)。

關(guān)鍵詞:小麥；質(zhì)核互作雄性不育；差異蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向凝膠電泳；基質(zhì)輔助激光解析飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜

植物雄性不育是指植物雄性生殖器官不能產(chǎn)生正常功能的雄配子的現(xiàn)象，無花粉、花粉敗育和花藥不開裂等均屬雄性不育。細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)廣泛存在于高等植物，這種雄性不育性可被核恢復(fù)基因恢復(fù)育性。利用CMS培育不育系進(jìn)行雜交制種，可節(jié)省大量人力物力，提高雜交種子純度，增加農(nóng)作物產(chǎn)量，已經(jīng)成為國際制種業(yè)的主要趨勢。在雜交種選育過程中經(jīng)常遇到不育系胞質(zhì)單一、配合力低及不育性不穩(wěn)定等問題，這些問題的解決需要足夠的理論依據(jù)[1]。長期以來人們對植物CMS不育機(jī)制，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化學(xué)及分子生物學(xué)方面進(jìn)行了大量研究[2]。

蛋白質(zhì)組學(xué)是大規(guī)模研究表達(dá)蛋白質(zhì)的特征，通過對正常個體及不育個體間的蛋白質(zhì)組比較分析，找到某些與育性相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)分子，在蛋白質(zhì)水平上獲得不育發(fā)生、發(fā)展過程的整體輪廓。水稻(Yunnan ZidaoA)是一種無花粉CMS系，該不育系與其保持系單核期花藥蛋白質(zhì)組分析表明在不育系中許多參與碳水化合物代謝和應(yīng)激反應(yīng)的蛋白表達(dá)下調(diào)，說明能量供給不足可能阻礙了花粉正常發(fā)育[3]；雜種柚(G1+HBP系)具有HBP系柚的核基因組和G1系柚的線粒體基因組，表現(xiàn)為雄性不育，G1+HBP系不育性表現(xiàn)為花粉外壁和孢粉素形成缺陷，與保持系HBP系柚相比，G1+HBP系柚中發(fā)生明顯表達(dá)變化的蛋白質(zhì)主要參與碳水化合物合成、能量代謝、蛋白質(zhì)合成和降解[4]。小麥質(zhì)核互作型雄性不育系(S)-1376A及其保持系(A)-1376B在花藥發(fā)育的單核期、二核期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，5個差異蛋白可能參與了物質(zhì)能量代謝、細(xì)胞程序化死亡及花發(fā)育調(diào)控等過程，推測不育系(S)-1376A的雄性不育性可能與這些生理生化代謝過程有關(guān)[5]；此外，幼穗單核期線粒體差異蛋白質(zhì)組分析表明，(S)-1376A雄性不育可能涉及到錳超氧化物歧化酶的表達(dá)差異[6]。

普通小麥具有粘果山羊草(Ae.kotschyi)、易變山羊草(Ae.variabilis)、二角山羊草(Ae.bicornis)或偏凸山羊草(Ae.ventricosa)細(xì)胞質(zhì)的不育系分別被稱為K、V、B、Ven型胞質(zhì)類型CMS, 統(tǒng)稱粘類小麥CMS (SvCMS)。粘類小麥CMS恢復(fù)源廣,恢復(fù)度高,種子飽滿，在雜種小麥中具有廣闊的應(yīng)用前景[7]?；谏a(chǎn)應(yīng)用目的，不同研究者研究了粘類小麥CMS恢復(fù)規(guī)律、雜種優(yōu)勢和細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)特征[7]，調(diào)查了國內(nèi)外不同地區(qū)的普通小麥品種對粘類小麥CMS系的育性恢保關(guān)系，研究了粘類小麥CMS育性基因的地區(qū)分布規(guī)律[8]。在育性機(jī)理方面，進(jìn)行了粘類小麥線粒體DNA的RAPD分析，克隆育性相關(guān)片段[9]；以中國春和T型小麥CMS系的不育相關(guān)基因片段作探針，對粘類小麥不育系、保持系、恢復(fù)系進(jìn)行Northern雜交分析,推測atp6或cox3基因可能參與了粘類小麥CMS的形成[10]。

為了進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平了解粘類小麥CMS育性的相關(guān)機(jī)制，本研究室以普通小麥和偏凸山羊草(Ae.ventricosa)的同核異質(zhì)的不育系(Ven-CMS)和保持系為材料，進(jìn)行了花粉發(fā)育早期，即單核期和二核期花藥的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以期了解Ven型小麥CMS雄性不育的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

