謝禮洋，劉生財(cái)，白　玉，柳　燕，林　覓，蔡順亮，鄭學(xué)立，謝曉清，馮　新，程春振，陳裕坤，賴鐘雄*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002； 2 福州市蔬菜科學(xué)研究所，福州 350111)

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莧菜甜菜紅素合成相關(guān)基因AmMYB1的克隆及表達(dá)分析

謝禮洋1，劉生財(cái)1，白玉1，柳燕1，林覓1，蔡順亮1，鄭學(xué)立2，謝曉清1，馮新1，程春振1，陳裕坤1，賴鐘雄1*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002； 2 福州市蔬菜科學(xué)研究所，福州 350111)

摘要:應(yīng)用RACE技術(shù)，從‘大紅’莧菜中克隆到1條MYB基因cDNA全長序列，命名為AmMYB1(登錄號為KU557504)。AmMYB1基因開放閱讀框?yàn)?23 bp，可編碼240個氨基酸。其基因組序列與cDNA比對后顯示，AmMYB1基因含有1個內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析表明，AmMYB1具有2個連續(xù)的MYB結(jié)構(gòu)域，是一個典型的R2R3-MYB；同源分析顯示，該基因編碼的氨基酸序列與甜菜紅素相關(guān)BvMYB1的一致性最高，達(dá)到54%。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，AmMYB1蛋白定位于細(xì)胞核。實(shí)時熒光定量PCR分析表明，AmMYB1基因在‘大紅’莧菜葉片紅色部位的表達(dá)量高于綠色部位；在甜菜紅素含量高的葉和莖中表達(dá)量明顯高于根；在光照條件下表達(dá)量高于遮光處理；在紅葉品種中的表達(dá)量高于綠葉品種。研究結(jié)果表明，AmMYB1基因可能是莧菜甜菜紅素合成途徑中重要的正調(diào)控因子。

關(guān)鍵詞:莧菜；甜菜紅素；AmMYB1基因；表達(dá)分析

MYB轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域，每個MYB結(jié)構(gòu)域包含51～52個氨基酸殘基，根據(jù)其含MYB結(jié)構(gòu)域重復(fù)數(shù)目的不同，MYB被劃分為4個亞類，即4R-MYB、3R-MYB、R2R3-MYB和R1-MYB[1-2]。自從玉米中發(fā)現(xiàn)第一個植物MYB轉(zhuǎn)錄因子以來[3]，也已從多種植物中獲得，說明其在植物中廣泛存在，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。R2R3-MYB是植物中數(shù)目最多的MYB轉(zhuǎn)錄因子類型，包含2個MYB結(jié)構(gòu)域，N端具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端具有激活或抑制結(jié)構(gòu)域，具有模式化的結(jié)構(gòu)[4]，已經(jīng)在梨[5]、丹參[6]、甜菜[7]、油菜[8]等多種植物中被鑒定。植物R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子參與了細(xì)胞壁的合成[9]、黃酮醇的合成[10]、木質(zhì)素的合成[11]、花青素的合成[12-13]等眾多生物過程，是目前MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究熱點(diǎn)。

甜菜紅素屬于甜菜色素，是一種水溶性色素，具有抗氧化、消炎、抑菌等作用，在食品、醫(yī)藥及化妝用品等方面被廣泛應(yīng)用[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)，甜菜紅素僅存在于仙人掌科[15]、鹽地堿蓬[16]、莧科[17]、馬齒莧科[18]、藜科[19]、紫茉莉科[20]等不含花青素的部分石竹目植物及一些高等真菌[21]中。甜菜紅素和花青素結(jié)構(gòu)完全不同，但在理化性質(zhì)、影響其合成的環(huán)境因素等方面存在一定的相似之處，他們可能存在相同的調(diào)控因子[22-24]。大量研究證實(shí)[12-13]，R2R3-MYB參與了花青素的合成。最新研究發(fā)現(xiàn)[25]，MYB也參與了甜菜紅素的合成。Hatlestad等[25-26]猜想MYB可能也參與了甜菜紅素的合成并展開試驗(yàn)，獲得了第一個調(diào)控甜菜紅素的MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼基因BvMYB1。研究發(fā)現(xiàn)：該基因編碼一個R2R3類轉(zhuǎn)錄因子，在甜菜和籽粒莧中過量表達(dá)后均能促進(jìn)甜菜紅素的合成；BvMYB1與花青素R2R3-MYB可能具有相同的進(jìn)化起源，但其作用方式異于花青素R2R3-MYB。另外，Hatlestad等發(fā)現(xiàn)，BvMYB1基因在擬南芥中過量表達(dá)后，不能促進(jìn)花青素的合成。目前，關(guān)于甜菜紅素代謝過程的研究集中于代謝路徑中一些關(guān)鍵酶[27-28]，且僅在甜菜中發(fā)現(xiàn)1條參與甜菜紅素代謝的MYB基因[25]，而在其他物種中尚未見到與甜菜紅素代謝相關(guān)MYB基因的研究報(bào)道。

