張朋，孫錚，劉哲宇，李陽

（大連醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044；2.中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究所，遼寧 大連 116044；3.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 大連 116011）

膠質(zhì)瘤中STAT3通路及其負(fù)調(diào)控因子PIAS3活化狀態(tài)和生物學(xué)效應(yīng)的分析

張朋1，孫錚2，劉哲宇2，李陽3

（大連醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044；2.中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究所，遼寧 大連 116044；3.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 大連 116011）

目的探討STAT3信號通路及其負(fù)調(diào)控因子PIAS3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的活化狀態(tài)及生物學(xué)效應(yīng)。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測膠質(zhì)瘤中p?STAT3及PIAS3的活化狀態(tài)；STAT3通路抑制劑60 μmol/L AG490作用膠質(zhì)瘤U118、U87細(xì)胞24、48 h，MTT法觀察U118、U87細(xì)胞增殖能力的變化；免疫熒光檢測AG490作用前后細(xì)胞p?STAT3及PIAS3蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果p?STAT3及PIAS3在不同級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在細(xì)胞核內(nèi)p?STAT3和PIAS3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；AG490處理細(xì)胞后，U118細(xì)胞數(shù)量無明顯改變，U87細(xì)胞則表現(xiàn)為生長抑制。免疫熒光結(jié)果顯示，AG490處理后，U118細(xì)胞p?STAT3和PIAS3表達(dá)水平均無顯著改變，U87細(xì)胞p?STAT3核內(nèi)表達(dá)下調(diào)，PIAS3出現(xiàn)明顯核易位。結(jié)論P(yáng)IAS3通過核易位調(diào)控STAT3信號通路的活性，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長。

膠質(zhì)瘤；STAT3信號通路；PIAS3；AG490

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膠質(zhì)瘤是神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，即神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞，向成熟方向分化時(shí)受阻所致。研究［1?3］發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤中存在多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常活化，其中STAT信號通路是最重要的1條。STAT家族中以JAK?STAT3信號通路表現(xiàn)最為活躍，這條信號通路主要由3部分組成：酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3。STAT3通常以無活性的單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)其酪氨酸磷酸化后激活，活化的STAT3以二聚體形式進(jìn)入細(xì)胞核與下游靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。STAT3持續(xù)激活常繼發(fā)于異常的上游信號或內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子的缺失，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和異常生長。目前除藥物學(xué)手段抑制STAT3，內(nèi)源性負(fù)調(diào)控因子也成為研究熱點(diǎn)。

PIAS是STAT3的活化抑制蛋白，包含4個(gè)成員PIAS1、PIAS3、PIASx和PIASy。其中PIAS3是最為重要的成員之一。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，PIAS3可與活化的STAT3二聚體結(jié)合，阻斷STAT3與DNA相互作用，抑制STAT3信號通路活性。目前，STAT3已成為惡性膠質(zhì)瘤間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要引發(fā)劑和調(diào)節(jié)點(diǎn)［4?5］，但不同惡性級別膠質(zhì)瘤STAT3及其負(fù)調(diào)控因子PIAS3的表達(dá)和活化特點(diǎn)及其活化程度與腫瘤進(jìn)展的聯(lián)系及相關(guān)性目前尚不清楚。本研究通過觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STAT3信號通路的活化狀態(tài)以及PIAS3的表達(dá)特點(diǎn)，分析各因子在不同惡性程度膠質(zhì)瘤中的表達(dá)規(guī)律及其與腫瘤進(jìn)展的聯(lián)系，分析PIAS3與STAT3核易位的相關(guān)性，并通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，為制定膠質(zhì)瘤關(guān)鍵靶點(diǎn)的治療策略提供分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞：人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤石蠟包埋組織由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供；人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U118、U87細(xì)胞系購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、HEPES緩沖液、胰酶、L?谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素（美國GIBCO公司）；AG490（美國Sigma公司）；兔抗人多克隆PIAS3抗體、兔抗人多克隆p?STAT3抗體（美國Santa Cruz公司）；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（ZF?0311）、羅丹明標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（ZF?0316）（北京中杉金橋公司）；免疫組化試劑盒SP?9000（通用SP kit）（北京中杉生物技術(shù)有限公司，系美國Zymed公司進(jìn)口分裝）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U118、U87用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5%CO2溫育箱。待其貼壁生長至70%～80%融合時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化、傳代。

1.2.2細(xì)胞爬片制備：將U118、U87細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿之前，預(yù)先在皿底鋪數(shù)張已滅菌的蓋玻片（直徑5 mm）。待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，棄培養(yǎng)液，分別加入含60 μmol/L AG490的新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)平行設(shè)置正常培養(yǎng)組作為對照。每12 h于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并用數(shù)碼相機(jī)照相，持續(xù)觀察24 h、48 h。取出蓋玻片，浸入1×PBS（pH7.4）中洗3次，5 min/次，然后用100%冷丙酮-20℃固定20 min，自然風(fēng)干，用于免疫熒光分析。