供試小麥雄性不育系Ven-冀5418A(Ven代表具有偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì))來自國家作物學(xué)重點實驗室、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥作物雜種優(yōu)勢研究組。采用具有偏凸山羊草 (Ae.ventricosa)不育細(xì)胞質(zhì)的普通小麥(T.aestivumL.)不育系與普通小麥栽培品種冀5418B通過多代核置換回交育成的穩(wěn)定不育系，目前回交世代已在20代(BC20)以上，多年多點試驗表明不育系性狀穩(wěn)定，綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良，該不育系和保持系多年來成為本重點實驗室用來進(jìn)行小麥雜種優(yōu)勢理論研究與實踐應(yīng)用的重要骨干親本種質(zhì)[11,12]。

不育系冀5418A和保持系冀5418B，于2013年10月種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場試驗田(山東，泰安)。細(xì)胞學(xué)觀察表明，不育系冀5418A花粉明顯敗育的主要集中在二核期，但也有少量花粉在單核期和二核期后期發(fā)生敗育。本研究于2014年4月中旬，剝?nèi)∮姿?，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞學(xué)鏡檢，適當(dāng)時期分別采集小孢子發(fā)育至單核期、二核期的花藥，3個重復(fù)，液氮速凍后存儲于-80℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1蛋白提取蛋白提取方法基本采用Damerval等的丙酮/三氯乙酸沉淀法(TCA)[13]，稍有改動。約 0.5 g 花藥勻漿處理，孵育于5.0 mL，20 ℃的沉淀液(含 10% TCA 和 0.07% 2-巰基乙醇的丙酮)，2 h。沉淀蛋白用10% TCA/丙酮液體清洗2次，冷丙酮清洗2次，去除其它非蛋白組分。吸凈上清液，真空干燥沉淀，重溶于等電聚焦(IEF)提取液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS, 20 mmol·L-1DTT 和 0.2% pp～10 pharmalytes)。室溫孵育30 min。15 000 g離心40 min。吸取上清液進(jìn)行IEF。蛋白濃度測定依據(jù)Bradford法[14]，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物。

1.2.2雙向電泳(2-DE)蛋白質(zhì)雙向電泳依據(jù) O’Farrel 方法[15]，稍有修改。分析膠和制備膠上樣量分別為 120 μg和1.5 mg。使用固化pH梯度(IPG)膠條(17 cm，pH 4～7線性膠條，BioRad, USA)，350 μL蛋白溶液，石蠟油覆蓋膠條。IEF 使用 PROTEAN IEF 系統(tǒng)(BioRad，USA)。膠條復(fù)水時電壓 50 V，16 h；隨后250 V 1 h，500 V 1h，1 000 V 1 h，8 000 V 5 h，8 000 V 10 h，IEF期間，保持恒溫 20 ℃ 和每膠條電流 50 μA。在蛋白第二向分離之前，依據(jù)Chivasa等[16]的方法平衡膠條，用DTT、碘乙酰胺先后處理。采用PROTEAN II XL(BioRad, USA)雙向電泳儀，12% SDS-PAGE凝膠蛋白進(jìn)行第二向分離。電泳設(shè)置每個膠條 20 ℃，1 W，30 min，隨后8 W，5 h 40 min，直到溴酚藍(lán)染料前緣到達(dá)凝膠末端。SDS-PAGE電泳后，凝膠用ddH2O清洗3次，每次15 min；蛋白質(zhì)檢測采用硝酸銀染色[17]。制備凝膠膠體采用考馬斯亮藍(lán)染色[18]。

1.2.3圖像與統(tǒng)計分析2-DE圖像與統(tǒng)計分析使用GS-800掃描儀(BioRad，USA)和PDQuest ver.8.0軟件(BioRad, USA)。圖像分析包括圖像過濾，蛋白點檢測和測定，背景消減與蛋白點匹配。所有凝膠與選定的參考凝膠比較，蛋白點自動匹配，手工添加未匹配的斑點。分子量的確定依據(jù)共同電泳的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Amersham Pharmacia Biotech)，蛋白質(zhì)等電點確定是依據(jù)蛋白質(zhì)點在17 cm膠條的偏移程度(pH 4～7, 線性)。蛋白點表達(dá)量由該點蛋白體積表示。歸一化蛋白點體積，蛋白點表達(dá)為占凝膠中所有點體積的百分比，具有統(tǒng)計上差異顯著性的蛋白點為差異表達(dá)蛋白(P<0.05)。

