葉小齊, 吳　明, 邵學(xué)新, 李長明

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江杭州灣濕地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站, 浙江 富陽 311400)

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蘆葦葉水提物的化感活性分析及潛在化感成分的篩選

葉小齊, 吳明①, 邵學(xué)新, 李長明

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江杭州灣濕地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站, 浙江 富陽 311400)

摘要:采用不同溶劑對蘆葦〔Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud.〕葉片水提物進(jìn)行萃取，并以小麥(Triticum aestivum Linn.)和蘿卜(Raphanus sativus Linn.)種子為實(shí)驗(yàn)材料對不同萃取物的化感效應(yīng)進(jìn)行檢測；采用薄層層析和柱層析對抑制作用最強(qiáng)的正丁醇萃取物進(jìn)行進(jìn)一步分離，并采用GC-MS法對生物活性較高的組分進(jìn)行組成成分分析；在此基礎(chǔ)上，選擇相對含量高并具有代表性的潛在化感成分進(jìn)行生物活性檢測，以期篩選出蘆葦葉中的潛在化感成分。結(jié)果顯示：隨質(zhì)量濃度(20、100和500 mg·L-1)提高，蘆葦葉水提物的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物對小麥和蘿卜種子萌發(fā)的抑制作用均逐漸增強(qiáng)，其中正丁醇萃取物的抑制作用最強(qiáng)。在正丁醇萃取物的11個(gè)組分中，F(xiàn)r. 5、Fr. 6、Fr. 7、Fr. 9和Fr. 10組分均能顯著抑制蘿卜或小麥幼苗的生長，經(jīng)質(zhì)量濃度500 mg·L-1各組分處理液處理后蘿卜或小麥幼苗的株高、根長及單株鮮質(zhì)量均顯著低于對照(P<0.05)。采用GC-MS法從Fr. 5、Fr. 6、Fr. 7、Fr. 9和Fr. 10組分中分別鑒定出11、15、15、12和22種成分，分別占各組分總相對含量的83.02%、91.31%、87.36%、97.92%和94.34%，主要成分包括糖類、醇類、有機(jī)酸類、酮類、酰胺類和酯類。對14種潛在化感成分生物活性的檢測結(jié)果顯示這些成分對小麥幼苗生長有明顯的抑制作用，其中，經(jīng)質(zhì)量濃度20 mg·L-1油酸酰胺、棕櫚酸甲酯、亞油酸、2-苯乙胺、2-甲基烯丙醇和4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸處理后，小麥幼苗的株高、根長及單株鮮質(zhì)量顯著低于對照。綜合分析結(jié)果顯示：蘆葦葉水提物具有較強(qiáng)的化感活性，其潛在的化感成分為油酸酰胺、棕櫚酸甲酯、亞油酸、2-苯乙胺、2-甲基烯丙醇和4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸。

關(guān)鍵詞：蘆葦葉; 水提物; 化感成分; 生物檢測; GC-MS

化感作用是植物種間相互作用的重要方式[1]。目前國內(nèi)對陸生植物化感作用的研究集中于主要經(jīng)濟(jì)作物連作障礙[2]及其與雜草之間的相互化感作用[3-4]，以及外來入侵植物對本土植物及農(nóng)作物的化感作用[5-6]等方面，而有關(guān)自然群落中的野生植物間化感作用的研究較少?；凶饔脤τ谥参锶郝溲萏婢哂兄匾纳鷳B(tài)學(xué)意義[7]，因此研究自然群落中本土植物間的化感作用有助于深入了解植物群落的結(jié)構(gòu)和功能。

蘆葦〔Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.〕是濕地常見植物，其化感潛力較強(qiáng)，對加拿大一枝黃花(SolidagoCanadensisLinn.)、互花米草(SpartinaalternifloraLois.)和虉草(PhalarisarundinaceaLinn.)等植物均有不同程度的化感作用[6,8-11]，具有抑制外來入侵植物擴(kuò)散的化感潛力[6]。作者前期的研究結(jié)果顯示：蘆葦具有較高的化感潛力，其水浸液能顯著影響伴生植物的種子萌發(fā)和幼苗生長。目前，已有研究者從蘆葦中分離鑒定出一些化感成分[8-9,12]，但對化感成分的分離和鑒定研究尚缺乏系統(tǒng)性。

