韓兆冬　羅宏偉　林卓遠(yuǎn)　梁應(yīng)科　陳果　吳永定　何慧嬋

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PRC1高表達(dá)與前列腺癌生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究

韓兆冬羅宏偉林卓遠(yuǎn)梁應(yīng)科陳果吳永定何慧嬋

510180 廣州，廣州市第一人民醫(yī)院泌尿外科(韓兆冬)，中心實(shí)驗(yàn)室(韓兆冬，羅宏偉，林卓遠(yuǎn)，梁應(yīng)科，陳果，吳永定)；510230 廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(何慧嬋)

【摘要】目的研究細(xì)胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1(PRC1)在前列腺癌中的表達(dá)情況及其與生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性。方法采用實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白免疫印跡法檢測(cè)PRC1在前列腺癌與癌旁前列腺組織的表達(dá)水平，并利用Taylor基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PRC1基因mRNA水平進(jìn)行驗(yàn)證。Kaplan-Meier法分析前列腺癌患者總體生存率及生化復(fù)發(fā)時(shí)間與PRC1 mRNA表達(dá)水平之間的關(guān)系。Cox回歸分析臨床病理特征與生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性。結(jié)果12對(duì)前列腺癌及癌旁前列腺組織中，前列腺癌的PRC1 mRNA及蛋白表達(dá)均高于癌旁前列腺組織(P均<0.01)。Taylor基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，PRC1在前列腺癌組織中的表達(dá)水平高于非癌組織(P<0.001)，且出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、Gleason評(píng)分高、臨床分期≥T3A期者的PRC1 mRNA表達(dá)水平高于無(wú)出現(xiàn)生化復(fù)化或轉(zhuǎn)移、Gleason評(píng)分低、臨床分期

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1；前列腺癌；生化復(fù)發(fā)；預(yù)后

材料與方法

一、材料

12對(duì)前列腺癌及癌旁前列腺組織來(lái)源于廣州市第一人民醫(yī)院，所有病例均為首次確診并行前列腺癌根治術(shù)，術(shù)前均未行放射治療或化學(xué)治療。前列腺癌患者年齡(65.7±3.5)歲，按TNM分期T1 3例，T2 9例；Gleason評(píng)分<7分10例，≥7分2例；術(shù)前PSA<4 μg/L 2例，PSA≥4 μg/L 10例。

二、主要試劑及儀器

RNApure 高純總RNA快速抽提試劑盒(離心柱型)購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，Trizol總RNA抽提試劑為美國(guó)Invitrogene公司產(chǎn)品，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑為日本Takara寶生物產(chǎn)品；PRC1兔抗人單克隆抗體為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品，β-actin抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，SuperSignal?系列Western化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)為美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；RotorGene 2000 system實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析系統(tǒng)為澳大利亞Corbett Research產(chǎn)品。

三、方法

1. PRC1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)。提取前列腺癌及癌旁前列腺組織總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR總體系20 μl，根據(jù)儀器提供的實(shí)驗(yàn)方案配制SYBR Green PCR Master Mix,β-actin作為內(nèi)參，按PCR儀附帶的實(shí)驗(yàn)方案操作。引物序列：PRC1上游 5’-CCTGTGCCTACTTTGCCTGA-3’，下游5’-CGTGGCTAACACCAAGTCCA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度304 bp；β-actin上游 5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游5’-GGGCACGAAGGCTC ATCATT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度285 bp。PCR反應(yīng)步驟：94℃預(yù)熱10 min， 94℃ 15 s、56℃退火15 s，循環(huán)37次，72℃延伸45 s。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定閾值，使用Rotor-Gene 5.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2. PRC1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

出現(xiàn)高溫災(zāi)害4年，極端高溫達(dá)到37.2℃，影響冬小麥灌漿和干物質(zhì)積累，千粒重下降，造成逼熟空秕子多，因而減產(chǎn)。

采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)。從前列腺癌及癌旁前列腺組織中提取蛋白，取40 μg蛋白在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移至雜交硝酸纖維素膜上，然后以脫脂奶粉溶于Tris-HCl緩沖鹽溶液，調(diào)節(jié)濃度至5%，封閉1 h，隨后洗凈膜并孵育PRC1抗體(1∶2 000)及β-actin抗體(1∶2 000)，使用SuperSignal West PICO化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)觀察結(jié)果，β-actin作為內(nèi)參蛋白。

3. Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)分析

由于納入本研究的樣本量較少，所以利用Taylor基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)資料進(jìn)行驗(yàn)證，并分析PRC1表達(dá)水平與前列腺癌臨床病理特征關(guān)系。Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)[美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)高通量基因數(shù)據(jù)表達(dá)平臺(tái)(GEO)，檔案編號(hào) GSE21032]是一個(gè)公用的數(shù)據(jù)平臺(tái)，其中mRNA表達(dá)譜芯片包含帶有臨床隨訪數(shù)據(jù)的150例原發(fā)性前列腺癌及29例非癌組織。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、PRC1在前列腺癌及癌旁前列腺組織的mRNA及蛋白表達(dá)情況

12例前列腺癌及癌旁前列腺組織中，PRC1 mRNA在前列腺癌組織表達(dá)水平為9.22±2.28，比癌旁前列腺組織(1.04±0.29)上調(diào)(t=10.781，P<0.001)，見(jiàn)圖1； PRC1蛋白在前列腺癌組織的表達(dá)水平為3.89±2.55，比癌旁前列腺組織(1.00±0.39)增加(t=4.653，P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖1　PRC1 mRNA在前列腺癌及

**P<0.01

二、PRC1與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系

為進(jìn)一步驗(yàn)證PRC1在前列腺癌中的表達(dá)情況，通過(guò)Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)PRC1在前列腺癌組織中的表達(dá)(6.87±0.38)高于非癌組織(6.61±0.12)(P<0.001)，且出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、Gleason評(píng)分高、臨床分期≥T3A期者的PRC1 mRNA表達(dá)水平高于無(wú)出現(xiàn)生化復(fù)化或轉(zhuǎn)移、Gleason評(píng)分低、臨床分期

三、 PRC1與前列腺癌生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性

以PRC1表達(dá)水平量的中位數(shù)為分割點(diǎn)，分成高表達(dá)組和低表達(dá)組。通過(guò)Kaplan-Meier 曲線分析Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌患者總體生存率及生化復(fù)發(fā)時(shí)間與PRC1表達(dá)量之間的聯(lián)系，高表達(dá)組的無(wú)生化復(fù)發(fā)率低于低表達(dá)組(P=0.008)，而2組的總體生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.105)，見(jiàn)圖3。此外，在單因素分析中，高表達(dá)組與低表達(dá)組在生化復(fù)發(fā)時(shí)間上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=5.08, 95%CI2.51～10.26，P<0.001)。在多因素分析中，高表達(dá)PRC1(HR=6.17, 95%CI2.02～18.86，P=0.001)、高Gleason評(píng)分(HR=2.80, 95%CI1.81～4.34，P<0.001)、術(shù)前高PSA水平(HR=1.01, 95%CI1.00～1.01，P=0.021)及高病理分期(HR=2.82, 95%CI1.17～6.81，P=0.021)均為生化復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

圖2　PRC1蛋白在前列腺癌及癌旁前列腺組織的表達(dá)情況

A：蛋白免疫印跡法結(jié)果；B：定量分析結(jié)果，**P<0.01

表1　PRC1表達(dá)與前列腺癌臨床特征的關(guān)系

續(xù)表

臨床特征例數(shù)PRC1mRNA表達(dá)水平t值P值生化復(fù)發(fā) 否1046.77±0.27-3.3840.001 是367.03±0.43

注：因?yàn)閿?shù)據(jù)庫(kù)中有部分原始數(shù)據(jù)缺失，所以某些統(tǒng)計(jì)項(xiàng)目的納入病例數(shù)不相同

圖3　前列腺癌中PRC1表達(dá)相關(guān)的Kaplan-Meier曲線

A：生化復(fù)發(fā)時(shí)間比較；B：總體生存體率比較

表2　Cox風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型中PRC1表達(dá)量對(duì)生化復(fù)發(fā)的診斷價(jià)值

討論

前列腺癌是嚴(yán)重影響男性健康的惡性腫瘤，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)。前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段的過(guò)程，而且有不同的機(jī)制參與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后。生化復(fù)發(fā)是前列腺癌根治術(shù)后疾病復(fù)發(fā)的早期表現(xiàn)，約17%～64%根治術(shù)后患者出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)，其中約1/3發(fā)展為轉(zhuǎn)移性前列腺癌[5]。Punnen等[6]提出生化復(fù)發(fā)與前列腺癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，對(duì)生化復(fù)發(fā)的早期預(yù)測(cè)有助于觀察前列腺癌的病情變化及指導(dǎo)進(jìn)一步的治療。