1.2.4斑點切除與凝膠酶切手工切除差異表達(dá)點，切碎成塊。凝膠胰蛋白酶處理基于稍有改動的 Parker 方法[19]。采用含有 30% 乙腈(ACN)的 100 mmol·L-1碳酸氫銨溶液，小塊凝膠脫色至無色，室溫下碳酸氫銨溶液中孵育 15 min，用乙腈將凝膠脫水 10 min。37 ℃ 胰蛋白酶(10 ng·μL-1)處理 20 h。凝膠浸于 60% 乙腈/0.1% 氟乙酸(TFA)溶液，超聲處理 15 min，提取上清液；重復(fù)1次，混合上清液，真空干燥。

1.2.5質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索多肽懸浮液點板到 MALDI 靶板上，使用 CHCA 基質(zhì)。質(zhì)譜分析使用 4 800 蛋白質(zhì)組分析儀 MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司，USA)。蛋白鑒定使用蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，從國家生物技術(shù)中心下載(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，使用 Mascot程序搜索。搜索參數(shù)如下：完全的半胱氨酸 carbamidomethylation 化，蛋氨酸部分氧化，肽質(zhì)量耐受度±100 mg/kg，片段質(zhì)量耐受度±0.4 Da，錯誤斷裂為1。蛋白質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：蛋白質(zhì)評分必須超過顯著閾值水平(P<0.05)和高于50分，至少2個序列匹配。

1.2.6蛋白質(zhì)功能的生物信息學(xué)分析差異蛋白功能注釋首先依據(jù)非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(NR；NCBI)，使用Blast2go程序進(jìn)行(http://www.blast2go.com/b2ghome/about-blast2go)；根據(jù)蛋白質(zhì)GO分析的生物過程、分子功能和細(xì)胞定位進(jìn)行分類(http://www.geneontology.org/)。此外，依據(jù)京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行歸類。

1.2.7統(tǒng)計分析全部統(tǒng)計分析使用SPSS v. 17軟件。蛋白質(zhì)豐度分析中，不育系和可育系各在單核期和二核期，3次生物學(xué)重復(fù)取樣，每個重復(fù)提取蛋白在雙向電泳后進(jìn)行豐度分析。蛋白相對表達(dá)量為3次重復(fù)的平均值。蛋白質(zhì)豐度數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析(ANOVA)。差異顯著性使用 Duncan 氏多重檢測(DMRT)，P<0.05。結(jié)果表示為3次重復(fù)的平均值±SE。

2結(jié)果與分析

2.1小麥Ven型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的蛋白質(zhì)圖譜、差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析

選用 pH 4～7、17 cm IPG 膠條和 12% SDS-PAGE 建立了冀5418A 和冀5418B 的單核期和二核期花藥蛋白質(zhì)電泳體系，獲得了較高分辨率和重復(fù)性的 2-DE 圖譜(圖1)。圖中可見冀5418A 和冀5418B 的蛋白分布模式圖非常相似，但通過軟件分析 2 種材料的 2-DE 銀染電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)花藥中表達(dá)的總蛋白質(zhì)點數(shù)在 2 000 個左右，蛋白質(zhì)斑點多分布于等電點為pI 5～7、分子量為40～80 kD范圍。在同一時期，冀5418A 和冀5418B 兩者存在明顯的量和質(zhì)的差異表達(dá)蛋白點。采用 PDQuest8.0 軟件進(jìn)行斑點檢測，發(fā)現(xiàn)冀5418A 在小孢子發(fā)育的單核期和二核期的花藥總蛋白質(zhì)斑點數(shù)分別為2 125和2 120；冀5418B 在小孢子發(fā)育的單核時期和二核時期的花藥總蛋白質(zhì)斑點數(shù)分別為2 219 和2 217。同一時期，將2個材料表達(dá)量差異大于1.5倍的蛋白點視為差異點，兩個時期共獲得差異表達(dá)蛋白點98個，其中56個在兩個時期都表現(xiàn)出同樣的變化趨勢(上升或者下降)。在冀5418A和冀5418B表達(dá)顯著下調(diào)的分別是18個和23個。

A.冀5418A單核時期花藥；B.冀5418B單核時期花藥；C.冀5418A二核時期花藥；D.冀5418B二核時期花藥;M.分子量Mark圖1　冀5418A與冀5418B小孢子發(fā)育單核期和二核期花藥的總蛋白質(zhì) 2-DE 電泳圖A. Uninucleate stage of JI-5418A; B. Uninucleate stage of JI-5418B; C. Binuleate stage of JI-5418A; D. Binuleate stage of JI-5418B; M. Molecular weight markFig. 1　2-DE images of anther proteins at uninucleate and binucleate stage from the sterile JI-5418A and its maintainer JI-5418B