為此，作者采用蒸餾水浸提和不同極性有機(jī)溶劑萃取相結(jié)合的方法獲得蘆葦葉中化感組分，初步篩選出生物活性高的萃取組分；在此基礎(chǔ)上，采用硅膠柱層析進(jìn)一步分離化感組分，并利用生物測試方法從中篩選出化感活性最強(qiáng)的組分，利用GC-MS法對其中所含的化合物進(jìn)行鑒定，初步確定蘆葦?shù)闹饕谐煞?，并對這些化合物的生物活性進(jìn)行驗(yàn)證，以明確蘆葦所含的化感成分，為深入研究蘆葦?shù)幕袡C(jī)制以及探討化感作用對蘆葦群落結(jié)構(gòu)和功能形成的影響提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

于2013年8月份，在杭州灣國家濕地公園生態(tài)保育區(qū)(東經(jīng)121°08′43″、北緯30°18′40″)選擇株高1.4～1.8 m 的蘆葦50株，采集植株頂端往下第3至第5枚健康葉，將所有葉片自然陰干后粉碎，備用。生物測試材料為小麥(TriticumaestivumLinn.)和蘿卜(RaphanussativusLinn.)的種子。

1.2方法

1.2.1化感物質(zhì)的初步提取和生物活性測定 稱取上述蘆葦葉粉末樣品1.55 kg，加入15.5 L蒸餾水，即料液比為1∶10(m∶V)，于常溫下浸泡24 h，間歇攪拌；經(jīng)4層紗布過濾后得到水浸提液約9 L，置于4 ℃冷藏備用。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低溫減壓條件下(50 ℃，-0.09 MPa)將水浸提液濃縮至約0.4 L，依次用等體積的石油醚、 二氯甲烷、 乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，同一溶劑的3次萃取液合并后減壓濃縮至少量，并自然揮干溶劑，稱取質(zhì)量，記錄獲得量。取4種溶劑萃取物和水相的浸膏，分別溶于相應(yīng)的有機(jī)溶劑或蒸餾水中，配制成質(zhì)量濃度500 mg·L-1的母液，置于4 ℃冷藏備用。

生物測試前，預(yù)先用質(zhì)量濃度0.3 g·L-1H2O2溶液將小麥和蘿卜種子浸泡消毒5 min，并用蒸餾水反復(fù)清洗后供試；在培養(yǎng)皿中墊入2層定性濾紙，排入10粒小麥或蘿卜種子；將上述各溶劑母液用相應(yīng)溶劑分別配制成質(zhì)量濃度20和100 mg·L-1的處理液，每培養(yǎng)皿各加入處理液5 mL，對照則加入同體積甲醇。用保鮮膜將培養(yǎng)皿封口，置于培養(yǎng)箱中，所有培養(yǎng)皿隨機(jī)排列，培養(yǎng)條件為晝溫25 ℃、夜溫20 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、空氣相對濕度75%。各處理均重復(fù)3次。培養(yǎng)72 h后，分別統(tǒng)計(jì)和測量各處理的種子萌發(fā)率及所有幼苗的根長、株高和單株鮮質(zhì)量。幼苗的根長和株高用直尺(精度1 mm)測量，其中，根長為胚根長度，株高為莖基部到頂端芽的長度；單株鮮質(zhì)量采用電子天平(精度0.001 g)稱量。

1.2.2正丁醇萃取物的分離和生物活性測定 根據(jù)上述生物測試結(jié)果，選擇生物活性最強(qiáng)的正丁醇萃取物，用薄層層析法(TLC)及硅膠柱(硅膠200～300目，層析柱規(guī)格25 mm×300 mm)層析對活性成分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，并用V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)= 100∶0～0∶100混合液梯度洗脫，共收集到100個(gè)流分。對各流分進(jìn)行TLC檢測，展開劑分別為V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=99∶1、V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=95∶5和V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=90∶10的混合液，碘熏顯色；將相近流分合并，共合并為11個(gè)組分；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，稱取質(zhì)量。然后用甲醇將各組分的浸膏配制成質(zhì)量濃度500 mg·L-1的處理溶液，以甲醇為對照，按照上述方法進(jìn)行生物活性測試。

1.2.3活性組分的GC-MS分析 根據(jù)上述測定結(jié)果，采用GC-MS法對化感活性高的組分進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)鑒定。色譜條件為：6890N-5975B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為氦氣，純度大于等于99.99%；進(jìn)樣量1 μL。升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持 2 min； 10 ℃·min-1升溫至160 ℃， 保持1 min； 5 ℃·min-1升溫至235 ℃，保持1 min；30 ℃·min-1升溫至280 ℃，保持5 min，共35.5 min。

