李穎 王瀟麗 王軍 徐麗麗 楊乃龍* 郭道瑞

1. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科， 青島 266000 2. 中國(guó)人民解放軍第401醫(yī)院， 青島 266000 3. 青島市開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院骨科， 青島 266000

近年來(lái)腸促胰素與骨代謝的相關(guān)研究逐漸成為熱點(diǎn)，其中促胰島素分泌多肽(glucose-dependent insulinotropic ploypeptide，GIP)和胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)參與骨轉(zhuǎn)換代謝的調(diào)節(jié)[1]。GIP既促進(jìn)骨形成，又抑制骨重吸收[2]。近期研究表明[3]，GIP受體(GIPR)缺失能夠破壞骨皮質(zhì)的質(zhì)量與強(qiáng)度。另外皮下注射GLP-2可減少小鼠循環(huán)中骨重吸收的分子標(biāo)記物水平。健康絕經(jīng)后女性口服GLP-2能夠增加髖部及轉(zhuǎn)子的骨密度[4]。關(guān)于GLP-1對(duì)骨代謝的作用似乎有爭(zhēng)議。正常小鼠口服GLP-1對(duì)骨結(jié)構(gòu)并無(wú)影響，但2型糖尿病及胰島素抵抗小鼠服用GLP-1后骨質(zhì)量顯著增加[5]。與GLP-1相比，GLP-1受體激動(dòng)劑具有類似的生物學(xué)作用，且其半衰期更長(zhǎng)，與GLP-1受體親和力更高[6-7]。目前研究提示GLP-1受體激動(dòng)劑具有促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的雙重作用[8-9]，然而關(guān)于GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)骨吸收影響的研究頗多[10-11]，關(guān)于GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)骨形成影響的研究相對(duì)較少。本研究采用的MG63細(xì)胞來(lái)源于人成骨肉瘤，其特性與未分化的早期成骨細(xì)胞表型類似，且研究發(fā)現(xiàn)[12]，MG63細(xì)胞高表達(dá)GLP-1受體并易于獲得。故本研究探討艾塞那肽對(duì)MG63細(xì)胞增殖及成骨分化的影響，進(jìn)一步完善GLP-1受體激動(dòng)劑與骨代謝相關(guān)作用研究，為GLP-1受體激動(dòng)劑的臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

MG63細(xì)胞(由中南大學(xué)湘雅二院骨代謝內(nèi)分泌研究所提供)，高糖-DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗(Hyclone公司)，地塞米松、L-2-磷酸抗壞血酸、β-甘油磷酸(Sigma公司)，Cell Counting Kit-8細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒及堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，TRITON-X100(Solarbio公司)，艾塞那肽(標(biāo)準(zhǔn)品，由美國(guó)Lilly公司提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1MG63細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)：-80℃冰箱中取出凍存MG63細(xì)胞，立即投入37℃～40℃恒溫水中迅速晃動(dòng)至凍存液完全緩解。將細(xì)胞懸液移至離心管內(nèi)，加入5 ml培養(yǎng)液(含高糖DMEM，體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，1%雙抗)，輕輕吹打混勻。將細(xì)胞懸液經(jīng)1 000 r/min離心5 min，棄上清液。向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)液5 ml，輕輕混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。復(fù)蘇第2天上午更換培養(yǎng)基，之后每2天換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)傳代，取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8比色法測(cè)定細(xì)胞增殖率：MG63單細(xì)胞懸液以1×105/ml密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 ul，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細(xì)胞融合至70%，換用終濃度分別為0 mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L的艾塞那肽培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，每孔100 ul，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。36 h后分別于每孔加入10 ul CCK-8溶液，在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度OD值。

1.2.3蛋白濃度的測(cè)定：MG63單細(xì)胞懸液以1×105/ml密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 ul，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。10 h后，待細(xì)胞融合度達(dá)70%，換用終濃度分別為0 mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L的艾塞那肽培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，每孔100 ul，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。36 h后吸出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)原培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，加入0.2%Triton-X100進(jìn)行裂解，每孔150 ul。收集裂解細(xì)胞，1 000 r/min 4℃離心10 min，吸取上清液。在96孔板中分別加入雙蒸水10 ul(空白孔)、563 ug/ml標(biāo)準(zhǔn)品10 ul(標(biāo)準(zhǔn)孔)、上述上清液各10 ul(測(cè)定孔)，空白孔及標(biāo)準(zhǔn)孔設(shè)1個(gè)復(fù)孔，測(cè)定孔設(shè)2個(gè)復(fù)孔。每孔加入工作液250 ul，混勻，37℃孵育30 min，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度OD562值，并通過(guò)以下公式計(jì)算總蛋白濃度：

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(563 ug/ml)×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