2.2差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點的質(zhì)譜鑒定與分析

根據(jù)軟件分析結(jié)果，對考馬斯亮藍(lán)染色的冀5418A 和冀5418B 幼穗蛋白分離圖譜上可重復(fù)顯著變化的56個差異蛋白質(zhì)點用 ABI4800 串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF-MS)進(jìn)行了鑒定。所得質(zhì)譜鑒定結(jié)果經(jīng) Mascot 搜索 NCBInr數(shù)據(jù)庫，41個蛋白點(82.9%)被成功鑒定(表1)。結(jié)果表明：在不育系中表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)有BAHD?；D(zhuǎn)移酶DCR、6-磷酸蔗糖磷酸水解酶SPP3、錳超氧化物歧化酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶3、己糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、轉(zhuǎn)醛酶、假定類PDI蛋白、L-抗壞血酸氧化酶類蛋白、腺苷高半胱氨酸酶、蛋白酶體亞基β類2、真核翻譯起始因子1A、L-抗壞血酸過氧化物酶2、T-復(fù)合蛋白1α亞基、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)素類蛋白、蔗糖合成酶1；另外有3個未知蛋白產(chǎn)物、3個預(yù)測蛋白。

表1　差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

續(xù)表1Table 1Continued

編號Code登錄號Accession物種來源Organism匹配蛋白Matchprotein理論pI/分子量TheoreticalpI/Molecularweight實際pI/分子量ExperimentalpI/Molecularwight表達(dá)量差異Expressionquantitydifferences22gi|474122104烏拉爾圖小麥Triticumurartu內(nèi)質(zhì)網(wǎng)素類蛋白Endoplasmin-likeprotein4.91/99.595.64/107.8A23gi|474403224烏拉爾圖小麥Triticumurartu蔗糖合成酶1Sucrosesynthase15.85/92.646.21/85.6A24gi|118748148大麥亞種Hordeumvul-garesubsp.vulgareucw116推定的脂肪酶ucw116putativelipase7.44/38.826.58/42.3B25gi|326514456大麥亞種Hordeumvul-garesubsp.vulgare預(yù)測蛋白Predictedprotein6.51/43.445.98/52.71B26gi|474169559烏拉爾圖小麥Triticumurartu40S核糖體蛋白S2-3SP40Sriboso-malproteinS2-39.78/29.496.59/73.2B27gi|6166036普通小麥Triticumaestivum細(xì)胞色素P45051CytochromeP450516.73/51.646.54/59.8B28gi|4586236普通小麥Triticumaestivum淀粉分支酶StarchbranchingenzymeI6.43/93.995.98/72.1B29gi|326519426大麥亞種Hordeumvul-garesubsp.vulgare預(yù)測蛋白Predictedprotein9.27/107.705.21/87.6B30gi|326496515大麥亞種Hordeumvul-garesubsp.vulgare預(yù)測蛋白Predictedprotein5.31/69.934.36/65.9B31gi|475626752節(jié)節(jié)麥AegilopstauschiiABC轉(zhuǎn)運蛋白B家族成員2ABCtransporterBfamilymember29.45/164.645.38/65.2B32gi|475508105節(jié)節(jié)麥Aegilopstauschii假設(shè)蛋白F775_28041HypotheticalproteinF775_280414.95/59.715.32/63.7B33gi|300592947普通小麥Triticumaestivum未知蛋白產(chǎn)物Unnamedproteinproduct8.95/68.486.74/88.9B34gi|473735508烏拉爾圖小麥Triticumurartu假設(shè)蛋白TRIU Hypotheticalpro-teinTRIUR3_26206R3_262064.82/29.323.21/52.9B35gi|473865714烏拉爾圖小麥TriticumurartuT結(jié)合蛋白γ亞基1T-complexpro-tein1subunitgamma5.98/60.984.36/70.8B36gi|326520057大麥亞種Hordeumvul-garesubsp.vulgare預(yù)測蛋白Predictedprotein4.78/23.284.32/38.9B37gi|257637830普通小麥Triticumaestivum未知蛋白產(chǎn)物Unnamedproteinproduct5.65/32.365.71/48.9B38gi|474136086烏拉爾圖小麥TriticumurartuYTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白2YTHdomainfamilyprotein28.13/102.626.36/78.6B39gi|68449777普通小麥Triticumaestivum核糖體蛋L2 MitochondrialL2ri-bosomalprotein10.44/34.545.34/56.7B40gi|416029普通小麥Triticumaestivum內(nèi)切幾丁質(zhì)酶Endochitinase7.38/36.606.74/82.3B41gi|129916普通小麥Triticumaestivum磷酸甘油酸激酶Phosphoglyceratekinase5.64/42.625.82/58.9B