將GC-MS分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)譜圖集(NIST08版)核對，然后人工進(jìn)行譜圖解析并查對有關(guān)資料，最后對基峰、質(zhì)荷比及相對豐度等進(jìn)行直觀比較、分析和鑒定，確認(rèn)各組分的主要組成成分。

1.2.4潛在化感物質(zhì)生物活性測定 根據(jù)GC-MS分析結(jié)果，選擇相對含量高并具有代表性(已有報(bào)道顯示具有化感活性)的潛在化感成分，即1,2,3,4-丁四醇(1,2,3,4-butanetetrol)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)、油酸酰胺(oleamide)、三縮四乙二醇(tetraethylene glycol)、4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸(DL-4-hydroxy-3-methoxy mandelic acid)、D-(-)-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯〔D-(-)-gulonic acidγ-lactone〕、D-來蘇糖(D-lyxose)、棕櫚酸甲酯(methyl hexadecanoate)、油酸(oleic acid)、2-苯乙胺(2-phenethylamine)、N,N-二乙基乙酰胺(N,N-diethyl-acetamide,)、N,N-二乙基甲酰胺(N,N-diethyl-formamide)、亞油酸〔(Z,Z)-9,12-octadecadienoic acid〕和2-甲基烯丙醇(2-methyl-2-propen-1-ol)共14個(gè)成分，用外源化合物替代相應(yīng)的潛在化感成分，用甲醇配制成質(zhì)量濃度20 mg·L-1處理溶液；以小麥為受體，以甲醇作為對照，采用上述方法進(jìn)行生物活性測試。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

按照公式“抑制率=〔(處理組-對照組)/對照組〕×100%”計(jì)算各組分或各化感成分對小麥或蘿卜種子萌發(fā)或幼苗生長指標(biāo)的抑制率。按照公式“化感效應(yīng)=〔(種子萌發(fā)率抑制率+根長抑制率+株高抑制率+單株鮮質(zhì)量抑制率)/4〕×100%”[13]計(jì)算同一質(zhì)量濃度處理組對同一受體各指標(biāo)的化感效應(yīng)。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，分析不同分離組分或者化感物質(zhì)對受試對象各生長指標(biāo)的影響，并利用最小顯著性差異法(LSD)比較不同組分間或者不同化感物質(zhì)處理間的差異顯著性。

2結(jié)果和分析

2.1蘆葦葉水提物的不同溶劑萃取物對小麥和蘿卜種子萌發(fā)的化感效應(yīng)

蘆葦葉水提物的不同溶劑萃取物對小麥和蘿卜種子萌發(fā)的化感效應(yīng)見表1。由表1可以看出：隨質(zhì)量濃度的提高，不同溶劑萃取物對小麥和蘿卜種子萌發(fā)的抑制作用總體上逐漸增強(qiáng)。質(zhì)量濃度20、100和500 mg·L-1正丁醇萃取物對小麥種子萌發(fā)的抑制作用明顯高于其他萃取物， 化感效應(yīng)分別為-62.35%、 -91.72%和-100.00%；質(zhì)量濃度20 mg·L-1正丁醇萃取物對蘿卜種子萌發(fā)的化感效應(yīng)略低于乙酸乙酯和二氯甲烷萃取物，但質(zhì)量濃度100和500 mg·L-1正丁醇萃取物對蘿卜種子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，化感

表1蘆葦葉水提物的不同萃取物對小麥和蘿卜種子萌發(fā)的化感效應(yīng)效應(yīng)均達(dá)到-100.00%。上述研究結(jié)果表明：蘆葦葉水提物的正丁醇萃取物對小麥和蘿卜種子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)。

Table 1Allelopathic effect of different partitioned extracts in water extracts from leaf ofPhragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud. on seed germination ofTriticumaestivumLinn. andRaphanussativusLinn.

