呂照清,任丹丹,周　賀,喬玉山

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,南京 210095)

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‘黃花’梨及其芽變‘綠黃花’梨HHT基因克隆與表達(dá)分析

呂照清,任丹丹,周賀,喬玉山*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,南京 210095)

摘要:該試驗以砂梨品種‘黃花’梨(果皮褐色)及其芽變‘綠黃花’梨(果皮綠色)盛花后第8周的果皮為試材，利用常規(guī)PCR和巢式PCR技術(shù)克隆了ω-羥基棕櫚酸O-阿魏酰轉(zhuǎn)移酶(ω-hydroxypalmitate O-feruloyl transferase, HHT)基因cDNA的全長，命名為 PpyHHT(登錄號為KX131155)。序列分析結(jié)果表明，該基因開放閱讀框(ORF)為1 335 bp，編碼444個氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，推定的PpyHHT蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為49.91 kD，等電點(diǎn)是4.75，與白梨相似性高達(dá)98%，親緣關(guān)系最近。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)表達(dá)分析顯示，2種梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6～9周的4個轉(zhuǎn)色關(guān)鍵期表達(dá)量不斷變化，在‘黃花’梨果皮中的表達(dá)量明顯高于‘綠黃花’梨。推測 PpyHHT基因可能參與砂梨果實褐色/綠色性狀的形成。

關(guān)鍵詞:砂梨； HHT基因；克隆；生物信息學(xué)；基因表達(dá)

砂梨(PyruspyrifoliaNakai)原產(chǎn)中國，其果皮呈褐色、綠色和紅色等類型，且以褐色和綠色為主。紅皮梨果實的色澤受花青素控制，而砂梨果實褐色/綠色的形成機(jī)理與紅皮梨不同[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，砂梨果實的褐色是由于角質(zhì)層和表皮細(xì)胞破損后木栓層的積累形成的[3-4]。

木栓層由木栓質(zhì)片層結(jié)構(gòu)組成，木栓質(zhì)是由木栓聚酚結(jié)構(gòu)域[suberin poly(phenolic) domain，SPPD]和木栓聚酯結(jié)構(gòu)域[suberin poly(aliphatic) domain，SPAD]組成的大分子結(jié)構(gòu)。SPPD主要是羥基阿魏酸及其衍生物共價連接而成，調(diào)控苯丙烷-阿魏酸途徑的酶主要有：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、ω-羥基棕櫚酸O-阿魏酰轉(zhuǎn)移酶(HHT)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和肉桂酰CoA氧化還原酶(CCR)等[5-6]；SPAD主要由甘油、α,ω二羥基羧酸和長鏈脂肪酸等以酯鍵或醚鍵交聯(lián)而成[6-8]，參與長鏈脂肪酸代謝的酶主要有：長鏈脂肪酸?；鵆oA合成酶(LACS)、β-酮酰CoA合酶(KCS)、脂肪酸ω-羥化酶(FAωH)和CYP86A脂肪酸ω-羥基化酶等[9-12]。目前已克隆的梨木栓質(zhì)合成相關(guān)基因有PAL、C4H和CCR等[13-15]。

ω-羥基棕櫚酸O-阿魏酰轉(zhuǎn)移酶(ω-hydroxypalmitiate O-feruloyl transferase, HHT)是苯丙烷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化阿魏酰輔酶A生成ω-羥基棕櫚酸和1-伯醇[16]，擬南芥HHT體外試驗證實也會促進(jìn)阿魏酰棕櫚酸和烷基阿魏酸酯的形成[17]。HHT直接或間接影響阿魏酸及其衍生物的表達(dá)，從而影響SPAD和SPPD大分子的結(jié)構(gòu)組成。本試驗通過對‘黃花’梨及其芽變‘綠黃花’梨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)HHT基因在‘黃花’及‘綠黃花’梨果實色澤形成關(guān)鍵期的表達(dá)量存在顯著差異，因此本試驗克隆了‘黃花’及‘綠黃花’梨果皮HHT基因，分析其在果實色澤形成關(guān)鍵期的表達(dá)情況，以期為探討砂梨果皮褐色形成機(jī)理提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