注：A表示不育系冀5418A中顯著下調(diào)蛋白；B表示保持系冀5418B顯著下調(diào)蛋白。

Note: A means that the sterile Ji5418A is significantly down-regulated; B means that the maintainer Ji5418B is significantly down-regulated

在可育系中表達(dá)下調(diào)的有：ucw116推定的脂肪酶、40S核糖體蛋白S2～3、鈍葉醇14α-去甲基化酶、淀粉分支酶、ABC轉(zhuǎn)運蛋白B家族成員2 、假設(shè)蛋白f775_28041、假設(shè)蛋白TRIUR3_26206、T-復(fù)合蛋白1γ亞基、預(yù)測蛋白、未知蛋白產(chǎn)物、YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白2、線粒體核糖體蛋白L2 、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、磷酸甘油酸激酶。另外有1個未知蛋白產(chǎn)物、3個預(yù)測蛋白。

2.3差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分析

對所獲得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行Gene Ontology分析(圖2)和KEGG 功能注釋(圖3)。

GO 注釋成功的蛋白質(zhì)在GO分析的三大類群(生物學(xué)過程BP、細(xì)胞組分CC 和分子功能MF)下進(jìn)行進(jìn)一步分類(圖2)，圖中列出來注釋成功的蛋白質(zhì)的個數(shù)及其所占的總的百分比數(shù)。通過分析發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)過程中涉及到的蛋白質(zhì)多是參與電子傳遞和能量代謝、核糖體代謝、活性氧代謝、生物和非生物脅迫反應(yīng)和發(fā)育過程等；在細(xì)胞中主要存在于膜區(qū)域、線粒體和其他細(xì)胞器區(qū)域等；分子功能主要歸于DNA和RNA結(jié)合、水解酶、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)運活性等。

為了確定活躍在單核期和二核期差異蛋白的主要參與的生物途徑，使用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要涉及的途徑有碳水化合物代謝(14.25%)、氨基酸代謝(12.96%)、脂質(zhì)代謝(3.85%)、核苷酸代謝(3.70%)、次生代謝(7.69%)、活性氧代謝(14.63%)、能量代謝(3.70%)等(圖3)，代謝途徑中涉及的主要酶為連接酶、羧化酶、還原酶、脫氫酶、差向異構(gòu)酶、磷酸酶等。

圖2　差異表達(dá)蛋白 Gene Ontology 分析.Fig. 2　Histogram showing Gene Ontology analysis of differentially expressed protein.

圖3　差異表達(dá)蛋白 KEGG 分類圖Fig. 3　Pie chart showing KEGG pathway analysis of differentially expressed protein

3討論

以小麥Ven型質(zhì)核互作雄性不育系冀5418A及其同型保持系冀5418B的單核期和二核期花藥為材料，進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組比較、數(shù)據(jù)庫檢索后發(fā)現(xiàn)，56個差異表達(dá)蛋白點中有41個被鑒定出來，這些差異蛋白質(zhì)主要參與能量代謝、活性氧代謝、蛋白質(zhì)加工、物質(zhì)合成等生物學(xué)過程，可能影響冀5418的育性。

3.1能量代謝與植物雄性不育

能量代謝保證植物正常生長發(fā)育，包括花粉正常發(fā)育。植物能量代謝主要包括呼吸底物降解、呼吸鏈的運轉(zhuǎn)和氧化磷酸化三個過程，其中呼吸基質(zhì)的降解包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、無氧呼吸、磷酸戊糖途徑等多條途徑。本研究發(fā)現(xiàn)在不育系和可育系中出現(xiàn)多個參與能量代謝的差異表達(dá)蛋白。