莧菜(AmaranthustricolorL.)是莧科莧屬一年生草本植物，莖和葉富含甜菜紅素[29]，并具有營養(yǎng)價值和藥用價值[30]。莧菜生長快、生物量大和色素含量高，是提取和研究甜菜紅素的重要資源。MYB作為植物中一類家族龐大、功能復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子，在甜菜紅素代謝調(diào)控機(jī)制方面還需要進(jìn)一步探討。本研究對一個甜菜紅素MYB基因進(jìn)行了研究，以期為將來深入探討甜菜紅素代謝的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

莧菜種質(zhì)資源由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所保存。以‘大紅’莧菜、‘RRC 241’、‘RRC 110’、‘Lal Sag’為材料，取樣后用液氮凍存并保存于-80 ℃冰箱用于核酸和甜菜紅素提取。

1.2方法

1.2.1莧菜總RNA、基因組DNA提取及cDNA第一鏈合成采用多糖多酚RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取樣品總RNA。采用植物基因組DNA試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行‘大紅’莧菜基因組DNA的提取。用超微量分光光度計(jì)(Thermo Electron Corp.，USA)檢測DNA及RNA樣品濃度，并用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用GeneRacerTM試劑盒(TaKaRa)將已經(jīng)提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于基因克隆。用 SYBR ExScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將已經(jīng)提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于定量PCR分析。

1.2.2AmMYB1基因克隆以NBCI中登錄的甜菜BvMYB1基因(登錄號JF432080)核苷酸序列作為參考序列，與本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的莧菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(登錄號SRR924089、SRR924090、SRR924091 和 SRR924092)進(jìn)行比對分析，篩選出一條高度一致的cDNA片段(大小為264 bp)。然后根據(jù)該片段分別設(shè)計(jì)2條3’-RACE特異引物和5’-RACE特異引物，結(jié)合GeneRacerTM3’和3’巢式引物及5’和 5’巢式引物，以‘大紅’莧菜cDNA為模板進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，分別擴(kuò)增3’和5’末端序列。DNAMAN對獲得片段進(jìn)行全長拼接，并設(shè)計(jì)拼接驗(yàn)證引物AmMYB1-ORF-F和AmMYB1-ORF-R(表1)，進(jìn)行PCR反應(yīng)以驗(yàn)證拼接結(jié)果的正確性。同時以‘大紅’莧菜基因組DNA為模板，以AmMYB1-ORF-F和AmMYB1-ORF-R(表1)為引物，PCR擴(kuò)增該基因DNA序列。以上引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系參照LA Taq酶(TaKaRa)說明書配制。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 變性30 s，55～59 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將獲得的目的片段切膠回收，TA克隆后挑取陽性克隆搖菌，然后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，將有目的條帶的菌液送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。

1.2.3洋蔥亞細(xì)胞定位采用DNAMAN6.0軟件對已經(jīng)獲得的CDS序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析，設(shè)計(jì)分別帶酶切位點(diǎn)BglⅡ和SpeⅠ的上下游引物AmMYB1-1302-F和AmMYB1-1302-R(表1)，通過PCR方法獲得帶酶切位點(diǎn)的目標(biāo)序列。將PCR產(chǎn)物連入1 302質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在含卡那霉素(50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆子，PCR鑒定和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性，同時送鉑尚公司進(jìn)行測序。采用凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入EHA105 農(nóng)桿菌，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染洋蔥表皮進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察。