萃取物Partitionedextract不同濃度萃取物對小麥的化感效應(yīng)/%AllelopathiceffectofdifferentconcentrationextractsonTriticumaestivum20mg·L-1100mg·L-1500mg·L-1不同濃度萃取物對蘿卜的化感效應(yīng)/%AllelopathiceffectofdifferentconcentrationextractsonRaphanussativus20mg·L-1100mg·L-1500mg·L-1石油醚萃取物Partitionedextractofpetroleume-ther-34.44-53.30-53.18-29.40-43.88-68.48二氯甲烷萃取物Partitionedextractofdichlo-romethane-41.69-87.22-86.17-51.02-81.12-85.44乙酸乙酯萃取物Partitionedextractofethylacetate-59.47-65.45-61.53-51.31-59.52-71.38正丁醇萃取物Partitionedextractof1-butanol-62.35-91.72-100.00-46.44-100.00-100.00水萃取物Partitionedextractofwater-52.32-25.86-83.94-12.93-60.74-47.51

2.2蘆葦葉水提物正丁醇萃取物的不同組分對小麥和蘿卜幼苗生長的化感效應(yīng)

根據(jù)上述研究結(jié)果，利用硅膠柱層析從蘆葦葉水提物的正丁醇萃取物中分離獲得11個(gè)組分(Fr. 1至Fr. 11)，各組分對小麥和蘿卜幼苗根長、株高和單株鮮質(zhì)量的影響分別見表2。由表2可以看出：經(jīng)正丁醇萃取物的Fr. 5、Fr. 6與Fr. 7組分處理后，小麥幼苗的根長、株高和單株鮮質(zhì)量總體上低于其他組分，并顯著低于對照組(甲醇)(P<0.05)；經(jīng)Fr. 9與Fr. 10組分處理后，蘿卜幼苗的根長、株高和單株鮮質(zhì)量均低于其他組分，并顯著低于對照組。據(jù)此，選擇Fr. 5、Fr. 6、Fr. 7、Fr. 9和Fr. 10共5個(gè)組分進(jìn)行進(jìn)一步的GC-MS分析。

表2蘆葦葉水提物的正丁醇萃取物的不同組分對小麥和蘿卜幼苗生長的影響

Table 2Effects of different fractions from 1-butanol partitioned extract in water extracts from leaf ofPhragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud. on growth of seedlings ofTriticumaestivumLinn. andRaphanussativusLinn.

組分1)Fraction1)小麥幼苗的生長指標(biāo)2)GrowthindexofTriticumaestivumseedling2)根長/mmRootlength株高/mmHeight單株鮮質(zhì)量/gFreshweightperplant組分1)Fraction1)蘿卜幼苗的生長指標(biāo)2)GrowthindexofRaphanussativusseedling2)根長/mmRootlength株高/mmHeight單株鮮質(zhì)量/gFreshweightperplantCK47.9±8.136.1±2.30.106±0.012CK36.5±4.719.9±3.70.078±0.015Fr.134.8±5.5*25.8±2.9*0.095±0.009Fr.115.2±1.5*11.2±0.9*0.045±0.005*Fr.226.3±3.8*20.9±2.2*0.070±0.012*Fr.236.2±11.519.7±3.50.056±0.006Fr.334.1±5.0*32.3±0.10.095±0.006Fr.328.1±10.714.2±4.30.062±0.022Fr.426.4±0.9*33.9±1.30.113±0.002Fr.48.4±0.9*11.2±0.6*0.064±0.005Fr.516.6±4.1*16.8±4.2*0.040±0.012*Fr.535.4±4.220.6±1.30.091±0.002Fr.66.0±2.6*15.7±4.6*0.043±0.012*Fr.646.0±0.021.8±1.30.081±0.000Fr.713.9±4.8*19.3±6.8*0.044±0.015*Fr.711.5±1.6*10.9±0.4*0.063±0.005Fr.836.5±5.830.7±5.30.096±0.018Fr.837.4±11.615.6±3.60.064±0.018Fr.918.8±0.7*22.7±1.0*0.067±0.001*Fr.97.0±2.6*6.2±1.5*0.031±0.003*Fr.1020.7±0.7*18.4±0.7*0.049±0.006*Fr.107.5±0.1*8.7±1.1*0.034±0.001*Fr.1130.4±4.1*20.3±1.7*0.061±0.003*Fr.1114.9±1.0*8.7±1.0*0.046±0.007*

1)CK: 甲醇Methanol. 各組分的質(zhì)量濃度均為500 mg·L-1Mass concentration of all fractions are 500 mg·L-1.

2)*: 與對照(CK)相比差異顯著(P<0.05) Significant difference compared with the control (CK) (P<0.05).