1.2.4AKP活力測(cè)定：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中取18孔，各孔分別加入雙蒸水5 ul(空白孔)、0.1 mg/ml酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液5 ul(標(biāo)準(zhǔn)孔)、不同濃度艾塞那肽(0 mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L)處理后的上清液各5 ul(測(cè)定孔)，空白孔及標(biāo)準(zhǔn)孔設(shè)1個(gè)復(fù)孔，測(cè)定孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別于每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各50 ul，充分混勻，37℃水溶15 min，加入顯色劑150 ul，輕輕振搖孔板混勻，波長(zhǎng)520 nm，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MG63細(xì)胞形態(tài)

圖1為復(fù)蘇后MG63細(xì)胞，光鏡下細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)近似梭形，有少量偽足，核仁清晰、大。

圖1 MG-63細(xì)胞形態(tài)觀察(20×)Fig.1 The morphology of MG63 cells (20×)

2.2 艾塞那肽對(duì)MG63細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組的OD值分別為0.605±0.468、0.828±0.272、0.748±0.368、0.682±0.487。MG63細(xì)胞增殖率測(cè)定與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組各組OD值均顯著增高(P<0.05)，且隨著GLP-1受體激動(dòng)劑濃度的降低，測(cè)定OD值逐漸增高，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 艾塞那肽對(duì)MG63細(xì)胞成骨分化的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組的AKP活力值依次為7.051±0.995、8.036±0.057、7.365±0.075、7.355±0.113，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組各組AKP活力均顯著增高(P<0.05)，且低濃度的艾塞那肽(10-9mol/L)促進(jìn)成骨活性能力高于中高濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

糖尿病可導(dǎo)致骨質(zhì)量下降，從而增加糖尿病患者骨折風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。Janghorbani等[15]的研究顯示，T2DM患者髖骨骨折風(fēng)險(xiǎn)增高，與非T2DM患者比，男性風(fēng)險(xiǎn)比為2.8，女性風(fēng)險(xiǎn)比為2.1，T1DM患者髖骨骨折風(fēng)險(xiǎn)則更加顯著，RR達(dá)6.3，此外糖尿病患者非椎體骨折風(fēng)險(xiǎn)亦明顯增加[16]。

GLP-1受體激動(dòng)劑是糖尿病藥物治療的新興藥物，除了促進(jìn)胰島素分泌及抑制胰高血糖素分泌的作用外，還有減緩胃排空、抑制食欲、對(duì)心肌的保護(hù)、對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)、對(duì)肝炎癥與脂肪變性的改善等作用[17]。由于糖尿病患者骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)的增高，GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)于骨代謝的影響也逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前研究顯示，GLP-1受體可通過(guò)直接或間接作用調(diào)節(jié)骨代謝向骨形成方向轉(zhuǎn)化[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1受體激動(dòng)劑可通過(guò)與甲狀腺C細(xì)胞表面的受體結(jié)合促進(jìn)降鈣素分泌，從而抑制骨吸收[10, 18]。Ma等人[9]已證明GLP-1受體激動(dòng)劑艾塞那肽可降低卵巢切除小鼠尿鈣、尿磷的排泄，減少體內(nèi)鈣的丟失，從而緩解骨質(zhì)疏松的發(fā)展。Yamada等人[11]將小鼠GLP-1受體激動(dòng)劑受體基因敲除后發(fā)現(xiàn)骨量減少、骨脆性增加、破骨細(xì)胞數(shù)目增多、骨吸收活性增強(qiáng)。因此，GLP-1受體激動(dòng)劑在骨代謝中可能存在促進(jìn)增殖及抑制吸收的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GLP-1受體激動(dòng)劑艾塞那肽在一定范圍內(nèi)可促進(jìn)MG63細(xì)胞增殖，低濃度作用更強(qiáng)，與之前的研究結(jié)果一致[8]。AKP活性是成骨細(xì)胞分化的功能指標(biāo)[19]，其活性高低可反映成骨細(xì)胞的成熟狀況，AKP活性越高，表明向成骨細(xì)胞分化的程度越高[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各實(shí)驗(yàn)組AKP活力較對(duì)照組均增高(P<0.05)，提示艾塞那肽對(duì)成骨分化有促進(jìn)作用，與低濃度組相比，中高濃度組的AKP活力均顯著降低，提示低濃度的艾塞那肽更能促進(jìn)成骨分化。艾塞那肽可能通過(guò)與MG63細(xì)胞高表達(dá)的GLP-1受體激動(dòng)劑受體結(jié)合，從而促進(jìn)其增殖及向成骨細(xì)胞分化。

GLP-1受體激動(dòng)劑除了降糖作用外，還有減體重、改善血脂代謝、改善骨代謝等多種作用。本研究在體外實(shí)驗(yàn)中證明了GLP-1受體激動(dòng)劑可促進(jìn)MG63細(xì)胞增殖并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。當(dāng)然實(shí)際臨床應(yīng)用中GLP-1受體激動(dòng)劑能否降低糖尿病患者骨折風(fēng)險(xiǎn)尚有待觀察。