1.2.4生物信息學(xué)分析使用ExPASy Protparam 預(yù)測編碼蛋白的理化性質(zhì)；使用PORT預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位；使用Signal P 3.0 Server預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽；使用NetPhos 2.0預(yù)測蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；使用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行序列拼接及比對，利用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。使用MEGA 5.1軟件中的Neighbor-Joining(NJ法)構(gòu)建MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用GeneStucture Display Server在線軟件(http：//gsds.pku.edu.cn/)分析基因的結(jié)構(gòu)。

1.2.5qRT-PCR分析以EFL1為內(nèi)標(biāo)基因(定量引物EFL1-F和EFL1-R見表1)，采用羅氏LightCycler 480儀器，通過qRT-PCR檢測AmMYB1基因在‘大紅’莧菜葉片的紅色部位和綠色部位、不同組織部位、不同光照處理和不同品種的表達(dá)情況。根據(jù)熒光引物設(shè)計(jì)的原則，在獲得AmMYB1基因全長的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異引物RTAmMYB1-F和RTAmMYB1-R(表1)。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 15 s，45個循環(huán)。使用‘Lal Sag’和‘RRC241’cDNA樣本混合物進(jìn)行3倍梯度系列稀釋，分別對AmMYB1基因和內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定引物特異性和擴(kuò)增效率。以不同處理cDNA 10倍稀釋液為模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1　引物序列

注：劃線部分為酶切位點(diǎn)

Note:The underlined section show restriction enzyme digestion sites

1.2.6甜菜紅素的提取、測定稱取0.05 g液氮研磨的莧菜組織粉末，加入1 mL 75% 甲醇，劇烈震蕩混勻，4 ℃放置30 min，10 000 r/min 離心10 min，棄上清，用雙蒸水重懸沉淀，4 ℃30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清水相，用紫外可見分光光度計(jì)(UV-900，上海元析儀器有限公司)測定其在538 nm下吸光值。根據(jù)甜菜紅素的摩爾消光系數(shù)5.66×104計(jì)算甜菜紅素的含量[40]。

2結(jié)果與分析

2.1莧菜AmMYB1基因克隆與生物信息學(xué)分析

以‘大紅’莧菜cDNA為模板，AmMYB1-3’SP1和AmMYB1-3’SP2為特異引物，經(jīng)3’-RACE巢式PCR擴(kuò)增，電泳檢測獲得1條約600 bp條帶(圖1，A)；以AmMYB1-5’SP1和AmMYB1-5’SP2為特異引物，經(jīng)5’-RACE擴(kuò)增，電泳檢測顯示獲得1條約300 bp條帶(圖1，B)，測序結(jié)果表明，這2個片段分別為600 bp和317bp。將獲得的5’-RACE末端、3’-RACE末端和轉(zhuǎn)錄組中已知的264 bp中間片段進(jìn)行拼接，共得到985 bp cDNA全長。根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)AmMYB1-ORF-F及AmMYB1-ORF-R引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證拼接結(jié)果正確性，結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到 723 bp單一條帶(圖1，C)，測序結(jié)果表明與拼接結(jié)果一致，將該序列命名為AmMYB1，登錄號為KU557504。以‘大紅’莧菜gDNA為模板，AmMYB1-ORF-F和AmMYB1-ORF-R為引物擴(kuò)增獲得828 bp目標(biāo)條帶(圖1，D)。將獲得的MYB基因cDNA序列與gDNA序列進(jìn)行在線比對，結(jié)果顯示該基因含有1個內(nèi)含子和2個外顯子(圖2)。

軟件分析表明AmMYB1基因ORF區(qū)長度為723 bp，編碼240個氨基酸(圖3)。應(yīng)用Protparam分析其理化性質(zhì)顯示，該蛋白分子式為C1213H1916N342O369S9，相對分子質(zhì)量為27 483.1 Da，等電點(diǎn)為6.33，屬于酸性蛋白。Signal P3.0 Server信號肽預(yù)測結(jié)果表明AmMYB1無信號肽。InterPro數(shù)據(jù)庫鑒定結(jié)果顯示，AmMYB1編碼的氨基酸序列具有2個典型的MYB-DNA結(jié)構(gòu)域，這表明AmMYB1編碼1個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。