以江蘇省南京市溧水果園‘黃花’及其芽變‘綠黃花’梨盛花后第6、7、8、9周果實為試材，削取果皮，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1總RNA提取及HHT基因克隆采用改良CTAB法提取果皮總RNA[18]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。取1 μg總RNA，利用PrimescriptTMreagent Kit with gDNA Eraser(中國TaKaRa公司生產(chǎn))反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)NCBI上已登錄的白梨(PyrusbretschneideriRehd.)HHT基因序列(XM_009379727)，利用Primer Premier 5設(shè)計1對特異引物，對‘黃花’梨及‘綠黃花’梨HHT基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為HHT-F(5’-TCTCCTTTCCATTCGTCA-3’)和HHT-R(5’-AGCATCAGCAATCTCAGTG-3’)。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包含模板1 μL，引物各0.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，ExTaqDNA聚合酶0.2 μL，用ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94℃ 變性20 s，58 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖膠電泳檢測。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(中國Axygen公司所生產(chǎn))膠回收試劑盒對目的片段回收。與載體pMD19-T連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。選取白色單菌落進(jìn)行PCR檢測，陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2目的基因3’端序列克隆根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果設(shè)計2條正向巢式特異引物3W(5’-ACTTGGTCTAAGCTGTCGTT-3’)和3N(5’-ACTGAGATTGCTGATGCTTT-3’)，反向引物為R16326(5’-GGTGGTAGAGCTCGCAGGACTGCAGCTGACTG-3’)和R16324(5’-AGAGCTCGCAGGACTGCAGCTGACTGACTAC-3’)，利用接頭引物R11466(5’-GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN-3’)以3 μg總RNA為模板合成第一鏈cDNA。PCR擴(kuò)增采用巢式PCR策略，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。第一輪以cDNA為模板，以3W和R16326為上下游引物，第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后作為第二輪PCR模板，以3N和R16324為上下游引物。第一輪/第二輪PCR程序：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 20 s，60/56 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 60 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)克隆后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析借助Clustal X和Mega 5軟件，對所得序列與GenBank中其他物種的HHT基因序列進(jìn)行同源性分析，挑選典型物種進(jìn)行多序列比對，Clustal X生成比對結(jié)果，利用Mega 5對比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用DNAMAN對PpyHHT基因翻譯和氨基酸序列分析，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast和保守結(jié)構(gòu)域分析，Mega 5軟件進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4PpyHHT基因定量PCR分析分別以盛花期后第6至第9周的梨果實總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。根據(jù)已克隆的PpyHHT基因序列設(shè)計1對特異引物CO-F(5’-TCTTGTTCCTTTCTAATGGG-3’)和CO-R(5’-GGGCTCTTTCACCCACTT-3’)。以砂梨Ubiqutin基因為內(nèi)參基因，引物為CO138(5’-GCTCGCAGTGCTCCAGTTCTAC-3’)和CO139(5’-AACATAGGTCAACCCGCACTT-3’)。參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒(中國TaKaRa公司所生產(chǎn))說明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為10 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，0.3 μL上、下游引物，1 μL cDNA，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)。實時熒光定量PCR試驗使用ABI7300 cycler(美國)儀器完成，試驗數(shù)據(jù)由2-ΔΔT公式計算處理，測定樣本均設(shè)3個重復(fù)。

ATG. 起始密碼子；TAG. 終止密碼子；陰影. 保守結(jié)構(gòu)序列圖1　PpyHHT基因的核苷酸序列及氨基酸序列ATG. Start codon; TAG. Stop codon; Shadow. Conserved domain sequenceFig. 1　The nucleotide acid sequence and amino sequence of PpyHHT gene

2結(jié)果與分析

2.1PpyHHT基因克隆與序列分析

用常規(guī)PCR技術(shù)從‘黃花’和‘綠黃花’梨第8周果實果皮中擴(kuò)增得到部分基因片段，測序并在NCBI上進(jìn)行比對分析表明，該片段為PpyHHT基因的部分片段。根據(jù)所得序列設(shè)計3’端特異引物，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增(第一輪引物為3W和R16326，第二輪引物為3N和R16324)，獲得了3’端目的片段。利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行拼接，獲得了包含完整開放閱讀框的核苷酸序列1 599 bp(圖1)，而且‘黃花’和‘綠黃花’cDNA序列完全一致；包括編碼444個氨基酸的編碼區(qū)，264 bp的3’非翻譯區(qū)(圖1)，命名為PpyHHT，提交GenBank，登錄號為KX131155。根據(jù)DNAMAN6.0軟件推測該蛋白分子量是49.91 kD，等電點(diǎn)是4.75。

