張順聰 郭丹青 李永賢 唐永超 楊志東 梁德* 李大星 莫國業(yè) 馮蓬勃

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510400

目前治療骨質(zhì)疏松的藥物主要作用為抑制骨吸收，但同時也會影響骨形成，甚至可能導(dǎo)致骨腫瘤[1]。因此為了減少骨量丟失，需要一種能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生成的治療方式。目前臨床運(yùn)用的有甲狀旁腺素或新型的代謝藥物如鈣敏受體拮抗劑、Wnt通路抑制劑[2-3]，另外異黃酮是一種有前景的防治骨質(zhì)疏松藥物。淫羊藿苷是一種從中藥淫羊藿中分離出的活性黃酮糖苷，臨床常將淫羊藿用于治療腎、關(guān)節(jié)及肝臟等疾病。實(shí)驗(yàn)表明淫羊藿苷可促進(jìn)大鼠成骨骨髓間充質(zhì)細(xì)胞像向成骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟和礦化和抑制破骨細(xì)胞生成[4]。傳遞成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互作用的一個重要信號通道為骨保護(hù)素(Osteoproteyerin， OPG) /核因子NF-κB 受體激活因子配體(ReceptorActivator of NF-κB Li gand, RANKL)/核因子NF-κB受體激活因子(ReceptorActivator of NF-κB, RANK)，淫羊藿苷對人成骨樣細(xì)胞(MG-63)成骨分化，以及是否通過作用于OPG/RANKL影響成骨分化尚不明確。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

人骨肉瘤成骨樣細(xì)胞系(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC編號號GDC074)。

1.2 藥物

淫羊藿苷試劑(含量98%，上海純優(yōu)生物科技有限公司)，用DMEM培養(yǎng)基稀釋并分別配制成1 nmol/ml，10 nmol/L，100 nmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L，過濾分裝后備用。

1.3 試劑及儀器

無酚紅DMEM培養(yǎng)液；0.25%胰酶-EDTA;抗壞血酸，焦碳酸二乙酯(DEPC);TRIzol和胎牛血清(FBS,美國Gibico公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)；引物(合成于life technology公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；OPG(Santa Cruz生物工程公司)、RANKL(Cell singnaling)、GAPDH抗體(Cell singnaling)；辣根過氫化物酶標(biāo)記的抗兔二抗(Cell singnaling)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(SHELLAB公司)；超凈臺(美國Forma Scientific公司)，高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司5804R)；全波長多功能酶標(biāo)儀(上海公司MK3)；凝膠影像分析儀(美國Bio-Rad公司Gel Doc XR+)，梯度PCR儀(美國BIO-RAD公司T100)；實(shí)時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司CFX96 Touch)；生物顯微鏡(德國Leica公司DM1000)；電子天平(賽多利斯公司BSA-623S-CW)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板(美國Corning Costar公司)；10%FBS的1640培養(yǎng)基(美國gibco公司)；成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)實(shí)驗(yàn)

MG-63細(xì)胞培養(yǎng)(培養(yǎng)基、傳代、凍存和復(fù)蘇)按常規(guī)方法。MG-63細(xì)胞分別接種于6孔塑料培養(yǎng)板，隔兩天用PBS液進(jìn)行細(xì)胞換液，細(xì)胞即將鋪滿培養(yǎng)板時進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞傳第5代時用1 nmol/L，10 nmol/L,100 nmol/L,1 μmol/L,10 μmol/L淫羊藿苷各2ml進(jìn)行干預(yù)，陰性對照組加入2 ml培養(yǎng)基，再各加入2 ml成骨誘導(dǎo)劑進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化。

1.5 RT-PCR檢測

干預(yù)后3、6天提取細(xì)胞RNA進(jìn)行檢測，用TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，配制10 μl的反應(yīng)體系在梯度PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR法檢測第3天MYC、CDK7細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，第6天檢測RUNX2、COL1A1、OPG、RANKL的表達(dá)，同時以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 The design of primers

PCR條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94℃ 45 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，共40個循環(huán)，于72 ℃延伸10 min。

1.6 蛋白表達(dá)檢測

干預(yù)6天后進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取，采用Western blot檢測OPG、RANKL、RUNX2、COL1A1蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

不同濃度淫羊藿苷干預(yù)后OPG、RANKL、RUNX2、COL1A1、CDK7、MYC mRNA表達(dá)結(jié)果見圖1，蛋白表達(dá)量見圖2。對成骨分化相關(guān)基因，10 nmol、1 μmol干預(yù)的MG-63 RUNX2基因表達(dá)量較1 nmol及10 μmol的高(P<0.05)，與100 nmol及空白對照組沒有明顯差別(P>0.05)，10 μmol的RUNX2加而升高，10 μmol的表達(dá)量較其余各組有明顯升高(P<0.05)，其蛋白表達(dá)也更多；RANKL的基因表達(dá)量極低，且在各組之間均無明顯差異(P>0.05)，但100 nmol時趨于更多，10 nmol時趨于更少，而RANKL的蛋白表達(dá)無條帶；OPG的表達(dá)在1 μmol濃度時較100 nmol、10 μmol明顯增高(P<0.05)，與1 nmol、10 nmol及空白組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但1 μmol濃度時OPG表達(dá)量有增多趨勢；與細(xì)胞增殖相關(guān)的MYC的表達(dá)各組之間均沒有差異(P>0.05)，而CDK7的表達(dá)均較空白組降低(P<0.05)。

圖1 不同濃度淫羊藿苷干預(yù)后各基因表達(dá)量注：*與對照組相比P<0.05；#與10μmol/L組相比P<0.05；**與1μmol/L組相比P<0.05Fig.1 The mRNA expression ofRUNX2,COL1A1,OPG and RANKL in MG-63 cells were determined by real-time PCR after treatment with different concentrations of Icariin for 6 days, and CDK7 and MYC for 3days.*Compared with the control group,P<0.05;# Compared with the treatment at 10 μmol/L, P<0.05;**Compared with the treatment at 1 μmol/L, P<0.05.