2.2AmMYB1氨基酸序列比對及進(jìn)化樹分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性分析顯示AmMYB1編碼的氨基酸序列與甜菜BvMYB1編碼的氨基酸序列一致性最高，達(dá)到54%。將AmMYB1編碼的氨基酸序列與甜菜BvMYB1及花青素相關(guān)R2R3-MYB基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果顯示AmMYB1與甜菜BvMYB1在R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在bHLH基序。該基序與花青素R2R3-MYB中bHLH基序并不完全一致，存在一些差異的氨基酸殘基?；ㄇ嗨豏2R3-MYB基因編碼的氨基酸序列在C端有(A/S)NDV(I)基序，而AmMYB1該處為INDV(I)，與BvMYB1一致(圖4)。

圖2　AmMYB1的基因結(jié)構(gòu)Fig. 2　Genomic structure of AmMYB1 gene

A. 3’-RACE；B. 5’-RACE；C. cDNA；D. gDNA；M. DL2000；箭頭所指為目標(biāo)條帶圖1　AmMYB1基因的PCR擴(kuò)增A. 3’-RACE；B. 5’-RACE；C. cDNA；D. gDNA ；M. DL2000；Arrows show the target bandsFig. 1　PCR amplification of AmMYB1

直線部分表示R2結(jié)構(gòu)域；虛線部分表示R3結(jié)構(gòu)域；ATG為啟始密碼子；TGA為終止密碼子圖3　AmMYB1基因的核苷酸序列和推測的氨基酸序列The section underlined by straight line represents the R2 domain；the section underlined by break line represents the R3 domain；ATG presents initiation codon；TGA presents stop codonFig. 3　cDNA sequence and deduced amino acid sequence of AmMYB1

BvMYB1(M1ETK3.1)為甜菜MYB氨基酸序列；PAP1(NP_176057.1)、AtMYB90(NP_176813.1)、AtMYB113(NP_176811.1)、AtMYB114(NP_176812.1)為擬南芥MYB氨基酸序列；方框內(nèi)為bHLH基序圖4　植物R2R3-MYB氨基酸序列比對BvMYB1 represents amino acid sequence of MYB from Beta vulgaris；PAP1 (NP_176057.1)，AtMYB90 (NP_176813.1)，AtMYB113 (NP_176811.1)，AtMYB114 (NP_176812.1) represent amino acid sequences of MYB from Arabidopsis thaliana；The box section shows bHLH motifFig. 4　Alignment of amino acid sequence of MYB in plants

圖5　植物R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹分析Fig. 5　Multiple alignment of deduced amino acid sequences of AmMYB1 and other R2R3-MYB transcription factors

圓點(diǎn)為甜菜BvMYB1及本研究中的AmMYB1，其它比對序列均為擬南芥R2R3-MYB；橢圓為擬南芥R2R3-MYB分類中的第六亞族圖6　AmMYB1與擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系The dot points indicate BvMYB1 of Beta vulgaris and AmMYB1，others are R2R3-MYB from A. thaliana；Ellipse shows Arabidops MYB family subgroup 6Fig. 6　Phylogenetic tree comparing the amino acid sequence of AmMYB1 and A. thaliana R2R3-MYB family transcription factors

莧菜AmMYB1與來自不同植物的R2R3-MYB的進(jìn)化分析結(jié)果表明AmMYB1與BvMYB1的進(jìn)化關(guān)系最近；AmMYB1與花青素R2R3-MYB聚為一類，而黃酮醇及原花青素R2R3-MYB單獨(dú)聚為一類(圖5)。為了進(jìn)一步推測AmMYB1的潛在功能，構(gòu)建了AmMYB1及甜菜BvMYB1與擬南芥R2R3-MYB的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果表明AmMYB1和BvMYB1均與擬南芥中第六亞族聚為一類，該族的成員AtMYB113、AtMYB114、PAP1、AtMYB90均參與調(diào)控花青素合成，屬于R2R3-MYB。以上結(jié)果說明AmMYB1不僅與BvMYB1有共同的進(jìn)化起源，也與調(diào)控花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB具有共同的進(jìn)化起源。

A、D為GFP蛋白的綠色熒光激發(fā)圖像；B、E為明場圖；C、F為疊加圖圖7　1302-AmMYB1-GFP 蛋白在洋蔥中的亞細(xì)胞定位A and D image present the green fluorescence of GFP；B and E image present outlook of onion cell under bright field；C and F image present the merged imagesFig. 7　1302-AmMYB1-GFP fusion protein localized in the nuclei of the onion epidermal cells

