李　軍，趙愛春，劉長(zhǎng)英，呂蕊花，劉曉清，余茂德*

(1 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 貴陽(yáng) 550025；2 西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

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桑樹花青素合成相關(guān)MYB類轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與功能分析

李軍1，趙愛春2，劉長(zhǎng)英2，呂蕊花2，劉曉清1，余茂德2*

(1 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 貴陽(yáng) 550025；2 西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

摘要:該研究通過生物信息學(xué)方法，從桑樹基因組中獲得了8個(gè)花青素生物合成調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(MYB)候選基因，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析了各基因在不同組織及果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)。聚類分析結(jié)果顯示，4個(gè)MYB基因與葡萄、水稻和玉米花青素調(diào)控相關(guān)MYB基因聚為一類，僅1個(gè)MYB基因與擬南芥、蘋果花青素調(diào)控相關(guān)MYB基因聚為一類。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示多數(shù)基因在雄花中高水平表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，2個(gè)MYB基因(MnMYBJ和MnMYB4)在果實(shí)發(fā)育過程中持續(xù)下調(diào)，1個(gè)MYB基因(MnMYB330)在果實(shí)發(fā)育過程中顯著上調(diào)，分別與花青素在桑椹中的積累成負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系。因此，桑樹MYB基因家族對(duì)花青素的積累可能存在正調(diào)控與負(fù)調(diào)控兩種機(jī)制。

關(guān)鍵詞:桑樹；花青素；轉(zhuǎn)錄因子；調(diào)控；表達(dá)分析

花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬于酚類化合物中的類黃酮[1]。花青素的結(jié)構(gòu)母核由2個(gè)苯環(huán)和1個(gè)含氧芳香環(huán)構(gòu)成，2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子環(huán)上各碳位的-OH或-OCH3取代基的數(shù)量和位置決定了花青素的類型[2]。花青素含量較高的水果主要有藍(lán)莓、桑椹、葡萄等，其中桑椹中花青素含量為鮮重5.768 mg/g[3]，比葡萄鮮果(0.059 mg/g)[4]、藍(lán)莓鮮果(0.25～4.38 mg/g)[5]高出許多。Hassimotto等[6]與Kang等[7]先后證明了桑椹花青素提取物對(duì)于卡拉膠引起的急性炎癥反應(yīng)具有較好的抑制作用。桑椹花青素能夠抑制糖尿病小鼠的胰島退化及膀胱功能紊亂[8]。桑椹花青素提取物可抑制肥胖小鼠不飽和脂肪酸誘導(dǎo)的脂肪合成、增強(qiáng)肝臟中脂肪氧化相關(guān)基因的表達(dá)并增加脂肪清除能力，從而抑制脂肪在肝臟中的積累[9-10]。

花青素在桑椹中的積累依賴于其生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制。 植物花青素生物合成途徑是目前研究較多且最清楚的次生代謝途徑之一，屬于是類黃酮代謝途徑的一個(gè)重要分支，以苯丙氨酸為起始底物，經(jīng)花青素合成酶(ANS)等關(guān)鍵酶的作用下生成花色苷，最后經(jīng)過糖基化修飾形成花青素[1]。目前本研究小組已經(jīng)完成桑樹花青素生物合成的關(guān)鍵酶基因的鑒定和功能分析[11]，對(duì)調(diào)控機(jī)制的研究尚處于起步階段?；ㄇ嗨厣锖铣杉吧胤e累受到植物內(nèi)部因子(如營(yíng)養(yǎng)水平、生長(zhǎng)發(fā)育等)以及環(huán)境因子(如光、溫度以及病原感染等)的協(xié)同作用，其中光和溫度是主要的調(diào)控因素[12]。研究表明MYB類轉(zhuǎn)錄因子(尤其是R2R3-MYB)是多種信號(hào)傳導(dǎo)的末端響應(yīng)蛋白，直接參與調(diào)控花青素生物合成關(guān)鍵酶的表達(dá)水平。MYB10和MYBA是薔薇目植物蘋果、梨及草莓花青素合成的調(diào)控因子[13]。玉米中MYB基因C1調(diào)控花青素的合成，是草本植物研究花青素生物合成的經(jīng)典模型[14]。本研究通過生物信息學(xué)方法從桑樹基因組中鑒定花青素合成相關(guān)的MYB基因家族成員，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究MYB基因的表達(dá)模式，分析這些基因與桑椹花青素積累關(guān)系，為探索桑樹花青素生物合成的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