前人研究表明ATP 合成酶基因或細(xì)胞色素氧化酶基因表達(dá)下降導(dǎo)致植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育，粘類小麥CMS的形成可能涉及atp6 或cox3 基因[11]。胡椒保持系中atp6-2基因沉默會導(dǎo)致線粒體中F1FO -ATP 合酶的水解活性提高，伴隨性狀是胡椒花粉敗育，說明atp6-2參與維持花粉的正常育性[20]。在茄屬植物中，atp和cox基因的轉(zhuǎn)錄模式和花粉的育性表型具有相關(guān)性，這兩個基因過量表達(dá)誘導(dǎo)了茄子的雄性不育[21]。這些都說明參與ATP合成酶和細(xì)胞色素氧化酶有關(guān)的基因的不正常表達(dá)會導(dǎo)致兩種酶含量失衡，從而可能會影響到花粉的育性。此外，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)，生成草酰乙酸，主要功能為三羧酸循環(huán)提供草酰乙酸，PEPC的表達(dá)有利于提高植物的光合作用，提高能量的供應(yīng)[22]。玉米中PEPC受到轉(zhuǎn)錄因子Zmdof1的調(diào)節(jié)與控制，Zmdof1的表達(dá)有助于提高PEPC活性，并提高玉米花粉活力[22]。本研究表明小麥不育系中ATP 合成酶和PECP 蛋白表達(dá)下調(diào)，己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和轉(zhuǎn)醛醇酶等參與能量代謝的蛋白也顯著降低表達(dá)。值得指出的是，可育系中也有一些參與能量代謝的蛋白表現(xiàn)下調(diào)，包括葡萄糖苷酶、3-磷酸甘油酸激酶和一個假定的依賴于NADP的氧化還原酶。這些結(jié)果說明在小麥Ven-CMS的形成過程中，能量匱缺可能是花粉發(fā)育不良的原因之一，造成能量匱缺的原因則可能是相關(guān)酶類表達(dá)下降，也可能是由于能量代謝途徑中的相關(guān)酶類表達(dá)不協(xié)調(diào)、不匹配。

3.2活性氧代謝與雄性不育

在植物中，線粒體與細(xì)胞質(zhì)雄性不育性、程序性細(xì)胞死亡(PCD)和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。水稻紅蓮(HL)型細(xì)胞質(zhì)雄性不育廣泛應(yīng)用于雜交水稻生產(chǎn)，HL-CMS可能是慢性氧化脅迫引發(fā)的組織特異性的PCD，進(jìn)而導(dǎo)致小孢子敗育[23]，也可能是線粒體慢性氧化損傷直接誘導(dǎo)HL-CMS 早期發(fā)展階段的小孢子敗育[24]。在辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的花粉敗育階段(花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期)，不育系花藥中有較高的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)表達(dá)，花藥中過氧化物酶基因、錳超氧化物歧化酶基因、CAT2和CAT3 的轉(zhuǎn)錄水平也比較高[25]。蛋白質(zhì)組學(xué)表明番茄7B-1突變體的花粉敗育發(fā)生在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂之前，此時，不育系中的超氧化物歧化酶表達(dá)量上調(diào)[26]。本研究結(jié)果顯示在Ven-CMS小麥的單核期和二核期，錳超氧化物歧化酶和CAT表達(dá)下調(diào)，但在可育系中過氧化物酶表達(dá)下調(diào)，說明Ven-CMS不育系花粉形成早期，清除活性氧的酶系統(tǒng)表達(dá)紊亂，氧化脅迫影響花粉發(fā)育，導(dǎo)致發(fā)育紊亂，雄性不育。

3.3核糖體蛋白與植物雄性不育

核糖體蛋白質(zhì)(ribosomal protein，RP)是參與構(gòu)成核糖體的所有蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核糖體蛋白有80種，廣泛分布于各種組織中，它們與核糖核酸共同組成核糖體，在蛋白質(zhì)的生物合成中起重要作用。

本研究表明在Ven CMS小麥中，葉綠體核糖體蛋白 L19、核糖體蛋白L1、核糖體蛋白S3的表達(dá)下調(diào)，而核糖體蛋白L2在可育系中表達(dá)下調(diào)。

前人同位素編碼親和標(biāo)簽分析表明紅蓮水稻雄性不育系在花粉發(fā)育單核期，保持系中核糖體蛋白 L3B相對于不育系過量表達(dá)[27]。野敗型水稻CMS系統(tǒng)中，可育系中ribosomalproteingenerpl5有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而不育系中沒有轉(zhuǎn)錄表達(dá)[28]。RT102A是野生稻與水稻的同核異質(zhì)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，RT102C是其保持系，RT102C使得RT102A的orf352與核糖體蛋白基因rpl5共轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生有活力的花粉，轉(zhuǎn)錄本缺失rpl5，則花粉不育，說明可育基因orf352，必須有核糖體蛋白基因rpl5的參與才能有育性恢復(fù)作用[29]。本研究表明核糖體蛋白可能參與了花粉育性的發(fā)生。鑒于核糖體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、精細(xì)，亞基組成匹配嚴(yán)格，在不育系中也有個別核糖體蛋白表達(dá)上調(diào)，說明各個亞基的表達(dá)差異也可能造成核糖體組成的紊亂，導(dǎo)致蛋白合成異常，花粉敗育。

