梁雅珺，于正陽(yáng)，強(qiáng)智全，杜　婭，朱維寧，張大鵬，張林生*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西楊陵712100;2 西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 西安 710069)

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小麥TaDRLea3-2基因的克隆及脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析

梁雅珺1，于正陽(yáng)1，強(qiáng)智全1，杜婭1，朱維寧2，張大鵬1，張林生1*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西楊陵712100;2 西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 西安 710069)

摘要:胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA蛋白) 是植物體中廣泛存在的一類與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的家族蛋白，植物受非生物脅迫會(huì)大量表達(dá)。該研究采用同源克隆技術(shù)，從干旱誘導(dǎo)的小麥品種‘鄭引1號(hào)’ (Triticum aestivum L.)中獲得1個(gè)新的LEA3家族基因( TaDRLea3-2)，該基因全長(zhǎng)668 bp，編碼區(qū)為570 bp，編碼189個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明該蛋白為親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，含有9個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域，為典型的LEA3蛋白，存在3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域，可能定位于細(xì)胞質(zhì)中；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明， TaDRLea3-2基因受干旱、高鹽、低溫誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)也受外源ABA誘導(dǎo)，推測(cè) TaDRLea3-2為ABA依賴型 LEA3基因，以不同機(jī)制參與小麥對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程，為深入分析小麥LEA3家族蛋白的抗逆機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:小麥； TaDRLea3-2；同源克?。恍蛄蟹治?；實(shí)時(shí)定量PCR

植物在自然環(huán)境下生長(zhǎng)常會(huì)受到干旱、鹽漬、低溫、高溫等逆境脅迫的影響，降低產(chǎn)量。為了抵抗和適應(yīng)各種脅迫，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了各種不同的生理生化機(jī)制[1]。當(dāng)植物受到逆境脅迫后，自身會(huì)產(chǎn)生一系列具有保護(hù)功能的蛋白來(lái)維持其正常代謝活動(dòng)，胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins，LEA蛋白)就是其中的一類[2-4]。自Dure等[5]首次在棉花中發(fā)現(xiàn)LEA蛋白以來(lái)，相繼在小麥[6]、大豆[7]、番茄[8]、玉米[9]等幾十種高等植物，以及苔蘚[10]和線蟲[11]中均檢測(cè)到LEA蛋白。LEA蛋白是胚胎發(fā)育后期種子中大量積累的脫水保護(hù)蛋白，是一類親水性蛋白，具有較高的熱穩(wěn)定性，受干旱、低溫、脫落酸(ABA)等逆境信號(hào)的調(diào)節(jié)，可在許多植物的營(yíng)養(yǎng)器官中被誘導(dǎo)而表達(dá)。大多數(shù)LEA蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸殘基，但富含賴氨酸和甘氨酸，無(wú)明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)[12]。根據(jù)LEA蛋白的氨基酸序列同源性和特定的基元序列，可將其分為6族，其中第3族LEA蛋白是當(dāng)前植物逆境分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，受到廣泛重視[13]。

LEA3蛋白含有多拷貝的11個(gè)氨基酸組成的基元序列(TAQAAKEKAGE)。該族LEA蛋白大小差異很大，基元序列的拷貝數(shù)從1個(gè)到幾十個(gè)不等[14-15]。根據(jù)多變的11個(gè)氨基酸重復(fù)基序可將LEA3蛋白分為2個(gè)亞族：3A和3B[16]。在干旱脫水過(guò)程中，LEA3蛋白的11個(gè)氨基酸殘基組成的基元序列可形成兼性α-螺旋結(jié)構(gòu)，在植物脫水時(shí)提供一個(gè)具疏水條區(qū)的親水表面，帶電的親水性表面能夠螯合高濃度的離子，如Na+和PO43-[12]。此外，該族蛋白序列中多數(shù)氨基酸殘基是堿性、親水性氨基酸，無(wú)半胱氨酸和色氨酸。如小麥的PMA2005、棉花的D7、大麥的HVA1和大豆的pGmPM2等均屬于此類LEA蛋白[17-19]。