A. ‘大紅’莧菜葉片；B. 光照處理(左)和遮光處理(右)的7日齡‘大紅’莧菜幼苗；C1～C3. ‘RRC 241’、 ‘RRC 110’和‘Lal Sag’圖8　本試驗(yàn)所用莧菜材料A.Leaves of ‘Dahong’ Amranth；B. 7-day-old ‘Dahong’Amaranth seedlings with normal light (left) and dark (right) treatments；C1-C3. RRC 241’，‘RRC 110’ and ‘ Lal Sag’Fig. 8　Amaranth materials used in this study

2.3莧菜AmMYB1的亞細(xì)胞定位

PORT亞細(xì)胞預(yù)測結(jié)果表明AmMYB1可能定位于細(xì)胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位特征。利用洋蔥表皮的瞬時表達(dá)對AmMYB1基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明該基因定位在細(xì)胞核，與預(yù)測的結(jié)果一致(圖7)。

2.4莧菜葉片紅色和綠色部位甜菜紅素含量和AmMYB1表達(dá)分析

對莧菜葉片不同部位中甜菜紅素含量的分析顯示，紅葉部位的甜菜紅素含量很高，與綠葉部位甜菜紅素含量差異達(dá)到極顯著水平(圖9)。通過熒光定量分析AmMYB1基因在莧菜葉片紅色部位和綠色部位的定量表達(dá)情況，結(jié)果表明，AmMYB1在這2個部位中均有表達(dá)(圖9)，但在紅色部分的表達(dá)量是綠色部分的20多倍，二者之間差異顯著，且達(dá)到極顯著水平。AmMYB1基因在莧菜葉片不同部位表達(dá)量的變化趨勢與莧菜甜菜紅素的含量變化趨勢一致，這說明AmMYB1基因在葉片紅色部位高表達(dá)可能有利于甜菜紅素的合成。

** 表示差異極顯著(P<0.01)圖9　紅葉部位和綠葉部位甜菜紅素含量和AmMYB1表達(dá)量差異 ** indicate significant difference among samples at 0.01 levelFig. 9　Differences of betalain contents and AmMYB1 expression levels between the red part leaf and the green part leaf

2.5不同器官中甜菜紅素含量和AmMYB1表達(dá)分析

對莧菜不同組織部位甜菜紅素含量的分析結(jié)果顯示，葉中甜菜紅素含量最高；莖中次之；根中最低，與莖中甜菜紅素含量具有顯著差異，而與葉中甜菜紅素含量的差異達(dá)到極顯著水平。采用實(shí)時熒光定量分析AmMYB1在莧菜不同器官(根、莖、葉)的表達(dá)模式。結(jié)果表明AmMYB1在莧菜的根、莖和葉中均有表達(dá)。AmMYB1表達(dá)量在葉中最高；在莖中次之；在根中表達(dá)量最低，與莖中表達(dá)量具有顯著差異，與葉中表達(dá)量的差異達(dá)到極顯著水平。AmMYB1在莧菜不同器官(根、莖、葉)表達(dá)量的變化趨勢與莧菜紅素的含量變化是一致的(圖10)。

2.6莧菜幼苗不同光照處理下甜菜紅素含量和AmMYB1表達(dá)分析

莧菜幼苗在不同光照處理下甜菜紅素含量分析表明，光照處理促進(jìn)莧菜幼苗甜菜紅素的合成，遮光處理抑制莧菜幼苗甜菜紅素的合成(圖8，B)，因此，光照處理莧菜幼苗甜菜紅素的含量高于遮光處理莧菜幼苗甜菜紅素的含量(圖11)，差異達(dá)到極顯著水平。實(shí)時熒光定量分析AmMYB1基因在光照處理和黑暗處理的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)AmMYB1的表達(dá)量在光照處理中上調(diào)，遮光處理中下調(diào)，光照處理AmMYB1表達(dá)量是遮光處理表達(dá)量的5.7倍，二者之間差異達(dá)到極顯著水平。在遮光和光照處理中，莧菜AmMYB1表達(dá)量變化趨勢與其甜菜紅素合成變化趨勢相似(圖11)。推測光可能通過誘導(dǎo)AmMYB1的表達(dá)調(diào)控甜菜紅素的合成。