3.4花粉粒的物質(zhì)合成與植物雄性不育

本研究表明在不育系中BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶DCR、6-磷酸蔗糖水解酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶表達(dá)下調(diào)，可育系中淀粉分枝酶、葡聚糖酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞色素P450等表達(dá)下調(diào)。

不育系中表達(dá)下調(diào)的BAHD脂酰轉(zhuǎn)移酶DCR是屬于BAHD家族成員的脂酰轉(zhuǎn)移酶。前人報道?；D(zhuǎn)移酶參與了植物的育性發(fā)育，多是在花粉發(fā)育后期，參與花粉角質(zhì)的發(fā)育過[30-31]。擬南芥中，BAHD脂酰轉(zhuǎn)移酶DCR的主要作用是將脂質(zhì)單體摻入脂質(zhì)聚合物結(jié)構(gòu)，形成花角質(zhì)，該基因的缺失突變體為角質(zhì)層發(fā)育不完善，表皮細(xì)胞分化改變，產(chǎn)生雄性不育[30]。另一種乙酰轉(zhuǎn)移酶GPAT6，是一種甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)，萼片和花瓣角質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶，表達(dá)降低使得絨氈層發(fā)育出現(xiàn)缺陷，花粉外壁發(fā)育不全，導(dǎo)致花粉粒敗育；GPAT6還參與到小孢子從四分體中的釋放[31]。本研究表明在花粉發(fā)育的早期，單核期和二核期，BAHD?；D(zhuǎn)移酶DCR可能已經(jīng)開始具有表達(dá)差異。此外，可育系中有1個下調(diào)的P450家族蛋白，歐洲油菜中的BnCYP704B1是細(xì)胞色素P450家族的成員，該蛋白參與絨氈層特定的代謝途徑，與花粉外壁形成有關(guān)，該基因與其同源基因的雙突變花藥中不能產(chǎn)生花粉[32]。本研究表明花粉發(fā)育晚期，影響花粉發(fā)育、花粉育性的基因在發(fā)育早期就有了表達(dá)差異。其他花藥物質(zhì)合成差異蛋白對Ven CMS的形成作用則有待于進(jìn)一步分析。

3.5蛋白加工和降解與植物雄性不育

本研究表明參與蛋白加工和降解的差異蛋白比較多，不育系中下調(diào)的蛋白有FKBP型肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶1(FKBP-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)、酯酰轉(zhuǎn)移酶、二硫鍵異構(gòu)酶、伴侶蛋白、Chaperonin GroEL (HSP60 family) 、Chaperonin GroEL (HSP60 family)和親環(huán)素A，可育系中上調(diào)蛋白有類泛素蛋白和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)硫酶，以及一種含有幾丁質(zhì)結(jié)合域類型3的未知蛋白。

不育系中表達(dá)下調(diào)的FKBP型肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶1是催化肽酰脯氨基順反異構(gòu)化的酶，它能夠加速蛋白自身折疊、體內(nèi)新生肽鏈折疊及變性蛋白質(zhì)體外折疊[33]。小麥FKBP73轉(zhuǎn)化水稻，轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明FKBP73全長表達(dá)產(chǎn)生可育的水稻植株，而肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶域單獨表達(dá)導(dǎo)致雄性不育，說明該基因與花粉育性相關(guān)[33]。熱激蛋白或者伴侶蛋白是指協(xié)助其他大分子結(jié)構(gòu)折疊/退褶、組裝/解體的蛋白質(zhì)，熱激蛋白可以防止不正確折疊中間體的形成，防止沒有組裝的蛋白亞基的錯誤聚集，協(xié)助多肽鏈跨膜轉(zhuǎn)運以及大的多亞基蛋白質(zhì)的組裝和解體[34]。擬南芥的溫敏雄性不育系1，TMS1基因，編碼一種熱激蛋白Hsp40的同系物，該基因突變導(dǎo)致熱敏配子體雄性不育[34]。在高粱中，反義RNA研究顯示HSP70表達(dá)降低花粉育性[35]，熱激蛋白在多種不育系中均有表達(dá)異?，F(xiàn)象，包括熱誘導(dǎo)的雄性不育[36]、化殺誘導(dǎo)的雄性不育[37]和自然突變體重的雄性不育[26]。植物雄性育性發(fā)育需要多種蛋白加工酶參與，在水稻中，抽穗前冷處理導(dǎo)致水稻花粉活力降低，伴隨花粉活力降低，是FKBP65基因和HSP基因的表達(dá)下降，說明了FKBP和HSP在花粉發(fā)育中的育性保持作用[38-39]。本研究表明蛋白加工和降解與植物雄性不育具有顯著相關(guān)性，參與蛋白可能還有酯酰轉(zhuǎn)移酶、二硫鍵異構(gòu)酶、伴侶蛋白、Chaperonin GroEL (HSP60 family) ，Chaperonin GroEL (HSP60 family)、親環(huán)素A、后加工類泛素和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)硫酶等。