2014年3～5月份于西南大學(xué)桑樹資源圃摘取桑品種(‘嘉陵30號(hào)’)6個(gè)時(shí)期(盛花后0、1、2、3、4和5周)的果實(shí)，分別標(biāo)示為時(shí)期S0～S5，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。質(zhì)粒載體pMD19-T、TaKaRa ExTaq酶、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、RNAiso Plus試劑盒、DNase Ⅰ、DL 2000 DNA Marker等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。引物由南京金斯瑞公司合成。

1.2方法

1.2.1桑樹MYB基因家族成員的鑒定從NCBI下載花青素合成相關(guān)MYB基因(蘋果MdMYB10、MdMYB110a和MdMYBA，葡萄VvMYBA，擬南芥PAP1、PAP2，玉米ZmC1)的氨基酸序列，通過BlastP程序檢索桑樹基因組中的預(yù)測(cè)蛋白序列，期望值為e-10。將獲得的期望值較低的氨基酸序列作為query序列，檢索蘋果、葡萄、草莓的基因組及預(yù)測(cè)基因序列，如2次結(jié)果一致，則視為直系同源基因。

1.2.2桑樹MYB基因家族的生物信息學(xué)分析及氨基酸序列比對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)在SMART (http: //smart. Embl-heidelberg.De/smart/set_mode. cgiNORMA)上進(jìn)行，蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析采用ExPasy (http: // web.Expasy.Org/)。用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，最后用GeneDoc對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行編輯。采用MEGA4.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3桑樹花青素調(diào)控MYB基因家族的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)來源于家蠶國(guó)家基因組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成的桑樹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，具有根、皮、冬芽、雄花和葉5個(gè)組織，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)豐度RPKM值[Reads/(Fragments) Per Kilobase of exon model per Million mapped reads]衡量MYB基因在各組織中的表達(dá)水平。

1.2.4花青素總量的檢測(cè)桑椹花青素提取與測(cè)量參考Rabino等[15]的方法。將-80 ℃保存的桑椹在液氮中研磨成粉，稱取0.1 g粉末到2 mL離心管中，加入600 μL預(yù)冷的酸性甲醇(含1% HCl)，4 ℃下提取12 h后，加入400 μL ddH2O和400 μL氯仿，充分混勻后12 000 r/min離心10 min，取上清分別檢測(cè)液體在530和570 nm波長(zhǎng)下的吸光值，花青素相對(duì)含量=A530-0.25A570。

1.2.5桑樹總RNA提取及cDNA合成各取0.1 g新鮮樣品于預(yù)冷的研缽中加液氮迅速研磨成粉末狀，參照RNAiso抽提試劑盒(TaKaRa)操作說明提取總RNA，經(jīng)DNA酶消化后用50 μL DEPC水溶解，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。以總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)15為引物，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)合成cDNA第1鏈，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6引物設(shè)計(jì)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)由于花青素相關(guān)MYB基因的表達(dá)與花青素積累具有很強(qiáng)的相關(guān)性，且在果實(shí)發(fā)育后期有幾百倍的變化，因此選取了‘嘉陵30號(hào)’4個(gè)時(shí)期(S0、S3、S4和S5)的果實(shí)來研究MYB基因家族成員表達(dá)水平，篩選與花青素合成相關(guān)的MYB基因。根據(jù)MYB基因核苷酸特異序列采用Primer 5.0分別設(shè)計(jì)8個(gè)候選基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)，結(jié)果采用2-ΔCt表示。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自TaKaRa公司，所涉及到的其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2結(jié)果與分析