2.3蘆葦葉水提物的正丁醇萃取物中5個(gè)組分的GC-MS分析結(jié)果

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對蘆葦葉水提物的正丁醇萃取物中5個(gè)具有較高生物活性的組分Fr. 5、Fr. 6、Fr. 7、Fr. 9和Fr. 10進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果分別見表3、表4、表5、表6和表7。

由表3可見：從Fr. 5組分中共鑒定出11種有機(jī)化合物，占總相對含量的83.02%，包括有機(jī)酸類、醇類和糖類等。其中，1,2,3,4-丁四醇的相對含量最高，為64.08%；4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸的相對含量最低，為0.62%。

由表4可見：從Fr. 6組分中共鑒定出15種有機(jī)化合物，占總相對含量的91.31%，包括有機(jī)酸類、醇類、糖類、酯類和酮類等。其中，1,2,3,4-丁四醇的相對含量最高，為53.60%；D-吡喃葡萄糖(D-glucopyranose)的相對含量最低，為0.61%。

由表5可見：從Fr. 7組分中共鑒定出15種有機(jī)化合物， 占總相對含量的87.36%， 包括有機(jī)酸類、醇類、糖類和酯類等。其中，1,2,3,4-丁四醇的相對含量最高，為26.02%；2-氧代己二酸(2-ketoadipic acid)的相對含量最低，為1.10%。

表3蘆葦葉水提物正丁醇萃取物中Fr. 5組分的主要組成成分及其相對含量2.45%。

Table 3Main composition compounds and their relative content in Fr. 5 fraction from 1-butanol partitioned extract in water extracts from leaf ofPhragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.

保留時(shí)間/minRetentiontime成分Compound分子式Molecularformula相對含量/%Relativecontent相似度/%Similardegree11.27tetraethyleneglycolC8H18O50.6565.012.151,2,3-propanetriolC3H8O36.8354.512.651,2,3,4-butanetetrolC4H10O464.0890.013.182,5-dihydroxy-1,4-dioxane-2,5-dimetha-nolC6H12O61.2351.013.292,5-diphenylpyrroleC16H13N2.2549.014.06adonitolC5H12O53.0674.016.061,2-cyclooctanediolC8H16O21.8035.017.77arabinopyranoseC5H10O50.8076.017.85mannono-1,4-lactoneC6H10O61.0545.018.664-methoxymandelicacidC9H10O40.6551.021.45DL-4-hydroxy-3-methoxymandelicacidC9H10O50.6265.0

表4蘆葦葉水提物正丁醇萃取物中Fr. 6組分的主要組成成分及其相對含量

Table 4Main composition compounds and their relative content in Fr. 6 fraction from 1-butanol partitioned extract in water extracts from leaf ofPhragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.

保留時(shí)間/minRetentiontime成分Compound分子式Molecularformula相對含量/%Relativecontent相似度/%Similardegree11.822,2'-thiodiethanolC4H10O2S1.1323.012.14glycerolC3H8O31.8548.012.611,2,3,4-butanetetrolC4H10O453.6091.013.161,3-dihydroxyacetoned-imerC3H6O33.7361.013.27threonineC4H9NO31.1343.016.83uridineC9H12N2O67.2081.017.76arabinopyranoseC5H10O50.7991.017.99D-(-)-gulonicacidγ-lactoneC6H10O60.8939.018.23ribo-pentitolC5H12O53.7462.019.32D-lyxoseC5H10O51.0477.019.84ribitolC5H12O53.5552.020.01phthalicacid,butylisohex-ylesterC18H26O41.2749.021.07D-glucopyranoseC6H12O60.6192.025.74mannono-1,4-lactoneC6H10O61.0826.027.573-(4-methoxybenzyli-dene)-2-piperidinoneC13H15NO29.70 61.0

由表6可見：從Fr. 9組分中共鑒定出12種有機(jī)化合物，占總相對含量的97.92%，包括有機(jī)酸類、酯類、糖類和酰胺類等。其中，鄰苯二甲酸二丁酯的相對含量最高， 為29.05%；亞油酸的相對含量最低， 為

表5蘆葦葉水提物正丁醇萃取物中Fr. 7組分的主要組成成分及其相對含量

Table 5Main composition compounds and their relative content in Fr. 7 fraction from 1-butanol partitioned extract in water extracts from leaf ofPhragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.

