張雅娟，吳敏范，吳孟霏，楊宇，商麗宏，王兵，潘建

（1.沈陽市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110023；2.沈陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽 110034；3.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院2014級藥學(xué)專業(yè)，沈陽 110163）

NK?1受體在截?cái)辔材┒诵∈罂蹘Щ厍安可窠?jīng)元Fos蛋白表達(dá)中的作用

張雅娟1，吳敏范2，吳孟霏3，楊宇2，商麗宏2，王兵1，潘建1

（1.沈陽市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110023；2.沈陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽 110034；3.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院2014級藥學(xué)專業(yè)，沈陽 110163）

目的研究截?cái)辔材┒四芊褚鹦∈罂蹘Щ厍安浚ˋCC）神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的改變，以及NK?1受體在該變化中的作用。方法用免疫組化技術(shù)研究截?cái)嘈∈笪材┒?.5 cm后0.25 h、0.5 h、1 h和2 h ACC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的變化，以及GR82334 NK?1受體拮抗劑尾靜脈、蛛網(wǎng)膜下腔注射對該變化的影響。結(jié)果截?cái)嘈∈笪材┒撕?.25 h和0.5 h ACC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)顯著增加，1 h達(dá)高峰，2 h后開始消退；GR82334尾靜脈注射完全拮抗了截?cái)嘈∈笪材┒艘鸬腁CC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的顯著增加，但GR82334蛛網(wǎng)膜下腔注射拮抗作用不完全。結(jié)論截?cái)嘈∈笪材┒四軌蛞餉CC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性顯著增加；外周與中樞NK?1受體參與此過程，但是，尚存其他受體和遞質(zhì)參與的中樞傳導(dǎo)通路引起ACC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的顯著增加。

扣帶回前部；幻肢痛；Fos蛋白；免疫組化；NK?1受體

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60%～80%的截肢患者術(shù)后伴有幻肢痛（phan?tom limb pain，PLP）［1?2］。有研究［3?4］報(bào)道，扣帶回前部（anterior cingulate cortex，ACC）是重要的痛覺中樞，PLP患者的ACC神經(jīng)元活動(dòng)發(fā)生明顯改變［5］，截肢大鼠ACC對外周刺激及中樞刺激反應(yīng)增強(qiáng)［6］，截?cái)嘈∈笪材┒顺Ｓ糜谘芯縋LP產(chǎn)生的中樞機(jī)制［7］。目前，PLP發(fā)病機(jī)理仍不清楚。研究［8-9］表明，即刻早基因（c?fos）及Fos蛋白的表達(dá)標(biāo)志著傷害性感受神經(jīng)元興奮，速激肽NK?1受體參與傷害性電刺激大鼠隱神經(jīng)引起的ACC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)顯著增高的過程。但是，截?cái)嘈∈笪材┒四芊褚餉CC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的改變及速激肽NK?1受體是否參與該過程尚未見報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)對此進(jìn)行探討，以期闡明速激肽NK?1受體在傷害性信息傳遞和調(diào)制中的作用，深入研究PLP的產(chǎn)生機(jī)理，為臨床治療PLP提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

昆明種成年小鼠54只，雌性，體質(zhì)量（27±6）g，沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK遼2010?0001）。將小鼠行1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg·kg-1），隨機(jī)將小鼠均分為9組：空白對照組；用剪刀截?cái)嘈∈笪材┒?.5 cm后0.25 h、0.5 h、1 h、2 h實(shí)驗(yàn)組（即斷尾后0.25 h組、0.5 h組、1 h組、2 h組）；1%GR82334尾靜脈注射（1 mg·kg-1）后10 min，截?cái)嘈∈笪材┒?.5 cm后0.5 h實(shí)驗(yàn)組（即GR82334 iv組）；與GR82334 iv組同體積生理鹽水尾靜脈注射后10 min，截?cái)嘈∈笪材┒?.5 cm后0.5 h對照組（即NS iv組）；GR82334蛛網(wǎng)膜下腔注射（10 μg·10 μL-1）后10 min，截?cái)嘈∈笪材┒?.5 cm后0.5 h實(shí)驗(yàn)組（即GR82334 ith組）；與GR82334 ith組同體積生理鹽水蛛網(wǎng)膜下腔注射后10 min，截?cái)嘈∈笪材┒?.5 cm后0.5 h對照組（即NS ith組）。