1.2.3細(xì)胞增殖檢測：將U118、U87細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中（2.0×103/mL），分別設(shè)立對照組和給藥組（60 μmol/L AG490），每組均設(shè)4個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)至24 h、48 h。每孔加MTT（5 mg/mL）20 μL混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加150 μL DMSO，酶標(biāo)儀測吸光度值（D490nm）。計(jì)算相對抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組D值/對照組D值）×100%。

1.2.4免疫熒光測定：取出細(xì)胞爬片，1×PBS （pH7.4）洗3次，用含10%山羊血清的PBS封閉20 min；分別加入不同工作濃度的一抗（p?STAT3 1∶80，PIAS3 1∶100），4℃濕盒中過夜；在暗室避光條件下加入綠色熒光素標(biāo)記山羊抗兔p?STAT3及紅色熒光素標(biāo)記山羊抗兔PIAS3二抗，37℃濕盒中孵育60 min；暗室中，細(xì)胞片用PBS洗3遍，經(jīng)抗熒光淬滅封片液封片后，于熒光顯微鏡下觀察并數(shù)碼成像。圖像處理采用Adobe Photoshop 8.0軟件完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Mann?Whitney分析p?STAT3和PIAS3在不同級別膠質(zhì)瘤組織中胞質(zhì)/胞核的表達(dá)差異，采用Spear?man Rank Correlation分析p?STAT3與PIAS3在膠質(zhì)瘤組織胞質(zhì)與胞核表達(dá)的相關(guān)性，采用Independent Ttest統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析AG490處理前后2組細(xì)胞增殖的改變。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1STAT3及PIAS3在不同級別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況

應(yīng)用所制備的石蠟組織，對人膠質(zhì)瘤組織中p?STAT3和PIAS3蛋白的表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。結(jié)果顯示，比較p?STAT3或PIAS3在Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中的表達(dá)水平，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1、2。

對p?STAT和PIAS3蛋白在人膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)情況的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，人膠質(zhì)瘤組織中胞質(zhì)內(nèi)STAT3和PIAS3的表達(dá)無相關(guān)性，而胞核內(nèi)p?STAT3和PIAS3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（胞質(zhì)內(nèi)：r=0.005，P=0.958；胞核內(nèi)：r= -0.213，P=0.038）。見表3。

2.2AG490對U118、U87細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，60 μmol/LAG490對U118細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用，而U87細(xì)胞的增殖則受到明顯抑制，且受抑制程度呈時(shí)間依賴性，見表4。

2.3免疫熒光檢測AG490對U118、U87細(xì)胞p?STAT3及PIAS3表達(dá)的影響

正常培養(yǎng)條件下，p?STAT3在U118、U87細(xì)胞質(zhì)和胞核中呈陽性表達(dá)。經(jīng)60 μmol/L AG490處理48 h后，U118細(xì)胞質(zhì)和胞核中p?STAT3變化不明顯，U87細(xì)胞核中p?STAT3表達(dá)水平降低（圖1，綠色熒光）。

正常培養(yǎng)條件下，STAT3的抑制因子PIAS3分布于胞質(zhì)和胞核中。經(jīng)60 μmol/L AG490處理后，U118細(xì)胞中PIAS3表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯的變化，而U87細(xì)胞則表現(xiàn)出PIAS3表達(dá)水平增高，并呈現(xiàn)明顯核易位（圖1，紅色熒光）。

表1　p?STAT3在不同級別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)［n（%）］Tab.1　Expression of p?STAT3 in various grades of glioma tissues［n（%）］

表2　PIAS3在不同級別的膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)［n（%）］Tab.2　Expression of p?STAT3 in various grades of glioma tissues［n（%）］

表3　　人膠質(zhì)瘤組織中p?STAT3和PIAS3表達(dá)的相關(guān)性（n）Tab.3　Analysis of the correlation with the status of p?STAT3 and PIAS3 in glioma tissues（n）

3　　討論

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤之一，WHO將其惡性程度由低至高分為Ⅰ～Ⅳ級。膠質(zhì)瘤具有生長迅速、侵襲力強(qiáng)等特點(diǎn)，故手術(shù)難以根除，預(yù)后差。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤發(fā)病中存在多個(gè)信號通路異?；罨?，其中JAK/STAT3信號通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。正常情況下，STAT3活化短暫且可調(diào)節(jié)，但在腫瘤中STAT3持續(xù)活化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖［6-7］。目前，導(dǎo)致STAT3信號通路異?；罨脑蛏形辞宄?。已知的在腦腫瘤中正向調(diào)控STAT3信號通路活化的因子有很多，但特異性差［8?9］。因此，研究STAT3的特異性調(diào)控因子，特別是負(fù)向調(diào)控因子，具有重要的腫瘤治療學(xué)意義。