2.2PpyHHT基因生物信息學(xué)分析

圖2　PpyHHT基因預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig. 2　Conserved domain analysis of prodicted protein of PpyHHT gene

圖3　‘黃花’梨與其他物種 HHT基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3　Phylogenetic tree of the amino acid residues encoded by HHT gene in ‘Huanghua’ pear and other species

利用NCBI蛋白保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(conserved domain database，CDD)對PpyHHT基因編碼蛋白的保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白在11～443氨基酸殘基之間有一個HHT家族結(jié)構(gòu)域(PLN02481，E值0e+00)(圖2)。將PpyHHT基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)PpyHHT與多種植物HHT的相似性在76.6%和98%之間，其中相似性在92%以上的有白梨(Pyrusbretschneideri)、蘋果(Malusdomestica)、梅(Prunusmume)、森林草莓(Fragariavesca)等，且白梨最高達(dá)98%。分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，PpyHHT基因編碼的氨基酸序列具有HHT的2個保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，即HXXXD(第175～179位氨基酸殘基)活性位點(diǎn)和D(N)F(V)GWG(第392～396位氨基酸殘基)活性位點(diǎn)(圖1)，這2個保守區(qū)域為?；D(zhuǎn)移酶所特有，在植物中高度保守[19-21]。

利用Mega 5軟件將這些基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖3可以看出PpyHHT基因編碼的氨基酸與其他近源物種在氨基酸水平上高度同源，與白梨親緣關(guān)系最近，這與氨基酸序列比對結(jié)果一致，表明PpyHHT基因為HHT的同源基因。

2.3在不同發(fā)育時期梨果皮中PpyHHT的表達(dá)

圖4　不同時期‘黃花’梨和‘綠黃花’梨果皮PpyHHT基因表達(dá)量Fig. 4　The relative expression of PpyHHT in the peel of ‘Huanghua’ and‘Lü huanghua’pear at different stages

在所取樣的4個時期，‘黃花’梨PpyHHT基因的表達(dá)量均高于‘綠黃花’梨，在第7周表達(dá)量差異達(dá)到最大，非常有趣的是，此時‘黃花’梨果實褐色開始呈現(xiàn)出來，提示該基因的高表達(dá)可能與果皮褐色形成有關(guān)。在不同時期‘黃花’梨果皮中，第6周和第7周表達(dá)量較高，而第8周和第9周表達(dá)量較低，其中第7周的表達(dá)量約為第8周的4倍，褐色呈現(xiàn)后的第8周和第9周間表達(dá)量相差無幾，究其原因可能是PpyHHT需要與相關(guān)因子協(xié)同作用才能促成褐色前體物質(zhì)的形成，隨著果實色澤的逐漸形成，協(xié)同作用減弱，其含量也逐步減少并趨于穩(wěn)定。PpyHHT基因在‘綠黃花’梨果皮中表達(dá)量在第8周最低，為最高表達(dá)量的0.25倍，表達(dá)量隨果實發(fā)育呈“先減后增”趨勢，這可能是由于在色澤形成關(guān)鍵期相關(guān)物質(zhì)抑制了PpyHHT基因的表達(dá)，至第9周‘黃花’梨果實表皮褐色比較明顯時，‘綠黃花’梨PpyHHT基因的表達(dá)量又增高，這個并沒有促進(jìn)果實形成褐色，最合理的解釋可能是除該酶(基因)外，褐色的形成還需要其他因子的參與。

3討論

本試驗成功從‘黃花’梨和‘綠黃花’梨中克隆到一個含有完整閱讀框的砂梨PpyHHT基因，生物信息學(xué)分析表明，PpyHHT基因編碼的氨基酸序列與薔薇科植物相似性較高(92%以上)，其中白梨最高(98%)，與其他科植物相似度較低(77%左右)。這說明PpyHHT基因?qū)儆谵D(zhuǎn)移酶類基因家族成員，同時也說明不同物種HHT氨基酸的相似度高低與物種之間的親緣關(guān)系相一致。