*和**分別表示在0.05和0.01水平差異顯著；下同圖10　莧菜不同器官中甜菜紅素含量和AmMYB1表達(dá)量差異* and ** indicate significant difference among samples at 0.05 and 0.01 level, respectively; The same as belowFig. 10　Differences of betalain contents and AmMYB1 expression levels in different organs

圖11　光照和遮光處理對甜菜紅素含量和AmMYB1表達(dá)的影響Fig. 11　Effects of light and dark treatments on betalain contents and AmMYB1 expression

圖12　不同莧菜品種中甜菜紅素含量和AmMYB1表達(dá)量差異Fig. 12　Differences of betalain contents and AmMYB1 expression levels in different Amaranth cultivars

2.7不同莧菜品種中甜菜紅素含量和AmMYB1表達(dá)分析

‘RRC241’和‘RRC110’2個莧菜品種在整個生長發(fā)育過程中葉片全為綠色(圖8，C1和C2)，甜菜紅素含量極低(圖12)；而‘Lal Sag’在整個生長發(fā)育過程中葉片全紅(圖8，C3)，富含甜菜紅素(圖12)。采用實(shí)時熒光定量分析AmMYB1基因在莧菜葉片全綠品種(‘RRC241’和‘RRC110’)和莧菜葉片全紅品種的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AmMYB1在葉片全紅的品種(‘Lal Sag’)的表達(dá)量高于在葉片全綠的品種(‘RRC241’和‘RRC110’)，差異極顯著。AmMYB1在這3個不同品種的表達(dá)量變化趨勢與各品種中的甜菜紅素含量變化趨勢呈正相關(guān)(圖12)，說明AmMYB1可能與莧菜甜菜紅素合成密切相關(guān)。

3討論

3.1AmMYB1與花青素R2R3-MYB的作用方式可能不同，但二者可能具有相同的進(jìn)化起源

Hatlestad等[26]發(fā)現(xiàn)BvMYB1調(diào)控甜菜紅素的合成，但BvMYB1與花青素MYB對色素的作用方式并不相同。花青素R2R3-MYB通過與bHLH、WD40互作方式調(diào)控花青素合成，在R3結(jié)構(gòu)內(nèi)含有一個與bHLH蛋白互作的(D/E)Lx2(R/K)x3Lx6Lx3R基序[31-32]。然而，BvMYB1由于bHLH基序位點(diǎn)的突變，并不能與bHLH互作[26]。本試驗(yàn)通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，AmMYB1在R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在bHLH基序，但其基序內(nèi)的一些結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，該情況同BvMYB1相似；花青素R2R3-MYB基因編碼的氨基酸序列在C端有(A/S)NDV(I)基序，而AmMYB1與BvMYB1在該處為INDV(I)。推測，AmMYB1與花青素R2R3-MYB的作用方式可能不同。AmMYB1可能由于bHLH基序中結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，不能與bHLH互作。

甜菜紅素BvMYB1與花青素R2R3-MYB具有相同的進(jìn)化起源[26]。R2R3-MYB調(diào)控花青素合成[33]，在擬南芥中已經(jīng)分離出多個調(diào)控黃酮類編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因[34]。AtMYB90/PAP2、AtMYB75/PAP1、AtMYB113、AtMYB114調(diào)控花青素的合成[32]，它們屬于擬南芥的第六類亞族；AtMYB11/PFG2、AtMYB12/PFG1、AtMYB111/PFG3調(diào)控黃酮醇合成[35]，屬于擬南芥第七亞族；AtMYB123/TT2參與原花青素的合成[36]，屬于擬南芥第五亞族。本試驗(yàn)通過分析AmMYB1與花青素、黃酮醇及原花青素R2R3-MYB的進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn)：AmMYB1與花青素R2R3-MYB進(jìn)化關(guān)系最近，這與 Hatlestad等的結(jié)果相似。同時分析了AmMYB1與擬南芥R2R3-MYB的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AmMYB1與擬南芥的第六類亞族進(jìn)化關(guān)系最近，說明AmMYB1可能與花青素R2R3-MYB具有相同的進(jìn)化起源。

另外，利用洋蔥表皮的瞬時表達(dá)對AmMYB1進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明AmMYB1定位在細(xì)胞核，該結(jié)果符合MYB轉(zhuǎn)錄因子的特征。