圖2 不同濃度淫羊藿苷干預(yù)后各蛋白表達(dá)量Fig.2 The protein expression ofRUNX2,COL1A1,OPG and RANKL in MG-63 cells were determined by wetern-blot after treatment with different concentrations of Icariin for 6 days.

3 討論

近幾年多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明淫羊藿苷在促進(jìn)細(xì)胞成骨分化中具有重要作用[5-7]，Luo等人[5]研究發(fā)現(xiàn)10-5mol/L的淫羊藿苷能恢復(fù)體外老年去卵巢大鼠因雌激素減少和老齡所致的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化減少的能力，主要是通過影響雌激素信號通路；Ma等人[6]發(fā)現(xiàn)10-5mol/L的淫羊藿苷比10-8mol/L的地塞米松更能明顯促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性和鈣鹽沉積；Song[7]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞ERK和JNK的生成，而抑制MAPK信號通路可減少淫羊藿的促成骨效應(yīng)，同時也抑制ERK和JNK的表達(dá)，說明其作用可能與MAPK信號通路相關(guān)。但大多數(shù)文獻(xiàn)還是以動物細(xì)胞為研究對象，本研究針對人成骨樣細(xì)胞MG-63受淫羊藿苷影響的表現(xiàn)特點(diǎn)，可能更接近人的成骨分化特征。

RUNX2和COL1A1是成骨分化的兩個主要標(biāo)志基因之一，10 μmol的淫羊藿苷能促進(jìn)COL1A1基因和蛋白的表達(dá)，而RUNX2的mRNA表達(dá)在10 μmol最低，而蛋白含量在10 μmol最高，這與其它研究動物細(xì)胞的結(jié)果[6]不完全一致，這可能是淫羊藿苷作用于MG-63細(xì)胞的RUNX2的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。CDK7與MYC均是細(xì)胞增殖中的重要標(biāo)志基因，尤其是CDK7，與對照組相比，淫羊藿苷明顯抑制CDK7的表達(dá)，說明淫羊藿苷減少M(fèi)G-63的細(xì)胞增殖，促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞分化階段，Song等[7]研究也表明淫羊藿苷能降低MC3T3-E1細(xì)胞CDK4的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞分化。

OPG/RANKL/RANK 系統(tǒng)在成骨與破骨細(xì)胞的相互平衡中起重要作用，OPG與RANKL能競爭性的結(jié)合RANK受體，而減少破骨細(xì)胞的生成。OPG、RANKL都是由成骨細(xì)胞系分泌的[8]，本實(shí)驗(yàn)以MG-63為研究對象，因其是體外研究成骨細(xì)胞功能具有代表性的細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MG-63中RANKL的RNA和蛋白表達(dá)量都極低，甚至包括在空白組，Gori等[8]認(rèn)為在成骨分化過程中，RANKL的表達(dá)量會下降約5倍，而OPG的表達(dá)會上升7倍，RANKL表達(dá)量受明顯抑制可能是原因之一；另外，Mori等[9]研究發(fā)現(xiàn)RANKL在MG-63、U2OS、HOB、SAOS-2、HOS等所有人成骨肉瘤中的表達(dá)量都極低，而Mogi等[10]發(fā)現(xiàn)OPG-RANKL復(fù)合體只在U2OS細(xì)胞中檢測得到，在MG-63、HOB、SAOS-2、HOS細(xì)胞中都無法檢測，這也可能是RANKL蛋白無法檢測出的另一原因，但也有文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]MG-63可檢測出表達(dá)量較高的RANKL，這些差異可能與細(xì)胞在體外培養(yǎng)的具有異質(zhì)性，某些特性改變有關(guān)。雖然結(jié)果顯示RANKL的mRNA表達(dá)量低，但淫羊藿苷濃度10nmol時其表達(dá)趨于更受抑制，Wang等[12]報(bào)道另一種異黃酮類葛根素1 μmol能明顯抑制MG-63中RANKL的表達(dá)，同時淫羊藿苷能降低SW1353人軟骨肉瘤細(xì)胞中RANKL的表達(dá)量[13]。

OPG/RANKL的比例增高可抑制破骨分化，Wang等[14]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MG-63細(xì)胞中OPG的表達(dá)是受雌激素受體α(Estrogen receptor α，ERα)調(diào)節(jié)的，Luo等[5]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可上調(diào)MG-63中ERα，但并沒有文獻(xiàn)報(bào)道淫羊藿苷對OPG/RANKL表達(dá)的直接影響，本實(shí)驗(yàn)中不同濃度的淫羊藿苷干預(yù)后的OPG、RANKL表達(dá)量與對照組相比均無明顯差異，這說明很可能淫羊藿苷不通過上調(diào)OPG/RANKL來促進(jìn)成骨分化，本實(shí)驗(yàn)未來將進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

因此，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)10 μmol/L的淫羊藿苷可明顯促進(jìn)COL1A1的表達(dá)量，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，但并不通過作用于OPG/RANKL系統(tǒng)起效。