2.1桑樹類黃酮生物合成相關(guān)MYB基因的鑒定

下載已經(jīng)報(bào)道的調(diào)控花青素生物合成的MYB基因氨基酸序列，通過BlastP程序檢索同源MYB基因。從桑樹基因組中鑒定出8個(gè)與類黃酮生物合成相關(guān)的MYB候選基因(表2)，分布于不同的scaffold上，2個(gè)基因僅1個(gè)內(nèi)含子，5個(gè)基因存在2個(gè)內(nèi)含子，MnMYBB有11個(gè)內(nèi)含子，可能存在較復(fù)雜的剪切方式。這些基因編碼261～478 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量大小從29.2～54.0 kD。3個(gè)MYB蛋白(MnMYB86、MnMYB11和MnMYB21)屬于弱酸性蛋白質(zhì)，MnMYB330等5個(gè)蛋白屬于堿性蛋白質(zhì)。多序列比對(duì)顯示6個(gè)MYB蛋白(MnMYB308、MnMYB330、MnMYB86、MnMYB4、MnMYB11、MnMYB21)的氨基酸序列中含有保守的R2R3結(jié)構(gòu)域(圖1)，MnMYBB與MnMYBJ與其他基因差異較大。MYB蛋白中含有5個(gè)保守的色氨酸(W)殘基，MnMYBJ基因的第3個(gè)色氨酸被谷氨酸(Glu，E)，MnMYBJ和MnMYB4的第4個(gè)色氨酸分別被苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))和絲氨酸(Ser，S)取代，MnMYBB與MnMYBJ的第5個(gè)色氨酸分別被酪氨酸(Tyr，Y)和甲硫氨酸(Met，M)取代，這些保守位點(diǎn)的突變可能與MYB蛋白的功能有一定的聯(lián)系。

2.2桑樹MYB基因家族的聚類分析

為了推測(cè)8個(gè)桑樹MYB蛋白的功能，構(gòu)建了MYB蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。桑樹5個(gè)MYB蛋白可分別歸入2個(gè)類群，均為類黃酮合成相關(guān)MYB基因。MnMYB11、MnMYB330、MnMYB308、MnMYB86與柿子DkMyb4(DiospyroskakiThunb.，AB503701)、葡萄VvMybPA1(Vitisvinifera，NM_001281231)、水稻C1 protein(Oryzasativa，CAA75509)及玉米P(Zeamays，AAK81903)歸入Group Ⅰ類。MnMYB21與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的PAP1(NP_176057)和PAP2(NP_176813)、蘋果(Malusdomestica)的MdMYB10(ACQ45201)和MdMYB110a(BAJ24837)歸入Group Ⅱ類。MnMYB4、MnMYBB和MnMYBJ沒有歸入2個(gè)類群，與保守性位點(diǎn)色氨酸殘基突變有較高的一致性，可能參與類黃酮生物合成以外的其他代謝路徑的調(diào)控。

表1　本研究所用引物

表2　桑樹花青素生物合成相關(guān)MYB基因家族成員

橫線標(biāo)注為R2、R3蛋白結(jié)構(gòu)域；黑色方框標(biāo)注為保守的色氨酸(W)殘基；MnMYBJ. 川桑(XP_010109645.1); MnMYBB. 川桑(XP_010096371.1);MnMYB21. 川桑(XP_010099251.1); MnMYB86. 川桑(XP_010089049.1); MnMYB4. 川桑(XP_010107438.1); MdMYB110a.蘋果(BAJ24837); MdMYB1a. 蘋果(ACQ45201); MnMYB330. 川桑(XP_010104477.1); MnMYB308. 川桑(XP_010090332.1); MnMYB11. 川桑(XP_010107990.1); DkMyb4. 柿子(AB503701); PAP1. 擬南芥(NP_176057); C1. 水稻(CAA75509);P. 玉米(AAK81903)圖1　桑樹MYB蛋白多序列比對(duì)The black lines indicated conserved R2 and R3 domain; conserved Try residues was shown by solid box; MnMYBJ. Morus notabilis (XP_010109645.1); MnMYBB. Morus notabilis (XP_010096371.1); MnMYB21. Morus notabilis (XP_010099251.1); MnMYB86.Morus notabilis (XP_010089049.1); MnMYB4. Morus notabilis (XP_010107438.1); MdMYB110a. Malus domestica L. (BAJ24837); MdMYB1a. Malus domestica L. (ACQ45201); MnMYB330. Morus notabilis (XP_010104477.1); MnMYB308. Morus notabilis (XP_010090332.1); MnMYB11. Morus notabilis (XP_010107990.1); DkMyb4. Diospyros kaki Thunb. (AB503701); PAP1.Arabidopsis thaliana (NP_176057); C1. Oryza sativa (CAA75509); P. Zea mays L. (AAK81903)Fig. 1　Protein muli-aligment of MYB genes in mulberry