此外，還有一些差異表達(dá)蛋白，在不育系中表達(dá)下調(diào)的有驅(qū)動蛋白-like蛋白、微管蛋白、氨基酸氧化酶、腺苷高半胱氨酸酶、脂肪酶、轉(zhuǎn)錄因子1、Karyopherin和糖基轉(zhuǎn)移酶，可育系中表達(dá)下調(diào)的有磷脂酶、神經(jīng)氨酸酶、RNA結(jié)合蛋白、絲氨酸/蘇氨酸激酶。但是目前為止沒有報道說明這些蛋白直接與植物育性相關(guān)，本研究僅說明這些蛋白在植物雄性育性發(fā)育過程中有顯著的表達(dá)差異，可能參與了植物雄性不育，為進(jìn)一步的研究提供線索。

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(編輯:宋亞珍)

文章編號:1000-4025(2016)06-1135-11

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1135

收稿日期:2016-01-19;修改稿收到日期:2016-05-23

基金項目:山東省自然科學(xué)基金重點基金(ZR2012CZ001;ZR2013CZ001)

作者簡介:汪月(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事小麥遺傳育種與種業(yè)科學(xué)方面的研究。E-mail：757777876@qq.com *通信作者:張衛(wèi)東,副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事小麥遺傳育種和生物技術(shù)研究。E-mail：zhangwd@sdau.edu.cn

中圖分類號:Q343.3+4;Q342

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Comparative Proteomics Analysis of Anther Proteins between Ven Cytoplasmic Male Sterile and Fertile Plants on the Early Stages of Pollen Development in Wheat

WANG Yue1, ZHANG Yanxia2, LIN Yanli2, WU Panpan2, ZHANG Weidong1*,GAO Qingrong1, ZHANG Kai1, ZHAO Rui1

(1 Agronomy College Shandong Agricultural University/ National Key Laboratory of Crop Biology, Taian, Shandong, 271018 China; 2 Agricultural Bureau of Binzhou City, Shandong Binzhou, Shangdong 256660, China)

Abstract:The sterile line of common wheat (Triticum aestivum) with the cytoplasm of Ae. ventricosa is Ven cytoplastmic male sterile (Ven CMS), and it is one type of Sv CMS in wheat. To better understand the molecular mechanism on nucleus-cytoplasmic interaction male sterility in wheat, we analyzed differential proteomics at uninucleate and binucleate stages in sterile line JI5418A and its maintainer line JI5418B. Another proteins were separated by two dimensional electrophoresis. Differential protein spots were identified by matrix-assisted laser desorption /ionization tandem time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-TOF). Identification and function annotation and analysis of these proteins were analyzed by bioinformatics methods. About 2000 reproducibly protein spots could be visualized on these 2D-gels within M 19.0-100.0 kD and pI 4-7. Ninety eight differentially expressed proteins were found between JI5418A and JI5418B, and among these proteins 56 showed same differences at both stages. Forty one proteins were successfully identified in NCBI database. Eighteen and 23 proteins were significantly down-regulated expressed in JI5418A, and JI5418B, respectively. The differentially expressed proteins involving in energy metabolism, active oxygen scavenge, ribosome synthesis and pollen wall formation existed in both sterile and fertile lines. GO analysis predicted many differential expressed proteins involved in electron transport and energy metabolism, ribosome metabolism, and active oxygen metabolism, etc. in biological process, distributed in membrane region and mitochondria in cellular component, DNA and RNA binding function and hydrolytic enzymes in molecular function. KEGG pathways analysis indicated that more proteins involved in carbohydrate metabolism, active oxygen metabolism and protein assembly and folding than other pass ways. It is speculated that male sterility in JI5418B might be related to energy metabolism, active oxygen scavenging process. Ribosomal protein and chaperone protein also have great roles in controlling its fertility. Male sterility in Ven CMS might be related to the regulation disorders in protein processing and material synthesis.

Key words:Triticum aestivum; cytoplasmic nuclear male sterility; differential proteomics; two-dimensional gel electrophoresis; MALDI-TOF-TOF