1.2小鼠ACC Fos蛋白表達(dá)檢測

將上述各組小鼠迅速斷頭，在冰臺(tái)上取腦，置入4℃，4%多聚甲醛中過夜固定。連續(xù)冠狀-20℃冰凍切片的厚度為15 μm，用免疫組化方法常規(guī)染片及洗片等，最后用樹膠封片。使用顯微圖像分析儀（×400）檢測切片ACC的陽性細(xì)胞積分光密度和面積百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　　結(jié)果

2.1截?cái)辔材┒撕蟛煌瑫r(shí)間小鼠ACC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)

與空白對照組比較，截?cái)辔材┒撕?.25 h，ACC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；截?cái)辔材┒撕?.5 h，ACC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加（P＜0.01）；截?cái)辔材┒撕? h，ACC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)達(dá)到高峰（P＜0.01）；截?cái)辔材┒撕? h，ACC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)開始消退，但是，仍然高于空白對照組（P＜0.05，圖1）。該結(jié)果提示，截?cái)嘈∈笪材┒四軌蛞餉CC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性顯著增加。

圖1　截?cái)辔材┒撕蟛煌瑫r(shí)間小鼠ACC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)Fig.1　Fos protein expression in mice ACC neurons at various time after amputation of the tail extremity

2.2蛛網(wǎng)膜下腔注射GR82334對截?cái)辔材┒嗽黾有∈驛CC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，截?cái)辔材┒撕?.5 h ACC Fos蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，F(xiàn)os蛋白表達(dá)積分光密度和陽性細(xì)胞面積百分比顯著增高（P＜0.01）；NK?1受體拮抗劑GR82334蛛網(wǎng)膜下腔注射10 min后再截?cái)辔材┒?.5 h后，ACC Fos蛋白表達(dá)也顯著增強(qiáng)（P＜0.05），但是，ACC Fos蛋白表達(dá)增強(qiáng)的幅度明顯低于單純截?cái)辔材┒?.5 h后ACC Fos蛋白表達(dá)增強(qiáng)的幅度（P＜0.05），也低于蛛網(wǎng)膜下腔注射同體積生理鹽水10 min再截?cái)辔材┒撕?.5 h引起的ACC Fos蛋白表達(dá)增強(qiáng)的幅度（P＜0.05），見圖2。

圖2　蛛網(wǎng)膜下腔注射GR82334對截?cái)辔材┒嗽黾覣CC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)的影響Fig.2　Effect of GR82334 intrathecal injection on increase in Fos protein expression in mice ACC neurons induced by amputation of the tail extremity

2.3尾靜脈注射GR82334對截?cái)辔材┒诵∈驛CC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比較，截?cái)辔材┒撕?.5 h ACC Fos蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，F(xiàn)os蛋白表達(dá)積分光密度和陽性細(xì)胞面積百分比顯著增高（P＜0.01）；NK?1受體拮抗劑GR82334尾靜脈注射10 min再截?cái)辔材┒撕?.5 h，ACC Fos蛋白表達(dá)輕度增強(qiáng)，但是，F(xiàn)os蛋白表達(dá)積分光密度和陽性細(xì)胞面積百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。而同體積的生理鹽水尾靜脈注射10 min后再截?cái)辔材┒撕?.5 h引起ACC Fos蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，F(xiàn)os蛋白表達(dá)積分光密度和陽性細(xì)胞面積百分比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見圖3。

圖3　尾靜脈注射GR82334對截?cái)辔材┒嗽黾覣CC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)的影響Fig.3　Effect of GR82334 caudal veins injection on increase in Fos protein expression in mice ACC neurons induced by amputation of the tail extremity