近年研究表明，LEA3基因的表達(dá)在植物抵御環(huán)境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。俞嘉寧等[20]初步證實(shí)小麥LEA3基因TaLEA3的表達(dá)與所測(cè)品種的耐旱性呈正相關(guān)；Liu等[14]將鷹嘴豆LEA3家族的PM2基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中提高了大腸桿菌的耐鹽性；Xu等[21]將大麥HAV1基因?qū)胙帑?、水稻? 獲得了抗旱、耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。已有的報(bào)道證實(shí)在非生物脅迫下，LEA3基因的大量表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有重要的保護(hù)作用，但是其保護(hù)機(jī)制依然不明確。小麥作為世界上最主要的糧食作物之一，關(guān)于其LEA3家族基因的克隆及其抗逆功能的報(bào)道還不多見(jiàn)。本研究通過(guò)同源克隆，從‘鄭引1號(hào)’小麥中成功克隆了小麥LEA3家族基因TaDRLea3-2，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并研究在不同非生物脅迫下TaDRLea3-2的表達(dá)模式，為深入研究LEA3蛋白在小麥中的抗逆機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

供試小麥品種為‘鄭引1號(hào)’，由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。選取顆粒飽滿的小麥種子用75%酒精消毒2 min, 蒸餾水浸泡6 h，置于培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)條件為：光/暗培養(yǎng)16 h/8 h，晝/夜溫度25 ℃/19 ℃，相對(duì)濕度80%，當(dāng)小麥長(zhǎng)到兩葉一心期時(shí)，分別進(jìn)行干旱(20%PEG6000)、低溫(4 ℃培養(yǎng)箱)、鹽(500 mmol·L-1NaCl 溶液)和外源ABA(100 μmol·L-1ABA溶液)處理。在脅迫處理0、12、24、36、48、60和72 h后剪取葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃。

1.2方法

1.2.1小麥幼苗總RNA提取和TaDRLea3-2基因克隆按照RNAiso Plus試劑(TaKaRa公司)的操作說(shuō)明提取干旱處理48 h后的小麥葉片總RNA，再用TaKaRa公司PrimeScript?RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以合成的第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中大麥NIASHv2076L18基因序列(GenBank登錄號(hào)AK368600)設(shè)計(jì)引物TF(5’- GAGATTTACAGTGATTTCAGTTCGT-3’)和TR(5’-CGACTAAAGGAGATCAAATT-3’)。反應(yīng)體系20 μL，包含cDNA 2 μL，上下游引物各 1 μL，2×EasyTaq?PCR SuperMix 10 μL(北京全式金公司)，滅菌雙蒸水6 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，Takara凝膠回收試劑盒回收純化目的基因。獲得的目的片段與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，利用Amp抗性、藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆菌，提質(zhì)粒做PCR檢測(cè)并測(cè)序。

1.2.2TaDRLea3-2基因的生物信息學(xué)分析運(yùn)用NCBI中ORF Finder查找目的基因的開(kāi)放閱讀框；Premier 5.0軟件將目的基因編碼框翻譯成蛋白質(zhì)；利用DNAMAN軟件對(duì)目的基因序列及蛋白序列進(jìn)行分析；使用MEGA5.1軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并基于ML方法，通過(guò)500次bootstrap檢測(cè)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；運(yùn)用ProtScale工具預(yù)測(cè)親/疏水性；NetPhos軟件對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析；應(yīng)用SignalP 3.0 Server工具進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；PSORT在線分析亞細(xì)胞定位；TMHMM工具預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；并利用SOPMA軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，以及swissmodel軟件對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.3不同脅迫處理下TaDRLea3-2表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR分析按照Trizol試劑(Invitrogen公司)的操作說(shuō)明，提取不同脅迫處理后的小麥葉片總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析。根據(jù)已克隆的TaDLea3-2基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物TaDRLea3-2-F(5’-GAGCGGCAAGCATAAAGTGTAAAGCC-3’)和TaDRLea3-2-R(5’-TGCCAGTTGTTTCGTTGT-3’)，以小麥β-actin為內(nèi)參基因，引物為actin-F(5’-TCCAATCTAGGGATACACGC-3’)和actin-R(5’-TCTTCATTAGATTATCCGTGA-GGTC-3’)。反應(yīng)體系為25 μL，包含模版2 μL，2×SYBR Premix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 20 s，39 個(gè)循環(huán)。獲得的數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件分析。

2結(jié)果與分析

2.1小麥 TaDRLea3-2基因克隆

以cDNA第一鏈為模板，以特異引物TF和TR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，有一大小約為700 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1,A)。將目的片段連接于pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，利用Amp抗性、藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆菌，提質(zhì)粒做PCR檢測(cè)并測(cè)序(圖1,B)。測(cè)序結(jié)果比對(duì)后表明，該基因與其他物種的LEA3基因同源，全長(zhǎng)為668 bp，包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(570 bp)，命名為TaDRLea3-2(GenBank登錄號(hào)為KU198998)。利用DNAMAN分析TaDRLea3-2基因編碼的蛋白序列，結(jié)果表明，TaDRLea3-2基因編碼的蛋白由189個(gè)氨基酸組成，其相對(duì)分子質(zhì)量為19.2 kD，等電點(diǎn)為8.9，該蛋白含有9個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的LEA蛋白第三家族的A亞族成員(圖2)。