2.3桑樹MYB基因的轉(zhuǎn)錄組分析

通過對(duì)桑樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索及分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)MYB基因在雌花中均有高量的表達(dá)(圖3)。其中MnMYB86僅在雌花中大量表達(dá)，在其他組織中沒有檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本；MnMYBB在雌花及葉中表達(dá)量較高，在根、表皮及冬芽中表達(dá)量較低；MnMYB4在雌花中能檢測(cè)到表達(dá)，在其他組織中表達(dá)量較低；MnMYBJ在表皮和雌花中檢測(cè)到表達(dá)，在根、冬芽及葉中沒有檢測(cè)到；MnMYB11在雌花及葉中都具有較高的表達(dá)，在根、表皮和冬芽中表達(dá)較少；MnMYB21在雌花中大量表達(dá)，在表皮及葉中有少量的表達(dá)，根及冬芽沒有檢測(cè)到表達(dá)；MnMYB330在表皮及雌花中表達(dá)量較高；MnMYB308在雌花及葉中高量表達(dá)，表皮中有少量表達(dá)，根及冬芽中表達(dá)量較低。

圖中分支點(diǎn)的數(shù)字表示基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)的自展支持率；標(biāo)尺代表遺傳距離圖2　MYB基因家族進(jìn)化關(guān)系The nodes in the figure show the bootstrap value on replications, and the scale represent the genetic distanceFig. 2　The phylogenetic tree of MYB gene family in mulberry

圖3　桑樹花青素相關(guān)MYB基因表達(dá)Fig. 3　Transcription analysis of anthocyanin related MYB genes in mulberry

2.4桑椹成熟過程中花青素含量的測(cè)定

桑椹是典型的聚花果，從授粉到果實(shí)完全成熟需要經(jīng)歷大約35～40 d，根據(jù)果實(shí)特征與果實(shí)外觀將整個(gè)果實(shí)發(fā)育時(shí)期分為S0～S5等6個(gè)時(shí)期，其中S0為剛授粉完畢，S5為果實(shí)完全成熟，每個(gè)時(shí)期大概間隔7 d。通過測(cè)定不同時(shí)期花青素含量，發(fā)現(xiàn)從S0～S4的5 個(gè)時(shí)期中花青素的含量較低，而在S4～S5生長(zhǎng)過程中，花青素含量變化了將近8倍，說明這個(gè)時(shí)期是花青素的快速合成時(shí)期(圖4)。

2.5MYB基因家族在桑椹發(fā)育過程中的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步篩選與桑樹花青素合成相關(guān)的MYB基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因在花青素合成較快的幾個(gè)時(shí)期(S0、S3、S4和S5)的桑椹中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示8個(gè)基因呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式(圖5)，MnMYB308在果實(shí)發(fā)育的4個(gè)時(shí)期都具有較高的表達(dá)，MnMYBJ和MnMYB4隨著果實(shí)的發(fā)育呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)；MnMYB6在果實(shí)發(fā)育中呈現(xiàn)早期表達(dá)量高和晚期表達(dá)量較低；MnMYBB呈現(xiàn)先下調(diào)表達(dá)再上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)；MnMYB330 在果實(shí)的發(fā)育過程中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，且在果實(shí)發(fā)育過程中增加了近3倍。

圖5　桑樹花青素相關(guān)MYB基因在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)分析Fig. 5　Expression analysis of anthocyanin related MYB genes in different stages of mulberry fruits

S0～S5為盛花后0、1、2、3、4和5周的果實(shí)；下同。(注意圖中S的數(shù)字下標(biāo))圖4　桑椹發(fā)育過程中花青素的含量S0-S5 represent 0, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 weeks after full bloom of fruits；The same as belowFig. 4　The content of anthocyanins during the development of mulberry fruits