3　　討論

有研究［8］報(bào)道，F(xiàn)os蛋白表達(dá)可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)對刺激產(chǎn)生反應(yīng)的疼痛標(biāo)志物，標(biāo)志著傷害性感受神經(jīng)元興奮，表達(dá)Fos蛋白的部位常是與傷害性傳入信息傳遞、整合等有關(guān)的區(qū)域；截肢大鼠ACC神經(jīng)元活動(dòng)發(fā)生明顯改變［6］。但是，截?cái)嘈∈笪材┒四芊褚餉CC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的改變尚未見報(bào)道。本研究觀察到在空白對照組ACC神經(jīng)元有少量的Fos蛋白表達(dá)；截?cái)嘈∈笪材┒撕?.25 h、0.5 h ACC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)顯著增加，1 h達(dá)高峰，2 h后開始消退。因此認(rèn)為在正常情況下ACC神經(jīng)元存有Fos蛋白較低水平的表達(dá)；ACC神經(jīng)元能夠感受小鼠斷尾傳入的傷害性信息，引起Fos蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性顯著增加，ACC神經(jīng)元參與斷尾后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性變化。本研究結(jié)果為深入研究PLP提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

PLP是截肢后常見并發(fā)癥之一。目前，關(guān)于PLP產(chǎn)生的原因仍不清楚，尚無理想的治療方法。速激肽NK?1受體與痛覺過敏等有關(guān)［10?11］。但是，截?cái)辔材┒嗽黾覣CC神經(jīng)元的Fos蛋白表達(dá)過程是否有NK?1受體參與尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NK?1受體拮抗劑GR82334尾靜脈注射能夠拮抗截?cái)辔材┒艘鸬腁CC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)顯著增加，提示外周NK?1受體參與了截?cái)辔材┒艘鸬腁CC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的顯著增加過程。由于GR82334不容易通過血腦屏障，因此進(jìn)一步研究了GR82334蛛網(wǎng)膜下腔注射對截?cái)辔材┒苏T導(dǎo)ACC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)增加的影響。研究結(jié)果顯示，截?cái)辔材┒苏T導(dǎo)ACC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)增加可被GR82334蛛網(wǎng)膜下腔注射拮抗，提示中樞NK?1受體也參與截?cái)辔材┒艘鸬腁CC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的顯著增加過程。但是，GR82334蛛網(wǎng)膜下腔注射沒有完全阻斷Fos蛋白表達(dá)的顯著增加，提示可能尚存其他受體和遞質(zhì)參與中樞傳導(dǎo)通路引起ACC神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)的顯著增加。斷尾后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性變化非常復(fù)雜，NK?1受體可能為治療PLP的潛在靶點(diǎn)之一。

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（編輯于溪）

Role of NK?1 Receptor in Fos Protein Expression of Anterior Cingulate Cortex Neurons of Mice Induced by Amputation of the Tail Extremity

ZHANG Yajuan1，WU Minfan2，WU Mengfei3，YANG Yu2，SHANG Lihong2，WANG Bing1，PAN Jian1
（1.Department of Neurology，The Fifth People′s Hospital of Shenyang City，Shenyang 110023，China；2.Department of Physiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；3.Majoring in Pharmacy，Grade 2014，He University，Shenyang 110163，China）

ObjectiveTo study whether amputation of the tail extremity could induce change of Fos protein expression in mice ACC neurons，and explore the role of NK?1 receptor in the change.MethodsImmunohistochemistry technique was adopted to study Fos protein expression change in mice ACC neurons at 0.25 h，0.5 h，1 h，2 h after amputation of the tail extremity 2.5 cm，and also the effect of NK?1 receptor antagonist GR82334（iv）or GR82334（ith）in the change.ResultsFos protein expression in mice ACC neurons was significantly increased at 0.25 h，0.5 h after the amputation，and reached its peak at 1 h after the amputation，then started to decrease at 2 h after the amputation.GR82334（iv）com?pletely antagonized the significant augment in Fos protein expression in mice ACC neurons after the amputation，but the antagonism of GR82334 （ith）was incomplete.ConclusionAmputation of the tail extremity could significantly increase the Fos protein expression of mice ACC neurons in a time?dependent manner.Both peripheral and central NK?1 receptors were involved in the process.However，there are also central conduction pathways of other receptors and neurotransmitters involved in the significant augment in Fos protein expression in mice ACC neurons after amputa?tion.

anterior cingulate cortex；phantom limb pain；Fos protein；immunohistochemistry；NK?1 receptor

R338；Q432

A

0258-4646（2016）08-0700-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.007

遼寧省自然科學(xué)基金（L2015020391）；沈陽市科技攻關(guān)項(xiàng)目（F13?220?9?45）

張雅娟（1969-），女，主任醫(yī)師，碩士.

吳敏范，E-mail：minfanwu0594@sina.com.cn

2015-11-21
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：