M. DNA marker; 1、2. 以小麥cDNA為模板擴(kuò)增目的片段; 3. PCR鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T- TaDRLea3-2圖1　TaDRLea3-2基因PCR電泳結(jié)果M. DNA Marker; 1,2. PCR products of TaDLea3-2 gene; 3. PCR identification of positive plasmid pMD19-T- TaDRLea3-2Fig. 1　Clone and identify of TaDRLea3-2

9個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的保守序列用下畫線和數(shù)字標(biāo)注圖2　TaDRLea3-2基因編碼的氨基酸序列Nine repeating 11-mer amino acid motifs are underlined and numberedFig. 2　The amino acid sequence of TaDRLea3-2

2.2小麥 TaDR L ea3-2基因的序列分析

2.2.1TaDRLea3-2基因系統(tǒng)進(jìn)化的分析運(yùn)用MEGA5.1軟件對(duì)TaDRLea3-2蛋白及幾種植物的LEA蛋白進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，該蛋白N端存在LEA蛋白特有的高度保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。在maximum likelihood方法構(gòu)建的發(fā)育樹(shù)中，該蛋白與旱麥草(Eremopyrumtriticeum)(禾本科)的LEA3蛋白親緣關(guān)系最近，而與雙子葉植物蕪菁(Brassicarapa)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的遺傳距離最遠(yuǎn)(圖4)。

2.2.2TaDRLea3-2基因編碼蛋白的親水性分析用ProtScale預(yù)測(cè)親/疏水性，結(jié)果顯示該蛋白有很強(qiáng)的親水性，在多個(gè)位點(diǎn)形成親水性高峰，并具有一定的周期性(圖5)，有利于形成兼性α-螺旋結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到結(jié)合水分子以保護(hù)細(xì)胞免受水分虧缺時(shí)的傷害[22]。計(jì)算總平均親水性(Grand Average of Hydropathy, GRAVY)值為-0.960，進(jìn)一步表明了該蛋白為親水性蛋白。

2.2.3TaDRLea3-2蛋白的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域分析運(yùn)用SignalP信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件分析顯示，該蛋白不含信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域。同時(shí)利用TMHMM工具分析該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白無(wú)跨膜螺旋區(qū)，為非膜蛋白。

2.2.4TaDRLea3-2蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)分析利用NetPhos軟件分析該蛋白質(zhì)序列潛在的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果表明(圖6)，TaDRLea3-2蛋白有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。

2.2.5TaDRLea3-2蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)利用PSORT軟件對(duì)小麥TaDRLea3-2蛋白進(jìn)行定位，結(jié)果表明，該蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)中的分值最大，其作用場(chǎng)所可能是在細(xì)胞質(zhì)中。

2.2.6小麥TaDRLea3-2基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)SOPMA工具對(duì)小麥TaDRLea3-2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，TaDRLea3-2蛋白的α-螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的比例分別為71.96%、6.35%、4.23%及17.46%，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主(圖7,A)。采用Swissmodel軟件分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖7，B所示, 表明該蛋白的三維結(jié)構(gòu)是以α-螺旋為主的緊湊結(jié)構(gòu)。Woods等[23]研究認(rèn)為在脅迫條件下，LEA3蛋白形成的兩親性α-螺旋可能有利于其行使功能，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

AFO85387. 高粱；ADF36679. 金發(fā)草；NP_001146945. 玉米；NP_001056195. 水稻；AEJ88291; 冰草. BAD22767. 無(wú)芒雀草；ACH89913. 大麥； XP_003567984. 二穗短柄草；AEY78063. 南極發(fā)草；AIZ11400. 旱麥草；TaDRLea3-2. 小麥；ADC55280. 貴州懸竹.；BAB88878. 蕪菁； XP_002891707. 琴葉擬南芥； 黑色框內(nèi)為N端保守區(qū)圖3　小麥TaDRLea3-2蛋白與其他幾種植物L(fēng)EA蛋白的序列比對(duì)AFO85387. Sorghum bicolor； ADF36679. Pogonatherum paniceum； NP_001146945. Zea mays；NP_001056195. Oryza sativa；AEJ88291 . Agropyron cristatum； BAD22767. Bromus inermis；ACH89913. Hordeum vulgare；XP_003567984. Brachypodium distachyon；AEY78063. Deschampsia antarctica; AIZ11400. Eremopyrum triticeum；TaDRLea3-2. Triticum aestivum L.；ADC55280. Ampelocalamus calcareus；BAB88878. Brassica rapa； XP_002891707. Arabidopsis lyrata； The black box for N conservative areaFig. 3　Sequence alignment of wheat TaDRLea3-2 protein and other LEA proteins