保留時(shí)間/minRetentiontime成分Compound分子式Molecularformula相對含量/%Relativecontent相似度/%Similardegree11.832-methoxypropanoicacidC4H8O31.7935.012.13glycerolC3H8O316.9849.012.601,2,3,4-butanetetrolC4H10O426.0289.014.882,5-anhydro-D-mannoseoximeC6H11NO51.8440.015.78D-(+)-arabitolC5H12O51.8292.015.992-ketoadipicacidC6H8O51.1081.016.22xylitolC5H12O55.6594.018.23adonitolC5H12O52.6291.019.31methylhexadecanoateC17H34O21.8595.019.49ribitolC5H12O58.0561.019.732-benzyloxyiminopropan-1,3-diolC10H13NO31.7745.020.00butylisobutylphthalateC16H22O47.7185.022.85inositolC6H12O61.5168.027.573-(4-methoxybenzylidene)-2-piperidinoneC13H12NO26.8765.030.21hexadecanoicacid,2,3-dihydroxypropylesterC19H38O41.7874.0

表6蘆葦葉水提物正丁醇萃取物中Fr. 9組分的主要組成成分及其相對含量

Table 6Main composition compounds and their relative content in Fr. 9 fraction from 1-butanol partitioned extract in water extracts from leaf ofPhragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.

保留時(shí)間/minRetentiontime成分Compound分子式Molecularformula相對含量/%Relativecontent相似度/%Similardegree11.27tetraethyleneglycolC8H18O512.6763.017.06D-xylofuranoseC5H10O58.2357.017.96arabinoseC5H10O55.0574.019.31methylhexadecanoateC17H34O24.8798.019.766-deoxy-L-galactoseC6H12O58.1284.020.01dibutylphthalateC16H22O429.0594.020.39xyloseC5H10O511.4786.021.07mannoseC6H12O63.4991.024.36(Z,Z)-9,12-octadecadie-noicacidC18H32O22.4572.024.44oleicacidC18H34O22.9068.025.68trans-9,10-epoxystearicacidmethylesterC19H36O33.6592.026.82oleamideC18H35NO5.9792.0

表7蘆葦葉水提物正丁醇萃取物中Fr. 10組分的主要組成成分及其相對含量

Table 7Main composition compounds and their relative content in Fr. 10 fraction from 1-butanol partitioned extract in water extracts from leaf ofPhragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.

保留時(shí)間/minRetentiontime成分Compound分子式Molecularformula相對含量/%Relativecontent相似度/%Similardegree4.23N,N-diethyl-formamideC5H11NO4.0591.05.23N,N-diethyl-acetamideC6H13NO5.7191.06.332-ketobutyricacidC4H6O32.8548.06.782-phenethylamineC8H11N2.7376.07.062-methyl-2-propen-1-olC4H8O1.9871.011.11tetraethyleneglycolC8H18O55.2157.012.13glycerolC3H8O37.7153.012.601,2,3,4-butanetetrolC4H10O45.8345.017.06methylβ-D-ribofurano-sideC6H12O52.2648.017.76D-(-)-arabinoseC5H10O51.2555.017.87mannono-1,4-lactoneC6H10O63.8745.018.03L-(+)-arabinoseC5H10O51.8991.019.31methylhexadecanoateC17H34O24.4296.019.49arabinitolC5H12O51.4255.019.766-deoxy-galactoseC6H12O55.2852.020.00dibutylphthalateC16H22O418.8685.020.39xyloseC5H10O51.5692.021.07D-glucopyranoseC6H12O62.5694.023.77hexadecanamideC16H33NO1.6988.025.68trans-9,10-epoxystearicacidmethylesterC19H36O33.9593.026.79oleamideC18H35NO7.9799.027.21octadecamideC18H37NO1.2977.0

由表7可見：從Fr. 10組分中共鑒定出22種有機(jī)化合物，占總相對含量的94.34%，包括有機(jī)酸類、酯類、糖類、酰胺類等。其中，鄰苯二甲酸二丁酯的相對含量最高，為18.86%；硬脂酰胺(octadecamide)的相對含量最低，為1.29%。

2.4蘆葦葉水提物中潛在化感成分對小麥幼苗生長的影響

根據(jù)蘆葦葉水提物中14種潛在化感成分的鑒定結(jié)果，以小麥為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行生物活性測試，14種潛在化感成分對小麥幼苗根長、株高和單株鮮質(zhì)量的影響見表8。由表8可以看出：蘆葦葉水提物中14種潛在化感成分對小麥幼苗根長、株高和單株鮮質(zhì)量的影響存在一定差異。其中，經(jīng)質(zhì)量濃度均為20 mg·L-1的油酸酰胺、棕櫚酸甲酯、亞油酸、2-苯乙胺、2-甲基烯丙醇和4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸處理后，小麥幼苗的株高、根長及單株鮮質(zhì)量均顯著低于對照組(P<0.05)，而質(zhì)量濃度20 mg·L-1的N,N-二乙基乙酰胺和N,N-二乙基甲酰胺僅對小麥幼苗的根長有顯著抑制作用。