3.2AmMYB1在甜菜紅素的合成中可能具有重要的正向調(diào)控作用

BvMYB1在富含甜菜紅素的品種中具有優(yōu)勢表達(dá)[26]?；ㄇ嗨豏2R3-MYB也具有類似的表達(dá)特性，它們在花青素含量豐富的組織及品種中表達(dá)量大，如百合中的LhMYB6[37]、小麥TaMYB3-4D[38]、荔枝LcMYB1[39]等；TaMYB3-4D主要在含花青素的種皮和胚芽鞘表達(dá)；LcMYB1在花青素含量高的品種中表達(dá)量高。本研究發(fā)現(xiàn)AmMYB1在富含甜菜紅素的同一葉片的紅葉部位、器官(莖和葉)、品種中表達(dá)量很高，而在甜菜紅素含量低的綠葉部分、根、葉片為全綠品種的表達(dá)量很低，該結(jié)果與BvMYB1及花青素R2R3-MYB表達(dá)特性相似。光是影響甜菜紅素的重要因子[40-41]。Wohlpart等[42]發(fā)現(xiàn)甜菜紅素的合成離不開光，在光照處理下甜菜紅素的含量是黑暗處理的5倍。本研究發(fā)現(xiàn)，光照處理下甜菜紅素含量高于遮光處理甜菜紅素含量，與Wohlpart等的結(jié)果一致，且AmMYB1對光響應(yīng)變化與甜菜紅素含量變化趨勢一致。光可能調(diào)控了AmMYB1 參與甜菜紅素的合成。由此推測，AmMYB1在甜菜紅素的合成中可能具有重要的正向調(diào)控作用。

甜菜紅素代謝路徑復(fù)雜，因此，甜菜紅素代謝路徑的調(diào)控因子及相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。AmMYB1具體生物學(xué)功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證，為了深入揭示該基因在甜菜紅素合成中的作用，后續(xù)將繼續(xù)驗(yàn)證該基因的功能。

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(編輯:宋亞珍)

文章編號:1000-4025(2016)06-1080-11

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1080

收稿日期:2016-03-31;修改稿收到日期:2016-06-04

基金項(xiàng)目:福建省重大科技專項(xiàng)(2015NZ0002)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)新教師類科研基金(20123515120009)；福建省自然科學(xué)基金(2013j05045)；福建省教育廳a類項(xiàng)目(jal2098)

作者簡介:謝禮洋(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事蔬菜育種及生物技術(shù)研究。E-mail：2607215609@qq.com *通信作者:賴鐘雄，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事園藝植物生物技術(shù)與遺傳資源研究。E-mail：laizx01@163.com

中圖分類號:Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Cloning and Expression Analysis of Betalain-related Transcription Factor GeneAmMYB1 inAmaranthustricolorL.

XIE Liyang1，LIU Shengcai1，BAI Yu1，LIU Yan1，LIN Mi1，CAI Shunliang1，ZHENG Xueli2，XIE Xiaoqing1，F(xiàn)ENG Xin1，CHENG Chunzhen1，CHEN Yukun1，LAI Zhongxiong1*

(1 Institute of Horticultural Biotechnology，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China； 2 Institute of Vegetable Science of Fuzhou, Fuzhou 350111，China )

Abstract:RACE method was used to obtain the complete cDNA sequence of AmMYB1 (Genbank accession No. KU557504) from ‘Dahong’ amararanth (Amaranthus tricolor L.)，which belong to MYB gene . The AmMYB1 gene contains an open reading frame of 723 bp that encodes 240 amino acids. Comparison between the cDNA and genomic DNA sequences showed that AmMYB1 gene contains one intron. Bioinformatical analysis revealed that AmMYB1 is a typical R2R3-MYB containing two consecutive MYB domains.Blast X analysis showed that AmMYB1 is relatively close to betalain biosynthesis-related BvMYB1，with an identity of 54% .Subcellular localization analysis revealed that the AmMYB1 protein was located in the nucleus. Quantitative real time PCR results showed that the expression level of AmMYB1 was significantly higher in the red part of leaves than that in the green part，and was also higher in the leaves and stems with high betalain concentrations than that in the roots. The expression of AmMYB1 was obviously increased when exposure to light. AmMYB1 was found to be highly expressed in the red leaf variety compared with the green leaf variety. Therefore，the AmMYB1 may play positive roles in regulating betalain biosynthesis in Amaranthus.

Key words:Amaranthus tricolor L.; betalain；AmMYB1 gene；expression analysis