圖中各節(jié)點(diǎn)處數(shù)字表示重復(fù)500次Bootstrap值; 標(biāo)尺代表遺傳距離圖4　小麥TaDRLea3-2蛋白及其它植物L(fēng)EA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析The numbers at nodes represent the bootstrap values based on 500 replicates; The scale represents genetic distanceFig. 4　Phylogentic tree of wheat TaDRLea3-2 protein and other LEA proteins

圖5　小麥TaDRLea3-2蛋白的親水/疏水性預(yù)測(cè)Fig. 5　Hydrophilic/hydrophobicity analysis of wheat TaDRLea3-2 protein

2.3實(shí)時(shí)定量PCR分析不同脅迫處理下 TaDRLea3-2表達(dá)情況

利用實(shí)時(shí)定量PCR分析不同脅迫條件下小麥葉片中TaDRLea3-2基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，在干旱脅迫下TaDRLea3-2基因的表達(dá)量持續(xù)增加，在48 h達(dá)到峰值，約為對(duì)照的5.8倍。冷脅迫下TaDRLea3-2基因表達(dá)量增加緩慢，直到60 h才顯著上升達(dá)峰值，而后降低，說(shuō)明TaDRLea3-2基因?qū)Ω珊得{迫較低溫脅迫更敏感，響應(yīng)更強(qiáng)烈。在鹽脅迫及施加外源ABA處理后，TaDRLea3-2基因的表達(dá)量逐漸上調(diào)，分別在72 h及60 h達(dá)到最高(圖8)。推測(cè)TaDRLea3-2基因?qū)儆贏BA依賴型的響應(yīng)高鹽、冷、滲透、干旱脅迫的LEA3基因。

圖6　小麥TaDRLea3-2蛋白的磷酸化位點(diǎn)Fig. 6　Phosphorylation sites of wheat TaDRLea3-2 protein

A. 小麥TaDRLea3-2蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析. 圖中藍(lán)線、紅線、綠線和紫線各代表α-螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲; B. 小麥TaDRLea3-2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖7　小麥TaDRLea3-2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測(cè)示意圖A. Secondary structure of wheat TaDRLea3-2 protein. The blue, red, green and purple lines represent the alpha helix, extended strand, beta turn and random coil, respectively; B. Tertiary structure of wheat TaDRLea3-2protein.Fig. 7　Secondary structure (A) and tertiary structure (B) prediction of wheat TaDRLea3-2 protein

圖8　小麥葉片 TaDRLea3-2基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式Fig. 8　Expression pattern of TaDRLea3-2 in wheat leaves under various abiotic stresses

3討論

植物遭受干旱、低溫等逆境脅迫后會(huì)引起代謝變化和低分子量保護(hù)物質(zhì)的積累，同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)植物其它基因的表達(dá)。LEA基因就是其中之一，其蛋白產(chǎn)物具有較強(qiáng)的親水性，在干旱及其它不良環(huán)境下具有保護(hù)細(xì)胞免受脫水傷害、抗氧化、離子緩沖劑和穩(wěn)定細(xì)胞膜等多種功能。因此對(duì)未知LEA基因的克隆和功能分析對(duì)解析生物細(xì)胞在逆境條件下的可塑性非常重要[24]。

本研究利用同源克隆技術(shù)，從‘鄭引1號(hào)’小麥中獲得了1個(gè)新的LEA3家族基因TaDRLea3-2。其編碼蛋白相對(duì)分子量較小，富含堿性、親水性氨基酸，具有9個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的基元序列，屬于LEA蛋白第3家族A亞族成員。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明TaDRLea3-2蛋白與其他LEA3蛋白結(jié)構(gòu)特征相似，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽序列，可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。第3族LEA蛋白雖有共同的結(jié)構(gòu)特征，但其所含11個(gè)氨基酸基序的拷貝數(shù)相差較大，少則5個(gè)(如棉花的LeaD7)[25], 多則幾十個(gè)(如大豆pGmPM10)[7]，Ingram等[26]對(duì)LEA3蛋白這11個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域分析認(rèn)為，該肽段以α-螺旋形式存在，可以使LEA蛋白間形成二聚體結(jié)構(gòu)。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，在溶解狀態(tài)下LEA3蛋白是高度無(wú)序的，呈無(wú)規(guī)則卷曲狀，而在快速脫水后多以α-螺旋結(jié)構(gòu)存在，緩慢脫水致使其呈α-螺旋和分子間β折疊結(jié)構(gòu)[27]。許多研究還發(fā)現(xiàn)，干旱和復(fù)水條件下，LEA3蛋白結(jié)構(gòu)的無(wú)序化與螺旋化之間的轉(zhuǎn)變有利于其在細(xì)胞中行使多種功能[28]。還有一種假說(shuō)認(rèn)為L(zhǎng)EA3蛋白含有的11個(gè)氨基酸重復(fù)基序可以形成氨基酸鹽橋，穩(wěn)固蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞中的離子強(qiáng)度，從而抵御干旱脅迫對(duì)植物細(xì)胞造成的傷害[13]。但是關(guān)于該保守序列的拷貝數(shù)與抗旱性強(qiáng)弱之間是否存在相關(guān)性還尚無(wú)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，有待后續(xù)深入研究論證。