表8蘆葦葉水提物中潛在化感成分對小麥幼苗生長的影響1)

Table 8Effect of potential allelopathic compound in water extracts from leaf ofPhragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud. on growth ofTriticumaestivumLinn. seedling1)

成分2)Compound2)根長/mmRootlength株高/mmHeight單株鮮質(zhì)量/gFreshweightperplantCK30.2±4.126.6±3.90.058±0.0101,2,3,4-butanetetrol29.0±5.428.8±4.50.068±0.011dibutylphthalate25.2±10.216.5±6.50.047±0.016oleamide15.7±5.0*13.4±3.8*0.032±0.008*tetraethyleneglycol22.1±2.821.7±2.30.061±0.011D-lyxose23.7±8.623.6±8.90.058±0.022D-(-)-gulonicacidγ-lactone29.7±5.029.1±4.50.067±0.013methylhexadecanoate6.5±0.3*4.6±0.1*0.024±0.002*oleicacid23.8±3.621.6±4.50.059±0.010(Z,Z)-9,12-octadecadienoicacid8.6±5.0*6.6±3.8*0.022±0.013*N,N-diethyl-for-mamide19.9±5.6*19.4±6.10.049±0.0152-phenethylamine4.2±2.4*8.7±5.0*0.023±0.013*2-methyl-2-propen-1-ol4.6±2.7*5.2±3.0*0.021±0.012*DL-4-hydroxy-3-methoxymandelicacid9.2±5.3*9.5±5.5*0.027±0.015*N,N-diethyl-acetam-ide13.6±1.5*13.5±2.00.037±0.006

1)*: 與對照(CK)相比差異顯著(P<0.05) Significant difference compared with the control (CK) (P<0.05).

2)CK: 甲醇Methanol. 各組分的質(zhì)量濃度均為20 mg·L-1Mass concentration of all compounds are 20 mg·L-1.

3討論和結(jié)論

本研究中，通過不同溶劑萃取、硅膠柱層析、TLC檢測及GC-MS等方法，對蘆葦葉水提物中潛在化感成分的分析結(jié)果表明：蘆葦葉水提物中主要含糖類、醇類、有機(jī)酸類、酮類、酰胺類和酯類化合物；14種潛在化感成分中，油酸酰胺、棕櫚酸甲酯、亞油酸、2-苯乙胺、2-甲基烯丙醇和4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸對小麥幼苗生長的抑制作用較強(qiáng)，顯示這些成分的化感作用較強(qiáng)， 而1,2,3,4-丁四醇和D-(-)-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯則對小麥幼苗生長具有一定的促進(jìn)作用。從相關(guān)文獻(xiàn)可知，油酸酰胺[14]、棕櫚酸甲酯[15-16]和亞油酸[17-18]的化感活性均較強(qiáng)，而4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸、2-苯乙胺和2-甲基烯丙醇的化感活性尚未見報(bào)道。因此，要明確蘆葦葉水提物中的化感成分及其變化規(guī)律，還需進(jìn)一步研究。

目前，有關(guān)植物化感成分的研究主要集中在重要農(nóng)作物[3]和外來入侵植物，特別是菊科(Asteraceae)中的外來入侵植物，如紫莖澤蘭〔Ageratinaadenophora(Spreng.) R. M. King et H. Rob.〕、牛膝菊(GalinsogaparvifloraCar.)和野茼蒿〔Crassocephalumcrepidioides(Benth.) S. Moore〕等[19-20]，而有關(guān)禾本科(Poaceae)野生植物中化感成分的研究還較少。在禾本科植物中，不同植物的化感成分差異較大，如蘆葦中的化感成分為沒食子酸(gallic acid)[8-9]和2-甲基乙酰乙酸乙酯(ethyl 2-methylacetoacetate)[12]；小麥的化感成分為2種苯并惡嗪酮類化合物[21]，而水稻(OryzasativaLinn.)的化感成分可能是羥基肟酸類、環(huán)己烯酮類、黃酮類、二萜內(nèi)酯類和酚類成分[3-4]。目前GC-MS法常用于化感成分鑒定，但只有約20%的成分可以采用GC-MS法鑒定，還有約80%的分子量較大和溶于水相的有機(jī)物無法采用GC-MS法分離鑒定[22]，即熱不穩(wěn)定性和不能氣化的成分無法采用GC-MS法分析鑒定[23]。本研究中，雖然已鑒定和驗(yàn)證了油酸酰胺、棕櫚酸甲酯、亞油酸、2-苯乙胺、2-甲基烯丙醇和4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸是蘆葦葉中的重要化感成分，但并不能排除存在其他化感成分的可能性。植物的化感活性不僅取決于化感物質(zhì)的種類和濃度，還取決于不同化感成分的組合[24]。本研究僅對蘆葦葉水提物的正丁醇萃取物中14種單一成分的生物活性進(jìn)行驗(yàn)證，但各化感成分如何作用于受體植物以及多種化感成分如何相互作用尚未知，有待進(jìn)一步研究。