Lotfy等[16]研究表明HHT促進(jìn)馬鈴薯組織的木栓化，也促進(jìn)木栓質(zhì)前體的形成[22]；木栓化組織的酶解及提取物分析表明阿魏酸及阿魏酸酯是木栓質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)的主要成分[6]，因此，HHT可能是通過促進(jìn)這些主成分的形成而影響木栓質(zhì)的形成的。本研究顯示，‘黃花’梨在果皮色澤形成關(guān)鍵期的HHT表達(dá)量明顯高于‘綠黃花’梨，這就有可能影響木栓質(zhì)成分阿魏酸等的形成，進(jìn)而影響砂梨果皮褐色的形成。

本試驗克隆的2個砂梨品種(系)的PpyHHT基因的cDNA序列完全一致，從這個角度上看，‘黃花’梨的綠皮芽變‘綠黃花’梨性狀出現(xiàn)差異不是該功能基因發(fā)生了突變，但其基因的表達(dá)量和表達(dá)譜存在明顯差異，出現(xiàn)這種情況的原因：一是兩個品種(系)間調(diào)控該基因表達(dá)的調(diào)控因子如轉(zhuǎn)錄因子基因可能發(fā)生了突變。Uauy等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在栽培小麥品種中轉(zhuǎn)錄因子NAM-B1基因由于1個堿基的插入引起移碼突變而喪失功能，導(dǎo)致營養(yǎng)成分的降低；二是該基因位點(diǎn)的啟動子區(qū)域出現(xiàn)了差異。Buzeli等[24]在大豆的研究中發(fā)現(xiàn)啟動子順式元件完整與否調(diào)控著Bip基因的表達(dá)。由此推測，‘黃花’梨及其芽變‘綠黃花’梨PpyHHT基因在轉(zhuǎn)色關(guān)鍵期的差異表達(dá)可能受上述兩個因子的影響，究竟是哪個因子在起作用還需要進(jìn)一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

文章編號:1000-4025(2016)06-1105-05

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1105

收稿日期:2016-03-28;修改稿收到日期:2016-05-05

基金項目:國家自然科學(xué)基金(31272140)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金(CX(14)3009)

作者簡介:呂照清(1990-)，男，在讀碩士研究生，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail:1304971536@qq.com *通信作者:喬玉山，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事果樹生物技術(shù)研究。E-mail:qiaoyushan@njau.edu.cn

中圖分類號:Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Cloning and Expression ofHHTGene in ‘Huanghua’ Pear and Its Bud Mutant ‘Lühuanghua’ Pear (PyruspyrifoliaNakai)

Lü Zhaoqing,REN Dandan,ZHOU He,QIAO Yushan*

(College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Abstract:The study used fruit peel of sand pear (Pyrus pyrifolia Nakai) cultivars ‘Huanghua’ pear (russet fruit) and its bud mutant ‘Lühuanghua’ pear (green fruit) at 8 weeks after full bloom (WAFB) as experiment materials. the cDNA full-length of HHT gene,which was named PpyHHT (GenBank accession No. KX131155), was cloned by conventional and nest PCR techniques. Sequence analysis showed that the full-length of the PpyHHT ortholog consisted of a 1 335 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide containing 444 amino acid residues. The molecular weight of deduced amino acids was 49.91 kD, with an isoelectric point (pI) of 4.75, which had the highest similarity (98%) and closest relationship with that in Pyrus bretschneideri. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) analysis demonstrated that the expression of PpyHHT gene in ‘Huanghua’ and ‘Lühuanghua’ pear peel were changing constantly during the key period (6-9 weeks), and significantly higher in ‘Huanghua’ pear peel than that in ‘Lühuanghua’. PpyHHT gene involved in the formation of sand pear russet/green traits, its expression level differences may play a role in the formation of sand pear skin color.

Key words:Pyrus pyrifolia Nakai; HHT gene; cloning; bioinformatics; gene expression