PRC1蛋白由620個(gè)氨基酸組成，主要在G2/M期表達(dá)，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的基質(zhì)，參與紡錘體平行微絲及縮復(fù)環(huán)的形成，與細(xì)胞的有絲分裂密切相關(guān)[7-8]。PRC1基因被證實(shí)直接受抑癌基因p53的負(fù)性調(diào)控，在p53缺失的腫瘤細(xì)胞中，PRC1表達(dá)量明顯增加[9]。Kanehira 等[10]在膀胱癌細(xì)胞株內(nèi)發(fā)現(xiàn)PRC1表達(dá)量升高，沉默后可導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞的死亡。Espinosa等[11]發(fā)現(xiàn)PRC1在宮頸癌中高表達(dá)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PRC1不僅可以作為預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生的因子，也是評(píng)估腫瘤預(yù)后及療效的參考指標(biāo)之一。有研究分析448例非小細(xì)胞肺癌化學(xué)治療后基因變化，發(fā)現(xiàn)化學(xué)治療后PRC1表達(dá)下調(diào)，提示PRC1 mRNA表達(dá)水平可預(yù)測(cè)患者預(yù)后[12]。Mustacchi等[13]發(fā)現(xiàn)，PRC1與早期乳腺癌的發(fā)生及患者的預(yù)后相關(guān)，檢測(cè)PRC1有助于治療方案的設(shè)計(jì)。但PRC1在前列腺癌中的表達(dá)情況，筆者尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌中的PRC1在mRNA及蛋白表達(dá)水平均較癌旁前列腺組織明顯升高，出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、Gleason評(píng)分高、臨床分期≥T3A期者的PRC1 mRNA表達(dá)水平高于無(wú)出現(xiàn)生化復(fù)化或轉(zhuǎn)移、Gleason評(píng)分低、臨床分期

綜上所述，PRC1的表達(dá)增高與前列腺癌的惡性程度及生化復(fù)發(fā)密切相關(guān)，與現(xiàn)有的臨床指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用能更有效預(yù)測(cè)前列腺癌的預(yù)后。雖然PRC1的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，但我們的結(jié)果仍然有望為前列腺癌治療提供新的研究方向。

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(本文編輯：林燕薇)

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.07.005

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金(2014A030310066)；廣州市衛(wèi)生局一般引導(dǎo)項(xiàng)目(20141A010013)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800055)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014J4100072)

通訊作者，何慧嬋， E-mail：xiaohejian@21cn.com

(收稿日期：2016-02-25)

Correlation analysis between overexpression of protein regulator of cytokinesis 1 and biochemical recurrence of prostate cancer

HanZhaodong,LuoHongwei,LinZhuoyuan,LiangYingke,ChenGuo,WuYongding,HeHuichan.

DepartmentofUrology,GuangzhouFirstPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180，ChinaCorrespondingauthor,HeHuichan,E-mail:xiaohejian@21cn.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between the expression level of protein regulator of cytokinesis 1 (PRC1) and biochemical recurrence of prostate cancer. MethodsThe expression levels of PRC1 protein and mRNA between the prostate cancer and adjacent benign tissues were statistically compared using Western blot and RT-PCR. The expression of PRC1 mRNA was validated by microarray-based Taylor database. Kaplan-Meier plot was performed to evaluate the overall survival and analyze the correlation between PRC1 expression and biochemical recurrence of prostate cancer. Cox proportional hazards regression model was utilized to assess the correlation between clinicopathological characteristics and biochemical recurrence of prostate cancer. ResultsAmong 12 pairs of prostate cancer and adjacent benign tissues, the expression levels of PRC1 protein and mRNA in the prostate cancer tissues were significantly higher than those in the adjacent benign prostate tissues (both P<0.01). Microarray-based Taylor database revealed that the expression of PRC1 in the cancer tissues was significantly up-regulated compared with that in the non-cancerous tissues (P<0.001). In addition, the expression of PRC1 mRNA in patients with biochemical recurrence or metastasis of prostate cancer, high Gleason score and clinical staging ≥T3A was significantly up-regulated compared with their counterparts with no biochemical recurrence or metastasis of prostate cancer, low Gleason score and clinical staging

【Key words】Protein regulator of cytokinesis 1; Prostate cancer; Biochemical recurrence; Prognosis