綜合研究結(jié)果表明：蘆葦葉水提物的化感物質(zhì)主要存在于其正丁醇萃取物中，其中油酸酰胺、棕櫚酸甲酯、亞油酸、2-苯乙胺、2-甲基烯丙醇和4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸等成分具有較強(qiáng)生物活性，推斷上述成分為蘆葦葉水提物的主要化感成分。

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(責(zé)任編輯： 張明霞)

收稿日期：2015-05-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400378)； 中國林業(yè)科學(xué)研究院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(CAFYBB2014QB034)

作者簡介：葉小齊(1979—)，男，湖北麻城人，博士，助理研究員，主要從事化學(xué)生態(tài)學(xué)方面的研究。 ①通信作者E-mail: hangzhoubay@126.com

中圖分類號：Q948.12+2; Q946.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-7895(2016)02-0041-07

DOI:10.3969/j.issn.1674-7895.2016.02.05

Analysis on allelopathic activity and screening on potential allelopathic compound in water extracts from leaf ofPhragmitesaustralis

YE Xiaoqi, WU Ming①, SHAO Xuexin, LI Changming

(National Research Station of Hangzhou Bay Wetlands Ecosystem of Zhejiang Province, Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(2): 41-47

Abstract:Water extracts from leaf of Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud. were extracted by different solvents, and taking seeds of Triticum aestivum Linn. and Raphanus sativus Linn. as experimental materials, allelopathic effect of different partitioned extracts was determined. Partitioned extract of 1-butanol with the strongest inhibition effect was separated further by thin layer chromatography and column chromatography, and composition compounds in fractions with higher biological activity were analyzed by GC-MS method. On this basis, biological activity of potential allelopathic compound selected with high relative content and typicality were determined to screen potential allelopathic compound in leaf ofP.australis.Theresultsshowthatwithenhancingofmassconcentration(20, 100and500 mg·L-1), inhibition effects of partitioned extracts of petroleum ether, dichloromethane, ethyl acetate, 1-butanol and water in water extracts from leaf of P. australis on seed germination of T. aestivum and R. sativus increase gradually, in which that of 1-butanol partitioned extract is the strongest. Among eleven fractions from 1-butanol partitioned extract, Fr. 5, Fr. 6， Fr. 7， Fr. 9 and Fr. 10 fractions can significantly inhibit growth of R. sativus or T. aestivum seedling, and after treated by treating solution with mass concentration 500 mg·L-1of each fraction, height, root length and fresh weight per plant of R. sativus or T. aestivum seedling are significantly lower than those of the control (P<0.05). 11, 15, 15, 12 and 22 compounds are identified from Fr. 5, Fr. 6, Fr. 7, Fr. 9 and Fr. 10 fractions by GC-MS method, accounting for 83.02%, 91.31%, 87.36%, 97.92% and 94.34% of total relative content in above respective fractions, respectively. And main compounds include saccharides, alcohols, organic acids, ketones, amides and esters. The determination result of biological activity of fourteen potential allelopathic compounds shows that these compounds have an obvious inhibition effect on growth of T. aestivum seedling, in which, after treated by oleamide, methyl hexadecanoate, (Z,Z)-9,12-octadecadienoic acid, 2-phenethylamine, 2-methyl-2-propen-1-ol and DL-4-hydroxy-3-methoxymandelic acid with mass concentration 20 mg·L-1, height, root length and fresh weight per plant of T. aestivum seedling are significantly lower than those of the control. The comprehensive analysis result shows that water extracts from leaf of P. australis has strong allelopathic activity, and potential allelopathic compounds are oleamide, methyl hexadecanoate, (Z,Z)-9,12-octadecadienoic acid, 2-phenethylamine, 2-methyl-2-propen-1-ol and DL-4-hydroxy-3-methoxymandelic acid.

Key words:leaf of Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud.; water extracts; allelopathic compound; biological detection; GC-MS