PIAS3是STAT3的激活蛋白抑制劑，結(jié)合磷酸化STAT3的二聚體，影響磷酸化STAT3在胞核內(nèi)激活下游基因發(fā)揮作用。研究［10?12］證實(shí)，PIAS3不僅能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，也能增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。盡管大部分研究表明腫瘤組織或癌細(xì)胞中PIAS3的表達(dá)顯著降低甚至出現(xiàn)表達(dá)缺失，然而WIBLE等［13］發(fā)現(xiàn)前列腺癌及肝癌等腫瘤組織中PIAS3表達(dá)水平比正常組織高。提示PIAS3在某些腫瘤中的高表達(dá)可能抑制活化的STAT3，與STAT3形成自調(diào)節(jié)反饋環(huán)，即STAT3在活化的同時(shí)也誘導(dǎo)了其自身的抑制劑PIAS3的高表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤的惡性程度與p?STAT3和PIAS3在胞質(zhì)/胞核的分布水平間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤細(xì)胞核中，PIAS3與p?STAT3蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，而胞質(zhì)中二者無相關(guān)性。提示PIAS3是否發(fā)生核易位是其發(fā)揮對STAT3抑制作用的關(guān)鍵。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，本研究以膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U118和U87細(xì)胞作為研究模型，采用60 μmol/L AG490（STAT3信號通路抑制劑）分別處理24 h和48 h，MTT檢測藥物處理前后細(xì)胞增殖情況。結(jié)果表明，AG490作用后，U118細(xì)胞數(shù)量變化不明顯；而相同處理?xiàng)l件下U87細(xì)胞則表現(xiàn)為明顯的生長抑制。進(jìn)一步的免疫熒光檢測結(jié)果顯示，AG490作用后，U118細(xì)胞中p?STAT3和PIAS3表達(dá)水平均無顯著改變，U87細(xì)胞則表現(xiàn)出p?STAT3核內(nèi)表達(dá)下調(diào)，PIAS3表現(xiàn)出明顯核易位。因此，推測PIAS3通過核易位調(diào)控STAT3的活性，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長。

除了PIAS3以外，目前發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路的負(fù)向調(diào)控因子還包括細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子和蛋白酪氨酸磷酸酶，上述蛋白在不同環(huán)節(jié)特異性抑制STAT3信號通路，并與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化存在密切聯(lián)系［14?15］。針對這些蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特點(diǎn)、生物學(xué)功效及腫瘤治療學(xué)價(jià)值有待于進(jìn)一步探究。

表4AG490對U118和U87細(xì)胞增殖的影響Tab.4　Effect of AG490 on cell proliferation in U118 and U87 cells

圖1　免疫熒光檢測AG490處理前后U118和U87細(xì)胞中p?STAT3和PIAS3的表達(dá)情況Fig.1　The expression of p?STAT3 and PIAS3 in U118 and U87 cells before and after AG490 treatment by immunofluo?rescence

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（編輯王又冬）

Activation Status and Biological Effects Analysis of STAT3 Signaling Pathway and
Its Negative Regulator PIAS3 in Gliomas

ZHANG Peng1，SUN Zheng2，LIU Zheyu2，LI Yang3
（1.Department of Biology，College of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian 116044，China；2.Institute of Integrative Medicine，Dalian Medical University，Dalian 116044，China；3.The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo discuss the activation and biological effects of STAT3 signaling pathway and its negative regulator PIAS3 in glioma cells.MethodsImmunohistochemistry（IHC）was used to test the expression of p?STAT3 and PIAS3 in gliomas.AG490（60 μmol/L），the in?hibitor of STAT3 signaling pathway，was used to treat U118 and U87 cells for 24/48 h，and the method of MTT assay was taken to evaluate the pro?liferation after AG490 treatment.The expression of p?STAT3 and PIAS3 was also examined by immunofluorescence（IF）.ResultsThere was no obvious significance between p?STAT3 and PIAS3 in nuclei or cytoplasm at different grades of gliomas.Whereas，p?STAT3 and PIAS3 were nega?tively correlated in the nuclei of vary grades malignancy gliomas.After AG490 treatment，U118 cells showed no obvious quantitative changes.How?ever，U87 cells showed obvious growth inhibition.IF results showed that there was no significant change at the levels of p?STAT3 and PIAS3 after AG490 treatment in U118 cells.However，the expression of p?STAT3 in the nuclei was down?regulated，and PIAS3 showed obvious nuclear translo?cation in U87 cells.ConclusionNuclear translocation of PIAS3 plays the key role in modulating JAK/STAT signaling activation and inhibiting glioma cells proliferation.

glioma；STAT3 signaling pathway；PIAS3；AG490

R739.4

A

0258-4646（2016）08-0719-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.012

中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2013M541232）

張朋（1979-），女，講師，博士研究生.

孫錚，E-mail：sunclank@163.com

2016-03-09
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：