3討論

桑椹在發(fā)育過程中經(jīng)歷了開花、受精、生長(zhǎng)、脫綠、膨大、變紅等形態(tài)變化過程，在變紅過程之前花青素幾乎沒有合成，而變紅時(shí)期的幾天時(shí)間內(nèi)花青素大量合成[16]。因此，桑椹中花青素的積累取決于果實(shí)生長(zhǎng)后期關(guān)鍵酶及調(diào)控基因表達(dá)模式的改變。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，由4R-MYB、3R-MYB、R2R3-MYB及MYB-related 4個(gè)亞類組成[17]。研究表明R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子參與了次生代謝的調(diào)控、細(xì)胞分化及細(xì)胞周期的控制、生物和非生物脅迫的響應(yīng)等多種生理生化過程[18]。在花青素生物合成的調(diào)控中，WD40、bZIP、R2R3-MYB、bHLH及HY5等轉(zhuǎn)錄因子可能形成多種復(fù)合體，并與結(jié)構(gòu)基因側(cè)翼序列中的順式作用元件結(jié)合，從而抑制或者激活相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控花青素在植物中的積累[19]。本研究從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出6個(gè)與花青素合成相關(guān)的MYB家族候選基因具有典型的R2R3結(jié)構(gòu)。聚類分析發(fā)現(xiàn)MnMYB11、MnMYB330和MnMYB308與已經(jīng)報(bào)道的與花青素合成相關(guān)的MYB基因DkMyb4[20]、VvMybPA1[21]聚為一類，它們可能是桑樹花青素合成的調(diào)控基因之一。MYB不僅包括正調(diào)控的成員(矮牽牛AN2、AN4)，也發(fā)現(xiàn)了一些負(fù)調(diào)控的MYB蛋白(AtMYBL2)[22]。

草莓的FaMYB1蛋白C端具有一個(gè)基序pdLNLD/ELXiG/S，可能與一些正調(diào)控因子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶基因，從而達(dá)到調(diào)控花青素合成的目的[23]。本研究鑒定出的花青素合成相關(guān)的6個(gè)R2R3-MYB候選基因在果實(shí)發(fā)育過程中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。MnMYBJ和MnMYB4隨著果實(shí)的發(fā)育呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，分別下調(diào)至1/6和1/8，且在聚類分析中沒有和其他植物中類黃酮合成相關(guān)的MYB基因聚為一類，其中因此它們可能是桑樹花青素合成的負(fù)調(diào)控基因；MnMYB330 在果實(shí)的發(fā)育過程中呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，且在果實(shí)發(fā)育過程中增加了3倍，可能是桑樹花青素合成的正調(diào)控基因之一。因此桑樹MYB基因家族對(duì)花青素的合成與蘋果、草莓一樣都存在正調(diào)控與負(fù)調(diào)控兩種機(jī)制，但是參與的MYB基因成員存在較大的差異。然而，由于缺少有效的桑樹轉(zhuǎn)基因體系，桑樹花青素相關(guān)MYB因子的功能有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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(編輯:宋亞珍)

文章編號(hào):1000-4025(2016)06-1110-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1110

收稿日期:2016-01-05;修改稿收到日期:2016-05-09

基金項(xiàng)目:貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合SY[2015]3030);貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院博士基金

作者簡(jiǎn)介:李軍(1986-)，男，博士，副教授，主要從事植物功能基因研究。E-mail: speker@163.com *通信作者:余茂德，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事桑樹遺傳育種研究。E-mail: yumd@163.com

中圖分類號(hào):Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Identification and Function Analysis of Anthocyanin Biosynthesis Related MYB Genes in Mulberry

LI Jun1, ZHAO Aichun2, LIU Changying2, Lü Ruihua2, LIU Xiaoqing1, YU Maode2*

(1. Guiyang college of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025，China; 2. Collage of Biotechnology of Southwest University, Chongqing 400715，China)

Abstract:In our study, 8 anthocyanins biosynthesis related MYB candidate genes were identified by using bioinformatics technologies and the expression profiles in different tissues and stages of fruits during the development and determined by transcriptome data and real time PCR. Phylogenetic analysis indicated that 4 MYB genes were closed to MYB genes from Vitis vinifera L., Oryza sativa and Zea mays L., while only 1 MYB gene was grouped into one cluster with those from Arabidopsis thaliana and Malus domestica L.. High level of transcripts of major genes in male flower was determined by transcriptome data. Continuous down-regulation expressions of MnMYBJ and MnMYB4 during the development of mulberry fruits were confirmed, while MnMYB330 had a continuous up-regulation expression. Therefore, MYB genes have positive regulation and negative regulation during the accumution of anthocyanins.

Key words:mulberry; anthocyanins; transcription factors; regulation; expression analysis