已有實(shí)驗(yàn)證明第3族LEA蛋白與植物抗旱能力相關(guān)。本研究對(duì)小麥TaDRLea3-2基因的表達(dá)模式分析顯示，在低溫、干旱、高鹽脅迫處理下，該基因表達(dá)均有上調(diào)，表明該基因在小麥中可響應(yīng)多種非生物脅迫，但是該基因?qū)τ诟髅{迫的敏感程度并不一致。在干旱脅迫48 h時(shí)，TaDRLea3-2基因表達(dá)量達(dá)到峰值，約為對(duì)照的5.8倍；在低溫脅迫條件下，TaDRLea3-2基因的表達(dá)量增加緩慢，60 h表達(dá)量最大；鹽脅迫處理后，TaDRLea3-2基因表達(dá)量逐漸上調(diào)，72 h時(shí)為峰值。表明不同逆境條件下，小麥LEA3家族基因TaDRLea3-2的響應(yīng)表達(dá)較為復(fù)雜。植物響應(yīng)非生物脅迫依賴于一系列的信號(hào)途徑，包括ABA依賴型和非ABA依賴型途徑。本研究中獲得的小麥TaDRLea3-2基因在ABA處理小麥幼苗后其表達(dá)量逐漸上升，為ABA依賴型的表達(dá)基因。綜上所述，推測(cè)TaDRLea3-2基因以不同機(jī)制幫助小麥抵御多種逆境脅迫，本研究結(jié)果為小麥耐逆基因功能探討提供了依據(jù)。

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(編輯:宋亞珍)

文章編號(hào):1000-4025(2016)06-1091-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1091

收稿日期:2016-03-31;修改稿收到日期:2016-06-05

基金項(xiàng)目:高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(201202041100 33)；旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助課題(CSBA2015007)

作者簡(jiǎn)介:梁雅珺(1989-)，女，在讀碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail :liangyajun0921@126.com *通信作者:張林生，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物抗逆分子機(jī)理研究。E-mail :linszhang@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Cloning of a New GeneTaDRLea3-2 from Wheat and Its Expression under Different Stresses Treatments

LIANG Yajun1, YU Zhengyang1, QIANG Zhiquan1, DU Ya1, ZHU Weining2,ZHANG Dapeng1, ZHANG Linsheng1*

(1 College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, China； 2 College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China)

Abstract:Late embryogenesis abundant protein(LEA) are a suite of important family proteins found in organisms, which are generally involved in osmoregulation and are expressed abundantly when subjected to environmental stresses. In this study, we isolated a novel LEA3 gene TaDRLea3-2 from wheat‘Zhengyin No.1’. The full length of TaDRLea3-2 is 668 bp, whose ORF is 570 bp, encoding 189 amino acids, and consists of 9 conserved 11-mer repeating motifs; Protein prediction shows that the protein is highly hydrophilic and located in the cytoplasm, with three phosphorylation sites and has no transmembrane domain or signal peptide; Secondary structure analysis shows that the main structure is alpha helix; Homology comparison and regenerating phylogenetic tree were carried out by MEGA5.1. Expression analyses revealed that TaDRLea3-2 gene was induced by drought, low-temperature, high-salt stress and also moreover, can be induced by ABA treatment. These results suggested that TaDRLea3-2 is an ABA-dependent LEA3 gene, participating in the response process of wheat under the abiotic stresses in different mechanisms and can lay a foundation for elucidating LEA3 gene protection mechanism under abiotic stresses in wheat.

Key words:wheat; TaDRLea3-2; homological cloning; sequence analysis; real-time PCR